Безлигазное клонирование

Безлигазное клонирование (англ. LIC, Ligation Independent Cloning), в генетической инженерии — метод получения плазмид, при котором не используются реакции рестрикции и лигирования.

Технология безлигазного клонирования позволяет сократить время создания новых генетических конструкций, например, для экспрессии рекомбинантного белка и наилучшим образом подходит для высокопроизводительной линии производства белков. Для безлигазного клонирования необходимо подготовить LIC-вектор — линеаризованную последовательность ДНК со специфичными липкими концами длиной 11-14 нуклеотидов. Для этого векторную молекулу гидролизуют рестриктазой по одному сайту, затем обрабатывают ДНК-полимеразой фага Т4 в присутствии одного из нуклеотидов. 3'-экзонуклеазная активность этого фермента приводит к удалению нуклеотидов с 3'-конца до тех пор, пока в последовательности не встретится имеющийся в реакционной смеси нуклеотид (см. рисунок). Векторная молекула специально подготовлена таким образом, что по обе стороны от сайта рестрикции на протяжении 11-14 звеньев данный нуклеотид не встречается. После выделения LIC-вектора его можно хранить и многократно использовать для клонирования в него генов целевых белков. Праймеры для ПЦР этих генов выбираются таким образом, чтобы с одной стороны они были комплементарны началу или концу целевого гена, а с другой — липким участкам LIC-вектора. Тогда после ПЦР получается ген белка, у которого с обеих сторон присутствуют одноцепочечные последовательности длиной 11-14 нуклеотидов, комплементарные векторным. Достаточно смешать такой продукт с вектором и трансформировать смесью компетентные клетки бактерии, чтобы получить плазмиды с геном белка. Таким образом, безлигазное клонирование позволяет избежать нескольких стадий рестрикции, выделения из геля и лигирования, каждая из которых может стать причиной неудачного клонирования.

Литература

1. De Jong, R. Enzyme Free Cloning for high throughput gene cloning and expression / R. de Jong, M. Daniёls, R. Kaptein and G. Folkers // J. Struct. Funct. Genomics. — 2006. — V. 7. — P. 109–118.

2. Lee, J. High-throughput T7 LIC vector for introducing C-terminal poly-histidine tags with variable lengths without extra sequences / J. Lee and S. Kim // Prot. Expr. Purif. — 2009. — V. 63. — P. 58–61.

3. Novy, R. Ligation Independent Cloning: Efficient Directional Cloning of PCR Products / R. Novy, K. Yaeger and K. Kolb // Innovations. — 1997. — V. 5. — P. 1-3.

4. Bardóczy, V. A set of ligation-independent in vitro translation vectors for eukaryotic protein production / V. Bardóczy, V. Géczi, T. Sawasaki, Y. Endo and T. Mészáros // BMC Biotechnology. — 2008. — V. 8. — № 32. — P. 1-7.

Отрывок, характеризующий Безлигазное клонирование

Но странное дело, все эти распоряжения, заботы и планы, бывшие вовсе не хуже других, издаваемых в подобных же случаях, не затрогивали сущности дела, а, как стрелки циферблата в часах, отделенного от механизма, вертелись произвольно и бесцельно, не захватывая колес.
В военном отношении, гениальный план кампании, про который Тьер говорит; que son genie n'avait jamais rien imagine de plus profond, de plus habile et de plus admirable [гений его никогда не изобретал ничего более глубокого, более искусного и более удивительного] и относительно которого Тьер, вступая в полемику с г м Феном, доказывает, что составление этого гениального плана должно быть отнесено не к 4 му, а к 15 му октября, план этот никогда не был и не мог быть исполнен, потому что ничего не имел близкого к действительности. Укрепление Кремля, для которого надо было срыть la Mosquee [мечеть] (так Наполеон назвал церковь Василия Блаженного), оказалось совершенно бесполезным. Подведение мин под Кремлем только содействовало исполнению желания императора при выходе из Москвы, чтобы Кремль был взорван, то есть чтобы был побит тот пол, о который убился ребенок. Преследование русской армии, которое так озабочивало Наполеона, представило неслыханное явление. Французские военачальники потеряли шестидесятитысячную русскую армию, и только, по словам Тьера, искусству и, кажется, тоже гениальности Мюрата удалось найти, как булавку, эту шестидесятитысячную русскую армию.
В дипломатическом отношении, все доводы Наполеона о своем великодушии и справедливости, и перед Тутолминым, и перед Яковлевым, озабоченным преимущественно приобретением шинели и повозки, оказались бесполезны: Александр не принял этих послов и не отвечал на их посольство.
В отношении юридическом, после казни мнимых поджигателей сгорела другая половина Москвы.
В отношении административном, учреждение муниципалитета не остановило грабежа и принесло только пользу некоторым лицам, участвовавшим в этом муниципалитете и, под предлогом соблюдения порядка, грабившим Москву или сохранявшим свое от грабежа.
В отношении религиозном, так легко устроенное в Египте дело посредством посещения мечети, здесь не принесло никаких результатов. Два или три священника, найденные в Москве, попробовали исполнить волю Наполеона, но одного из них по щекам прибил французский солдат во время службы, а про другого доносил следующее французский чиновник: «Le pretre, que j'avais decouvert et invite a recommencer a dire la messe, a nettoye et ferme l'eglise. Cette nuit on est venu de nouveau enfoncer les portes, casser les cadenas, dechirer les livres et commettre d'autres desordres». [«Священник, которого я нашел и пригласил начать служить обедню, вычистил и запер церковь. В ту же ночь пришли опять ломать двери и замки, рвать книги и производить другие беспорядки».]