Бисульфитное секвенирование

Бисульфи́тное секвени́рование — общее название группы методов, направленных на изучение паттерна метилирования ДНК посредством обработки её бисульфитом.

Метилирование — первое открытое эпигенетическое маркирование. Оно влияет на уровень экспрессии генов, подавляя транскрипционную активность. Кроме того, во многих случаях метилирование наследуемо, что придает дополнительный интерес его исследованию.

Бисульфит действует на одноцепочечную ДНК, превращая цитозин в урацил. Если же этот цитозин метилирован, то есть к его пятому атому углерода присоединена метильная группа, то такой цитозин не подвергается превращению. Таким образом, бисульфит изменяет последовательность ДНК в зависимости от её паттерна метилирования, и после его воздействия можно установить, какие CpG-динуклеотиды были метилированы, сравнив измененную последовательность с исходной.

Методы

Описанные ниже методы используют секвенирование обработанных бисульфитом участков ДНК для определения паттерна метилирования. Существуют также методы, не основанные на секвенировании, например, комбинированный бисульфитный рестриктационный анализ (COBRA) и иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP). Задачи изучения паттернов метилирования могут состоять как в исследовании метилирования конкретного цитозина, так и в определении доли метилированных цитозинов на каком-то участке ДНК, или даже по всему геному в целом. Из приводимых далее методов некоторые больше приспособлены для изучения конкретных сайтов метилирования, другие же — для изучения метилирования на более высоких уровнях. В идеале необходимо определять метилирование каждого аллеля. Описанию методов бисульфитного секвенирования посвящены несколько обзоров.

Прямое секвенирование

Первый метод бисульфитного секвенирования описан в 1992 году. Для определения паттерна метилирования использовали ПЦР, праймеры для которой были специфичными как к изменённой, так и к неизменённой бисульфитом ДНК, то есть они не содержали цитозинов, входящих в CpG-динуклеотиды. Для праймеров использовали участки, близкие к интересующему сайту метилирования, но не содержащие его. В случае, когда цитозин не был метилирован, в амплифицированной последовательности обнаруживался тимин (урацил), а в синтезированной комплементарной последовательности — аденин. Если цитозин был метилирован, то в амплифицированной последовательности он и остался, а в комплементарной синтезировался гуанин. Такой метод очень трудозатратен, поскольку требует клонирования продуктов ПЦР для достижения необходимой чувствительности. Эту же проблему можно решить при помощи вложенной ПЦР.

Пиросеквенирование

В пиросеквенировании используют ПЦР с праймерами, амплифицирующими как изменённую, так и не изменённую бисульфитом ДНК. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в амплифицируемой последовательности определяется по соотношению количества нуклеотидов А и Г в синтезируемой комплементарной последовательности.

Дальнейшее усовершенствование этого метода заключается в использовании аллель-специфических праймеров с однонуклеотидными полиморфизмами, позволяющих исследовать паттерны метилирования по отдельности в отцовских и материнских аллелях, что особенно полезно при изучении геномного импринтинга.

Чувствительный к метилировании анализ одноцепочечных конформаций

Этот метод основан на методе анализа одноцепочечных конформационных полиморфизмов (англ. single-strand conformation polymorphism analysis, SSCA). SSCA был разработан для выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Фрагменты ДНК одинаковой длины, но разной нуклеотидной последовательности, с разной скоростью перемещаются в электрофорезе. Вообще говоря, SSCA недостаточно чувствителен для выявления единичной замены, но при достаточном количестве полиморфизмов неметилированных CpG-динуклеотидов в обработанной и необработанной бисульфитом ДНК будет достаточно много, чтобы чувствительности метода оказалось достаточно для определения доли метилированных цитозинов на рассматриваемом участке. Данный метод не позволяет исследовать метилированию в конкретном сайте, однако дает представление о метилировании на уровне некоторого участка или даже всего генома.

Методы высокочувствительного плавления

Метод высокочувствительного плавления (HRM) основан на ПЦР в реальном времени. Температуру повышают с 55 до 95 °C, в результате чего комплементарные связи между цепочками разрушаются. Скорость плавления регистрируют при помощи специальных флуоресцентных красителей, и, зная зависимость флуоресценции от нуклеотидной последовательности цепочек, можно различитьоднонуклеотидные полиморфизмы. Метод не дает информации о том, какие именно CpG-динуклеотиды были метилированы и потому не изменились в процессе бисульфитной обработки, однако дает достаточно точную информацию об их количестве на интересующем участке.

Чувствительный к метилированию метод однонуклеотидного удлинения праймера

Метод однонуклеотидного расширения праймера исходно был разработан для анализа однонуклеотидных полиморфизмов. Применительно к анализу метилирования его используют следующим образом. На обработанной бисульфитом одноцепочечной ДНК отжигают праймеры до пары оснований, непосредственно предшествующей интересующему сайту метилирования. Затем праймер удлиняетсяпри помощи ДНК-полимеразы с использованием терминирующих её дидезоксинуклеотидов. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности определяется по соотношению количеств расширений праймеров нуклеотидами Г и А соответственно. Определить соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности можно разными способами. Используют радиоактивные или флуоресцентные метки, а также пиросеквенирование.

Кроме того, это можно делать при помощи матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с последующим применением время-пролетного масс-анализатора (MALDI-TOF) или ион-парной обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (IP-RP-HPLC).

Расщепление, специфичное к основанию

Метод основан на использовании специфического расщепления РНК. При добавлении к праймеру в ПЦР промотора РНК-полимеразы in vitro синтезируется РНК-транскрипт интересующего участка, после чего расщепляется рибонуклеазой А. Рибонуклеаза А расщепляет одноцепочечную РНК на местах расположения нуклеотидов Ц и У. Используя устойчивые к расщеплению нуклеозидтрифосфаты dUTP и dCTP, можно добиться специфического расщепления в местах расположения Ц или У. Фрагменты РНК затем анализируют при помощи MALDI-TOF. Данный метод даёт информацию о метилировании каждого из имеющихся CpG-динуклеотидов, а не только о доле метилированных нуклеотидов.

Метилированно-специфичная ПЦР (MSP)

Этот метод использует праймеры, специфичные или только к преобразованной бисульфитом ДНК, или только к непреобразованной. Соответственно, к первым праймерам прикрепляются только участки, которые были метилированы, а ко вторым — те, которые не были, что лишает необходимости секвенировать участки после амплификации.

Амплифицированную в MSP ДНК можно далее анализировать разными другими методами. Метод MethyLight использует MSP в реальном времени, основанную на флуоресценции]. Mc-MSP использует анализ кривых плавления. Высокочувствительный метод плавления использует и то, и другое, и потому обладает достаточной чувствительностью для определения метилирования низкого уровня.

Методы, основанные на микрочипах

Использование ДНК-микрочипов дает возможность расширить описанные выше методы для анализа метилированности на уровне всего генома. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа делают специфичными к метилированию и соответствующими интересующим CpG-сайтам. Одни комплементарны измененной бисульфитом последовательности (то есть той, в которой CpG-сайт не был метилирован), другие — неизмененной. Примером такого метода служит анализ метилирования Illumina.

Ограничения методов

Методы бисульфитного секвенирования имеют ряд ограничений. У млекопитающих широко распространена модификация ДНК 5-гидроксиметилцитозин. При обработке бисульфитом 5-гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат, который при секвенировании опознаётся как Ц. Таким образом, бисульфитное секвенирование не может различить 5-гидроксиметилцитозин и метилцитозин, а потому не может рассматриваться как метод, чувствительный только к метилированию ДНК. В 2012 году был разработан метод бисульфитного секвенирования, позволяющий различить эти две модификации.

Поскольку неполное превращение азотистых оснований в ДНК под действием бисульфита, которое возможно только в одноцепочечной ДНК, даёт неправильные результаты, необходима точная подборка условий эксперимента (температура, концентрация солей), чтобы поддерживать ДНК в денатурированном состоянии. Поддержанию одноцепочечной конформации ДНК может способствовать её закрепление в агарозном геле.

Ещё одна проблема состоит в деградации ДНК при обработке бисульфитом. Поскольку бисульфит действует только на одноцепочечную ДНК, необходимо проводить реакцию в таких условиях, в которых ДНК оставалась бы одноцепочечной, причем проводить её достаточное для успешной конвертации время. Однако, такие условия, а именно высокая температура и длительный период инкубации, могут привести к деградации до 90 % всей ДНК.

Отрывок, характеризующий Бисульфитное секвенирование

Он показывал на французские орудия, которые снимались с передков и поспешно отъезжали.
На французской стороне, в тех группах, где были орудия, показался дымок, другой, третий, почти в одно время, и в ту минуту, как долетел звук первого выстрела, показался четвертый. Два звука, один за другим, и третий.
– О, ох! – охнул Несвицкий, как будто от жгучей боли, хватая за руку свитского офицера. – Посмотрите, упал один, упал, упал!
– Два, кажется?
– Был бы я царь, никогда бы не воевал, – сказал Несвицкий, отворачиваясь.
Французские орудия опять поспешно заряжали. Пехота в синих капотах бегом двинулась к мосту. Опять, но в разных промежутках, показались дымки, и защелкала и затрещала картечь по мосту. Но в этот раз Несвицкий не мог видеть того, что делалось на мосту. С моста поднялся густой дым. Гусары успели зажечь мост, и французские батареи стреляли по ним уже не для того, чтобы помешать, а для того, что орудия были наведены и было по ком стрелять.
– Французы успели сделать три картечные выстрела, прежде чем гусары вернулись к коноводам. Два залпа были сделаны неверно, и картечь всю перенесло, но зато последний выстрел попал в середину кучки гусар и повалил троих.
Ростов, озабоченный своими отношениями к Богданычу, остановился на мосту, не зная, что ему делать. Рубить (как он всегда воображал себе сражение) было некого, помогать в зажжении моста он тоже не мог, потому что не взял с собою, как другие солдаты, жгута соломы. Он стоял и оглядывался, как вдруг затрещало по мосту будто рассыпанные орехи, и один из гусар, ближе всех бывший от него, со стоном упал на перилы. Ростов побежал к нему вместе с другими. Опять закричал кто то: «Носилки!». Гусара подхватили четыре человека и стали поднимать.
– Оооо!… Бросьте, ради Христа, – закричал раненый; но его всё таки подняли и положили.
Николай Ростов отвернулся и, как будто отыскивая чего то, стал смотреть на даль, на воду Дуная, на небо, на солнце. Как хорошо показалось небо, как голубо, спокойно и глубоко! Как ярко и торжественно опускающееся солнце! Как ласково глянцовито блестела вода в далеком Дунае! И еще лучше были далекие, голубеющие за Дунаем горы, монастырь, таинственные ущелья, залитые до макуш туманом сосновые леса… там тихо, счастливо… «Ничего, ничего бы я не желал, ничего бы не желал, ежели бы я только был там, – думал Ростов. – Во мне одном и в этом солнце так много счастия, а тут… стоны, страдания, страх и эта неясность, эта поспешность… Вот опять кричат что то, и опять все побежали куда то назад, и я бегу с ними, и вот она, вот она, смерть, надо мной, вокруг меня… Мгновенье – и я никогда уже не увижу этого солнца, этой воды, этого ущелья»…
В эту минуту солнце стало скрываться за тучами; впереди Ростова показались другие носилки. И страх смерти и носилок, и любовь к солнцу и жизни – всё слилось в одно болезненно тревожное впечатление.
«Господи Боже! Тот, Кто там в этом небе, спаси, прости и защити меня!» прошептал про себя Ростов.
Гусары подбежали к коноводам, голоса стали громче и спокойнее, носилки скрылись из глаз.
– Что, бг'ат, понюхал пог'оху?… – прокричал ему над ухом голос Васьки Денисова.
«Всё кончилось; но я трус, да, я трус», подумал Ростов и, тяжело вздыхая, взял из рук коновода своего отставившего ногу Грачика и стал садиться.
– Что это было, картечь? – спросил он у Денисова.
– Да еще какая! – прокричал Денисов. – Молодцами г'аботали! А г'абота сквег'ная! Атака – любезное дело, г'убай в песи, а тут, чог'т знает что, бьют как в мишень.
И Денисов отъехал к остановившейся недалеко от Ростова группе: полкового командира, Несвицкого, Жеркова и свитского офицера.
«Однако, кажется, никто не заметил», думал про себя Ростов. И действительно, никто ничего не заметил, потому что каждому было знакомо то чувство, которое испытал в первый раз необстреленный юнкер.
– Вот вам реляция и будет, – сказал Жерков, – глядишь, и меня в подпоручики произведут.
– Доложите князу, что я мост зажигал, – сказал полковник торжественно и весело.
– А коли про потерю спросят?
– Пустячок! – пробасил полковник, – два гусара ранено, и один наповал , – сказал он с видимою радостью, не в силах удержаться от счастливой улыбки, звучно отрубая красивое слово наповал .


Преследуемая стотысячною французскою армией под начальством Бонапарта, встречаемая враждебно расположенными жителями, не доверяя более своим союзникам, испытывая недостаток продовольствия и принужденная действовать вне всех предвидимых условий войны, русская тридцатипятитысячная армия, под начальством Кутузова, поспешно отступала вниз по Дунаю, останавливаясь там, где она бывала настигнута неприятелем, и отбиваясь ариергардными делами, лишь насколько это было нужно для того, чтоб отступать, не теряя тяжестей. Были дела при Ламбахе, Амштетене и Мельке; но, несмотря на храбрость и стойкость, признаваемую самим неприятелем, с которою дрались русские, последствием этих дел было только еще быстрейшее отступление. Австрийские войска, избежавшие плена под Ульмом и присоединившиеся к Кутузову у Браунау, отделились теперь от русской армии, и Кутузов был предоставлен только своим слабым, истощенным силам. Защищать более Вену нельзя было и думать. Вместо наступательной, глубоко обдуманной, по законам новой науки – стратегии, войны, план которой был передан Кутузову в его бытность в Вене австрийским гофкригсратом, единственная, почти недостижимая цель, представлявшаяся теперь Кутузову, состояла в том, чтобы, не погубив армии подобно Маку под Ульмом, соединиться с войсками, шедшими из России.
28 го октября Кутузов с армией перешел на левый берег Дуная и в первый раз остановился, положив Дунай между собой и главными силами французов. 30 го он атаковал находившуюся на левом берегу Дуная дивизию Мортье и разбил ее. В этом деле в первый раз взяты трофеи: знамя, орудия и два неприятельские генерала. В первый раз после двухнедельного отступления русские войска остановились и после борьбы не только удержали поле сражения, но прогнали французов. Несмотря на то, что войска были раздеты, изнурены, на одну треть ослаблены отсталыми, ранеными, убитыми и больными; несмотря на то, что на той стороне Дуная были оставлены больные и раненые с письмом Кутузова, поручавшим их человеколюбию неприятеля; несмотря на то, что большие госпитали и дома в Кремсе, обращенные в лазареты, не могли уже вмещать в себе всех больных и раненых, – несмотря на всё это, остановка при Кремсе и победа над Мортье значительно подняли дух войска. Во всей армии и в главной квартире ходили самые радостные, хотя и несправедливые слухи о мнимом приближении колонн из России, о какой то победе, одержанной австрийцами, и об отступлении испуганного Бонапарта.
Князь Андрей находился во время сражения при убитом в этом деле австрийском генерале Шмите. Под ним была ранена лошадь, и сам он был слегка оцарапан в руку пулей. В знак особой милости главнокомандующего он был послан с известием об этой победе к австрийскому двору, находившемуся уже не в Вене, которой угрожали французские войска, а в Брюнне. В ночь сражения, взволнованный, но не усталый(несмотря на свое несильное на вид сложение, князь Андрей мог переносить физическую усталость гораздо лучше самых сильных людей), верхом приехав с донесением от Дохтурова в Кремс к Кутузову, князь Андрей был в ту же ночь отправлен курьером в Брюнн. Отправление курьером, кроме наград, означало важный шаг к повышению.
Ночь была темная, звездная; дорога чернелась между белевшим снегом, выпавшим накануне, в день сражения. То перебирая впечатления прошедшего сражения, то радостно воображая впечатление, которое он произведет известием о победе, вспоминая проводы главнокомандующего и товарищей, князь Андрей скакал в почтовой бричке, испытывая чувство человека, долго ждавшего и, наконец, достигшего начала желаемого счастия. Как скоро он закрывал глаза, в ушах его раздавалась пальба ружей и орудий, которая сливалась со стуком колес и впечатлением победы. То ему начинало представляться, что русские бегут, что он сам убит; но он поспешно просыпался, со счастием как будто вновь узнавал, что ничего этого не было, и что, напротив, французы бежали. Он снова вспоминал все подробности победы, свое спокойное мужество во время сражения и, успокоившись, задремывал… После темной звездной ночи наступило яркое, веселое утро. Снег таял на солнце, лошади быстро скакали, и безразлично вправе и влеве проходили новые разнообразные леса, поля, деревни.
На одной из станций он обогнал обоз русских раненых. Русский офицер, ведший транспорт, развалясь на передней телеге, что то кричал, ругая грубыми словами солдата. В длинных немецких форшпанах тряслось по каменистой дороге по шести и более бледных, перевязанных и грязных раненых. Некоторые из них говорили (он слышал русский говор), другие ели хлеб, самые тяжелые молча, с кротким и болезненным детским участием, смотрели на скачущего мимо их курьера.
Князь Андрей велел остановиться и спросил у солдата, в каком деле ранены. «Позавчера на Дунаю», отвечал солдат. Князь Андрей достал кошелек и дал солдату три золотых.
– На всех, – прибавил он, обращаясь к подошедшему офицеру. – Поправляйтесь, ребята, – обратился он к солдатам, – еще дела много.
– Что, г. адъютант, какие новости? – спросил офицер, видимо желая разговориться.
– Хорошие! Вперед, – крикнул он ямщику и поскакал далее.
Уже было совсем темно, когда князь Андрей въехал в Брюнн и увидал себя окруженным высокими домами, огнями лавок, окон домов и фонарей, шумящими по мостовой красивыми экипажами и всею тою атмосферой большого оживленного города, которая всегда так привлекательна для военного человека после лагеря. Князь Андрей, несмотря на быструю езду и бессонную ночь, подъезжая ко дворцу, чувствовал себя еще более оживленным, чем накануне. Только глаза блестели лихорадочным блеском, и мысли изменялись с чрезвычайною быстротой и ясностью. Живо представились ему опять все подробности сражения уже не смутно, но определенно, в сжатом изложении, которое он в воображении делал императору Францу. Живо представились ему случайные вопросы, которые могли быть ему сделаны,и те ответы,которые он сделает на них.Он полагал,что его сейчас же представят императору. Но у большого подъезда дворца к нему выбежал чиновник и, узнав в нем курьера, проводил его на другой подъезд.
– Из коридора направо; там, Euer Hochgeboren, [Ваше высокородие,] найдете дежурного флигель адъютанта, – сказал ему чиновник. – Он проводит к военному министру.
Дежурный флигель адъютант, встретивший князя Андрея, попросил его подождать и пошел к военному министру. Через пять минут флигель адъютант вернулся и, особенно учтиво наклонясь и пропуская князя Андрея вперед себя, провел его через коридор в кабинет, где занимался военный министр. Флигель адъютант своею изысканною учтивостью, казалось, хотел оградить себя от попыток фамильярности русского адъютанта. Радостное чувство князя Андрея значительно ослабело, когда он подходил к двери кабинета военного министра. Он почувствовал себя оскорбленным, и чувство оскорбления перешло в то же мгновенье незаметно для него самого в чувство презрения, ни на чем не основанного. Находчивый же ум в то же мгновение подсказал ему ту точку зрения, с которой он имел право презирать и адъютанта и военного министра. «Им, должно быть, очень легко покажется одерживать победы, не нюхая пороха!» подумал он. Глаза его презрительно прищурились; он особенно медленно вошел в кабинет военного министра. Чувство это еще более усилилось, когда он увидал военного министра, сидевшего над большим столом и первые две минуты не обращавшего внимания на вошедшего. Военный министр опустил свою лысую, с седыми висками, голову между двух восковых свечей и читал, отмечая карандашом, бумаги. Он дочитывал, не поднимая головы, в то время как отворилась дверь и послышались шаги.