Ана-телофазный метод анализа хромосомных аберраций

Поделись знанием:
(перенаправлено с «Ана-телофазный анализ»)
Перейти к: навигация, поиск

Ана-телофазный анализ — генетический тест, основанный на визуальном учёте хромосомных аберраций (повреждения хромосом) на стадии анафазы и телофазы митотического цикла клетки. Ана- телофазный анализ — простой, экономичный метод, который не требует знания кариотипа и идентификации хромосом. Он позволяет выявить лишь определенные типы хромосомных аберраций, но его чувствительность вполне достаточна для заключения «мутагенен» или «не мутагенен» фактор. Ана- телофазный анализ является достаточно чувствительным, корректным и удобным на первом этапе экотоксикогенетического исследования[1].





История

Выбросы генотоксикантов в окружающую среду в результате антропогенной активности людей порождают необходимость в подходящих генетических тестах, чтобы оценить потенциальное воздействие данных факторов на экосистемы. Ана- телофазный анализ был описан как экспрессный и экономичный генетический тест. Среди наиболее ранних исследований, в которых данный анализ был применен, следует отметить эксперименты на луке (A. Levan). До настоящего времени применяется как основной метод генетического анализа для растительной тест-системы Allium test, в которой исследуется влияние различных генотоксикантов на клетки корневых меристем[2][3][4].

Чувствительность и применимость

Ана-телофазный анализ высокочувствителен при тестах самой разной направленности. Будь то пробы субстратов из окружающей среды (вода, почва, донные отложения) или же вещества антропогенного происхождения, а также излучения различного спектра (как ионизирующие, так и неионизирующие). Кроме того достоинством данного анализа является его универсальность (он применим практически во всех случаях, когда идёт митоз) и простота в приготовлении препаратов, что очень важно при работе с клетками животных[5]. Ана-телофазный анализ хромосомных аберраций на клетках лука (Allium cepa), рекомендован как инструмент цитомониторинга окружающей среды. Путём измерения генотоксичности, он способствует оценке степени экологического риска от средств бытового и промышленного назначения, постоянно внедряемых и становящихся все более важными в повседневной жизни[2][6].

Техника проведения анализа

Включает анализ под микроскопом препарата клеток, зафиксированных и окрашенных на стадии пролиферации. Существует ряд вариаций ана- телофазного анализа. Так, согласно оригинальному варианту анализа, описанному Fiskesjo (1985 г.) на препарате подсчитываются первые 100 анафазных и телофазных клеток, из которых отмечаются аберрантные. Позднее стал применяться иной вариант И. М. Прохорова и соавт. (2003), который учитывает все анафазы и телофазы на препарате, среди которых отмечаются аберрантные. Пригодными для учёта хромосомных аберраций являются не очень ранние анафазы и ранние телофазы. Поскольку делящаяся клетка не всегда распластывается на препарате по продольной оси деления, то при отборе клеток, пригодных для подсчета хромосомных аберраций, надо принимать во внимание расстояние между дочерними ядрами — оно должно быть не меньше размера одного из них[1][2][6].

Типы анализируемых аберраций

На стадии анафазы и телофазы подсчитываются две классические для данного анализа категории аберраций, представляющие собой отставший от полюсов хромосомный материал (ацентрические фрагменты и кольца, отставшие хромосомы) и мосты. Все они достаточно хорошо видны визуально и различимы. Очень часто в отдельную категорию включаются и подсчитываются отставания и забегания, указывающие на изменения ахроматинового веретена деления.

  1. Ацентрические фрагменты и кольца могут быть одиночными и парными. Они располагаются между дочерними звёздами или в стороне от них. Основная задача сводится к распознаванию одиночности или парности и к отличию их от отставших хромосом. Одиночные фрагменты представляют собой фрагменты хроматидного происхождения. Потеря одного фрагмента из пары (хромосомного происхождения) — явление, очевидно, редкое, поскольку притяжение между сестринскими хроматидами сохраняется и на стадии анафазы. По этой же причине маловероятно предположение, что одиночный фрагмент может происходить за счет слияния сестринских хроматид парного фрагмента и развёртывания их по длине.
  2. Парные фрагменты — это фрагменты изохроматидного или хромосомного происхождения. О соединении повреждённых концов сестринских хроматид, а не об отставшей хромосоме можно говорить только при условии, если парный фрагмент имеет дугообразный вид. Следует отметить, что оценка этого признака крайне затруднительна и поэтому не может проводиться во всех случаях.
  3. Мосты иногда разделяют на хромосомные и хроматидные. Под хромосомным мостом понимают дицентричческую хромосому: он состоит из двух хроматид, чаще всего перекрещённых. Хроматидный мост — дицентрическая хроматида, поэтому он виден как одиночный. По «толщине» моста нельзя судить о его хромосомном или хроматидном характере. Не всегда можно дифференцировать зарактер моста и поэтому вряд ли целесообразно проводить такое разделение при использовании тотального метода окрашивания хромосом, не позволяющего идентифицировать отдельные хроматиды.
  4. Отставшие хромосомы или хроматиды чаще всего распознаются легко, так как в них можно видеть центромеру либо неоднородность структуры, что нехарактерно для фрагментов. Наибольшие трудности возникают при необходимости отличить отставшую метацентрическую хроматиду от акроцентрической хромосомы. Вместе с тем ответ на этот вопрос важен, потому что в результате отставания хромосомы образуются две гипоплоидные клетки, а в результате отставания хроматиды одна гипоплоидная и одна нормальная клетка.

Абсолютного стандарта для учёта аберраций и для представления полученных результатов быть не может. На практике встречаются сочетания разных типов аберраций в одной и той же клетке. Теоретически можно ожидать любые сочетания аберраций. Основой этого является асинхронность редупликации наследственного материала. Кроме того попутно другие, реже встречающиеся типы аберраций, такие как мультиполярные митозы и полиплоидии, так же могут регистрироваться[6].

Расчет частоты мутаций

Обозначение Характеристика Расчёт
ХА+отс.
ХА+отс., % — частота хромосомных аберраций и отставаний
Частота хромосомных аберраций и отставаний — рассчитывается как отношение суммы ана- и телофазных клеток, в которых были зарегистрированы нарушения, к общему числу проанализированных ана-телефаз.
<math>\mbox{XA+otc.}=\frac\mbox{(XA+otc.)}\mbox{N(A+T)}*100%</math>


, где XA+отс. — сумма аберрантных клеток, находящихся на стадии ана- и телофазы, а N(А+Т) — общее число проанализированных анафаз и телофаз на препарате.

Преобразование

Частота хромосомных аберраций и отставаний может быть представлена в виде выраженности мутагенного эффекта, согласно системе интегральной оценки мутагенного эффекта.

Рекомендации по проведению ана- телофазного анализа

Для большинства исследований можно рекомендовать следующее:

  1. Важным условием при оценке типов (спектра и частоты хромосомных аберраций) является проведение их учёта в первом после действия мутагена клеточном делении. Это связано с тем, что значительная часть аберраций и аберрантных клеток элиминируется уже после первого деления или приобретает другой вид, хотя некоторые хромосомные аберрации, которые наблюдаются в виде мостов, могут сохраняться в течение 12—15 митотических циклов.
  2. Не проводить анализ перестроек при наложении клеток и при нарушении целостности их оболочки.
  3. Принимать во внимание все типы морфологических изменений, учёт которых возможен при данной методике.
  4. Анализировать изменения поклеточно, то есть регистрировать в протоколе опытов сочетаемость аберраций, встречающихся в каждой клетке.
  5. Клетки, в которых не удается определить тип аберраций, нужно относить к классу клеток с неразобранными аберрациями; их подсчитывать только в подсчёте общего количества аберрантных клеток.
  6. Быть крайне осторожным при объединениях любого рода (например, данных по отдельным повторностям и данных аналогичных опытов, по точечным фрагментам и кольцам, по дицентрикам и сопутствующим ацентрикам и т. д.). Если правомочность какого-то объединения доказана для некоторого объекта или условий, то для других объектов и условий она должна специально проверяться.
  7. При представлении данных в статье необходимо указывать число обследованных особей (или повторностей опыта), число проанализированных клеток, число каждого из учитываемых типов аберраций, типы аберрантных клеток и их частоту, число анеуплоидных клеток.

Для точного определения необходимо знать структуру кариотипа изучаемого вида растений или животных в норме[6].

Методы и объекты на основе данного метода

См. также

Напишите отзыв о статье "Ана-телофазный метод анализа хромосомных аберраций"

Примечания

  1. 1 2 Прохорова И. М., Фомичёва П. Н., Ковалёва М. И. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды // ЯрГУ : Методические указания. — Ярославль: ЯрГУ, 2003. — С. 23,26.
  2. 1 2 3 Jette Rank The method of Allium anaphase–telophase chromosome aberration assay // Ekologija. — Vilnius, 2003. — Т. 1. — С. 38-42.
  3. Levan Albert THE EFFECT OF COLCHICINE ON ROOT MITOSES IN ALLIUM // Hereditas. — 1938. — Т. 24, вып. 4. — С. 471-486.
  4. Fiskesjо G. The Allium Test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. — 1985. — Т. 102. — С. 99-112.
  5. W. Venegas, C. Lasne, R. Lowy, J.-P. Buisson and I. Chouroulinkov Naphthofurans induced chromosomal aberrations detected in metaphase, anaphase and telophase V79 Chinese hamster cells // Mutation Research/Genetic Toxicology. — Elsevier B.V., 1985. — С. 53-62.
  6. 1 2 3 4 Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический мониторинг: методы оценки загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма. — ВГУ, 2004. — 80 с.

Ошибка в сносках?: Тег <ref> с именем «Pesnya», определённый в <references>, не используется в предшествующем тексте.

Отрывок, характеризующий Ана-телофазный метод анализа хромосомных аберраций

Прочтя до этого места, княжна Марья вздохнула и оглянулась в трюмо, которое стояло направо от нее. Зеркало отразило некрасивое слабое тело и худое лицо. Глаза, всегда грустные, теперь особенно безнадежно смотрели на себя в зеркало. «Она мне льстит», подумала княжна, отвернулась и продолжала читать. Жюли, однако, не льстила своему другу: действительно, и глаза княжны, большие, глубокие и лучистые (как будто лучи теплого света иногда снопами выходили из них), были так хороши, что очень часто, несмотря на некрасивость всего лица, глаза эти делались привлекательнее красоты. Но княжна никогда не видала хорошего выражения своих глаз, того выражения, которое они принимали в те минуты, когда она не думала о себе. Как и у всех людей, лицо ее принимало натянуто неестественное, дурное выражение, как скоро она смотрелась в зеркало. Она продолжала читать: 211
«Tout Moscou ne parle que guerre. L'un de mes deux freres est deja a l'etranger, l'autre est avec la garde, qui se met en Marieche vers la frontiere. Notre cher еmpereur a quitte Petersbourg et, a ce qu'on pretend, compte lui meme exposer sa precieuse existence aux chances de la guerre. Du veuille que le monstre corsicain, qui detruit le repos de l'Europe, soit terrasse par l'ange que le Tout Рuissant, dans Sa misericorde, nous a donnee pour souverain. Sans parler de mes freres, cette guerre m'a privee d'une relation des plus cheres a mon coeur. Je parle du jeune Nicolas Rostoff, qui avec son enthousiasme n'a pu supporter l'inaction et a quitte l'universite pour aller s'enroler dans l'armee. Eh bien, chere Marieie, je vous avouerai, que, malgre son extreme jeunesse, son depart pour l'armee a ete un grand chagrin pour moi. Le jeune homme, dont je vous parlais cet ete, a tant de noblesse, de veritable jeunesse qu'on rencontre si rarement dans le siecle оu nous vivons parmi nos villards de vingt ans. Il a surtout tant de franchise et de coeur. Il est tellement pur et poetique, que mes relations avec lui, quelque passageres qu'elles fussent, ont ete l'une des plus douees jouissances de mon pauvre coeur, qui a deja tant souffert. Je vous raconterai un jour nos adieux et tout ce qui s'est dit en partant. Tout cela est encore trop frais. Ah! chere amie, vous etes heureuse de ne pas connaitre ces jouissances et ces peines si poignantes. Vous etes heureuse, puisque les derienieres sont ordinairement les plus fortes! Je sais fort bien, que le comte Nicolas est trop jeune pour pouvoir jamais devenir pour moi quelque chose de plus qu'un ami, mais cette douee amitie, ces relations si poetiques et si pures ont ete un besoin pour mon coeur. Mais n'en parlons plus. La grande nouvelle du jour qui occupe tout Moscou est la mort du vieux comte Безухой et son heritage. Figurez vous que les trois princesses n'ont recu que tres peu de chose, le prince Basile rien, est que c'est M. Pierre qui a tout herite, et qui par dessus le Marieche a ete reconnu pour fils legitime, par consequent comte Безухой est possesseur de la plus belle fortune de la Russie. On pretend que le prince Basile a joue un tres vilain role dans toute cette histoire et qu'il est reparti tout penaud pour Petersbourg.
«Je vous avoue, que je comprends tres peu toutes ces affaires de legs et de testament; ce que je sais, c'est que depuis que le jeune homme que nous connaissions tous sous le nom de M. Pierre les tout court est devenu comte Безухой et possesseur de l'une des plus grandes fortunes de la Russie, je m'amuse fort a observer les changements de ton et des manieres des mamans accablees de filles a Marieier et des demoiselles elles memes a l'egard de cet individu, qui, par parenthese, m'a paru toujours etre un pauvre, sire. Comme on s'amuse depuis deux ans a me donner des promis que je ne connais pas le plus souvent, la chronique matrimoniale de Moscou me fait comtesse Безухой. Mais vous sentez bien que je ne me souc nullement de le devenir. A propos de Marieiage, savez vous que tout derienierement la tante en general Анна Михайловна, m'a confie sous le sceau du plus grand secret un projet de Marieiage pour vous. Ce n'est ni plus, ni moins, que le fils du prince Basile, Anatole, qu'on voudrait ranger en le Marieiant a une personne riche et distinguee, et c'est sur vous qu'est tombe le choix des parents. Je ne sais comment vous envisagerez la chose, mais j'ai cru de mon devoir de vous en avertir. On le dit tres beau et tres mauvais sujet; c'est tout ce que j'ai pu savoir sur son compte.
«Mais assez de bavardage comme cela. Je finis mon second feuillet, et maman me fait chercher pour aller diner chez les Apraksines. Lisez le livre mystique que je vous envoie et qui fait fureur chez nous. Quoiqu'il y ait des choses dans ce livre difficiles a atteindre avec la faible conception humaine, c'est un livre admirable dont la lecture calme et eleve l'ame. Adieu. Mes respects a monsieur votre pere et mes compliments a m elle Bourienne. Je vous embrasse comme je vous aime. Julie».
«P.S.Donnez moi des nouvelles de votre frere et de sa charmante petite femme».
[Вся Москва только и говорит что о войне. Один из моих двух братьев уже за границей, другой с гвардией, которая выступает в поход к границе. Наш милый государь оставляет Петербург и, как предполагают, намерен сам подвергнуть свое драгоценное существование случайностям войны. Дай Бог, чтобы корсиканское чудовище, которое возмущает спокойствие Европы, было низвергнуто ангелом, которого Всемогущий в Своей благости поставил над нами повелителем. Не говоря уже о моих братьях, эта война лишила меня одного из отношений самых близких моему сердцу. Я говорю о молодом Николае Ростове; который, при своем энтузиазме, не мог переносить бездействия и оставил университет, чтобы поступить в армию. Признаюсь вам, милая Мари, что, несмотря на его чрезвычайную молодость, отъезд его в армию был для меня большим горем. В молодом человеке, о котором я говорила вам прошлым летом, столько благородства, истинной молодости, которую встречаешь так редко в наш век между двадцатилетними стариками! У него особенно так много откровенности и сердца. Он так чист и полон поэзии, что мои отношения к нему, при всей мимолетности своей, были одною из самых сладостных отрад моего бедного сердца, которое уже так много страдало. Я вам расскажу когда нибудь наше прощанье и всё, что говорилось при прощании. Всё это еще слишком свежо… Ах! милый друг, вы счастливы, что не знаете этих жгучих наслаждений, этих жгучих горестей. Вы счастливы, потому что последние обыкновенно сильнее первых. Я очень хорошо знаю, что граф Николай слишком молод для того, чтобы сделаться для меня чем нибудь кроме как другом. Но эта сладкая дружба, эти столь поэтические и столь чистые отношения были потребностью моего сердца. Но довольно об этом.
«Главная новость, занимающая всю Москву, – смерть старого графа Безухого и его наследство. Представьте себе, три княжны получили какую то малость, князь Василий ничего, а Пьер – наследник всего и, сверх того, признан законным сыном и потому графом Безухим и владельцем самого огромного состояния в России. Говорят, что князь Василий играл очень гадкую роль во всей этой истории, и что он уехал в Петербург очень сконфуженный. Признаюсь вам, я очень плохо понимаю все эти дела по духовным завещаниям; знаю только, что с тех пор как молодой человек, которого мы все знали под именем просто Пьера, сделался графом Безухим и владельцем одного из лучших состояний России, – я забавляюсь наблюдениями над переменой тона маменек, у которых есть дочери невесты, и самих барышень в отношении к этому господину, который (в скобках будь сказано) всегда казался мне очень ничтожным. Так как уже два года все забавляются тем, чтобы приискивать мне женихов, которых я большею частью не знаю, то брачная хроника Москвы делает меня графинею Безуховой. Но вы понимаете, что я нисколько этого не желаю. Кстати о браках. Знаете ли вы, что недавно всеобщая тетушка Анна Михайловна доверила мне, под величайшим секретом, замысел устроить ваше супружество. Это ни более ни менее как сын князя Василья, Анатоль, которого хотят пристроить, женив его на богатой и знатной девице, и на вас пал выбор родителей. Я не знаю, как вы посмотрите на это дело, но я сочла своим долгом предуведомить вас. Он, говорят, очень хорош и большой повеса. Вот всё, что я могла узнать о нем.
Но будет болтать. Кончаю мой второй листок, а маменька прислала за мной, чтобы ехать обедать к Апраксиным.
Прочитайте мистическую книгу, которую я вам посылаю; она имеет у нас огромный успех. Хотя в ней есть вещи, которые трудно понять слабому уму человеческому, но это превосходная книга; чтение ее успокоивает и возвышает душу. Прощайте. Мое почтение вашему батюшке и мои приветствия m lle Бурьен. Обнимаю вас от всего сердца. Юлия.
PS. Известите меня о вашем брате и о его прелестной жене.]
Княжна подумала, задумчиво улыбаясь (при чем лицо ее, освещенное ее лучистыми глазами, совершенно преобразилось), и, вдруг поднявшись, тяжело ступая, перешла к столу. Она достала бумагу, и рука ее быстро начала ходить по ней. Так писала она в ответ:
«Chere et excellente ami. Votre lettre du 13 m'a cause une grande joie. Vous m'aimez donc toujours, ma poetique Julie.
L'absence, dont vous dites tant de mal, n'a donc pas eu son influenсе habituelle sur vous. Vous vous plaignez de l'absence – que devrai je dire moi, si j'osais me plaindre, privee de tous ceux qui me sont chers? Ah l si nous n'avions pas la religion pour nous consoler, la vie serait bien triste. Pourquoi me supposez vous un regard severe, quand vous me parlez de votre affection pour le jeune homme? Sous ce rapport je ne suis rigide que pour moi. Je comprends ces sentiments chez les autres et si je ne puis approuver ne les ayant jamais ressentis, je ne les condamiene pas. Me parait seulement que l'amour chretien, l'amour du prochain, l'amour pour ses ennemis est plus meritoire, plus doux et plus beau, que ne le sont les sentiments que peuvent inspire les beaux yeux d'un jeune homme a une jeune fille poetique et aimante comme vous.
«La nouvelle de la mort du comte Безухой nous est parvenue avant votre lettre, et mon pere en a ete tres affecte. Il dit que c'etait avant derienier representant du grand siecle, et qu'a present c'est son tour; mais qu'il fera son possible pour que son tour vienne le plus tard possible. Que Dieu nous garde de ce terrible malheur! Je ne puis partager votre opinion sur Pierre que j'ai connu enfant. Il me paraissait toujours avoir un coeur excellent, et c'est la qualite que j'estime le plus dans les gens. Quant a son heritage et au role qu'y a joue le prince Basile, c'est bien triste pour tous les deux. Ah! chere amie, la parole de notre divin Sauveur qu'il est plus aise a un hameau de passer par le trou d'une aiguille, qu'il ne l'est a un riche d'entrer dans le royaume de Dieu, cette parole est terriblement vraie; je plains le prince Basile et je regrette encore davantage Pierre. Si jeune et accable de cette richesse, que de tentations n'aura t il pas a subir! Si on me demandait ce que je desirerais le plus au monde, ce serait d'etre plus pauvre que le plus pauvre des mendiants. Mille graces, chere amie, pour l'ouvrage que vous m'envoyez, et qui fait si grande fureur chez vous. Cependant, puisque vous me dites qu'au milieu de plusurs bonnes choses il y en a d'autres que la faible conception humaine ne peut atteindre, il me parait assez inutile de s'occuper d'une lecture inintelligible, qui par la meme ne pourrait etre d'aucun fruit. Je n'ai jamais pu comprendre la passion qu'ont certaines personnes de s'embrouiller l'entendement, en s'attachant a des livres mystiques, qui n'elevent que des doutes dans leurs esprits, exaltant leur imagination et leur donnent un caractere d'exageration tout a fait contraire a la simplicite chretnne. Lisons les Apotres et l'Evangile. Ne cherchons pas a penetrer ce que ceux la renferment de mysterux, car, comment oserions nous, miserables pecheurs que nous sommes, pretendre a nous initier dans les secrets terribles et sacres de la Providence, tant que nous portons cette depouille charienelle, qui eleve entre nous et l'Eterienel un voile impenetrable? Borienons nous donc a etudr les principes sublimes que notre divin Sauveur nous a laisse pour notre conduite ici bas; cherchons a nous y conformer et a les suivre, persuadons nous que moins nous donnons d'essor a notre faible esprit humain et plus il est agreable a Dieu, Qui rejette toute science ne venant pas de Lui;que moins nous cherchons a approfondir ce qu'il Lui a plu de derober a notre connaissance,et plutot II nous en accordera la decouverte par Son divin esprit.