Методы секвенирования нового поколения

Секвенирование нового поколения — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания её первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

История секвенирования

Первая концепция секвенирования была предложена Сэнгером в 1977 году. Технология получила название «метод обрыва цепи». В том же году Максам и Гилберт предложили альтернативный метод, получивший название «метод химической деградации». Необходимость в массовом, качественном и быстром секвенировании стимулировала многочисленные модификации и всевозможные улучшения этих методов. В той или иной степени изменениям подверглись практически все составляющие этого процесса. Переломной точкой развития технологии стало появление ПЦР и автоматизация основных этапов «чтения» ДНК, давшие начало методам секвенирования следующего поколения. Платформы для методов нового поколения основываются на распараллеливании процесса «чтения» ДНК, и таким образом за один прогон работы секвенатора можно определить первичные структуры нескольких участков генома. Секвенаторы нового поколения стали значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов пар оснований, что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.

Основные принципы всех методов

Все основные принципы работы технологий СНП базируются на секвенировании ДНК-чипов, используя интерактивные циклические ферментативные реакции с дальнейшим сбором полученной информации в виде иллюстраций. Полученные данные используются для восстановления нуклеотидной последовательности или, как для технологии SOLiD, динуклеотидных «цветов». Несмотря на разные методы получения копий (амплификация) участков генома и на техническую разницу дифференциации различных нуклеотидов в прочтённых последовательностях, общая схема работы для всех секвенаторов одна. Первый этап секвенирования — создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет сшить с общедоступными адаптерными последовательностями. Второй этап — создание ампликонов с помощью ПЦР, которые будут использованы как образцы. Третий этап — определение первичной структуры всех фрагментов.

Методы

Сравнение различных методов СНП

метод	принцип	длина одного прочтения, пар оснований	стоимость секвенирования 1 млн пар оснований	стоимость секвенатора	время работы за цикл	количество прочтений за цикл	преимущества	недостатки
454 Life Sciences	пиросеквенирование	400	10$	500 000$	7 часов	1 000 000	длина прочтённых геномных участков; скорость	стоимость; погрешность
Illumina-SOLEXA	SBS (sequncing-by-synthesis)	300	0,05—0,15$	600 000$	9 дней	до 3 000 000 000	эффективность, стоимость	скорость
IonTorrent	ионный полупроводник	200	1$	50 000$	1,5 часа	до 5 000 000	стоимость; скорость	погрешность
SOLiD	секвенирование на основе лигирования	35—50	0,13$	595 000$	9 дней	1 300 000 000	стоимость	скорость
Helicos	HeliScope	2900	2$		1 час	35 000—75 000	длина прочтённых геномных участков; скорость	низкая производительность при желаемой малой погрешности; стоимость

В связи со стремительным развитием методов секвенирования, параметры методов, такие как стоимость секвенаторов и их работы, время и длины прочтённых участков, могут меняться. Актуальная информация доступна в современных источниках.

Roche/454 Life Sciences

Первая эффективно используемая на коммерческой основе платформа СНП. Компания 454 Life Sciences основана в 2000 году Джонатаном Ротбергом (в производство запущена в 2005 году). Данная технология представляет собой последовательный синтез методов эмульсионного ПЦР и пиросеквенирования.

Амплификация ДНК проходит в каплях воды в масляной эмульсии. В каждой капле воды находится одноцепочечная матрица ДНК, связанная с праймером на бусинке. Далее, каждая бусина помещается на чип, представляющий собой оптическое волокно. Туда же помещаются необходимые для секвенирования ферменты: ДНК-полимераза, люцифераза, АТФ-сульфурилаза. В последней сборке реакция секвенирования идет в ячейках объемом 3,4·10⁶ пкл, на стенках которых есть специальное металлическое покрытие, нивелирующее шум.

Illumina/Solexa

Авторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод секвенирования использует прикреплённые к микросферам единичные молекулы ДНК. В 2006 году была запущена Solexa Genome Analyzer 1G, первая платформа, генерирующая короткие участки генома. После её приобретения компанией Illumina Genome Analyzer использует оптически прозрачные ячейки с 8 индивидуальными поверхностями, где связываются олигонуклеотиды. В отличие от пиросеквенирования удлинение последовательности происходит постепенно, что позволяет за раз с помощью камеры снимать большие ДНК-чипы.

Applied Biosystems/SOLiD

Платформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная Applied Biosystems — технология секвенирования коротких чтений, основанная на лигировании. Метод был предложен в лаборатории Георга Черча и опубликован в 2005 году (был заново просеквенирован геном Escherichia coli). По технологии SOLiD при секвенировании фрагменты ДНК лигируются на олигонуклеотидные адаптеры, прикрепленные к шарикам, далее они амплифицируются с помощью эмульсионной ПЦР.

Одномолекулярное секвенирование Helicos Biosciences

Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope (Helicos BioSciences) имеет производительность около 1Gb/день. Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим полиаденилированием на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой.

Одномолекулярное секвенирование в реальном времени Pacific Biosciences

Метод одномолекулярного секвенирование в реальном времени (англ. Single molecule real time sequencing, SMRT) основан на наблюдении за работой единичной молекулы ДНК-полимеразы. Использование четырех флуоресцентно-меченных нуклеотидов позволяет определить какой нуклеотид присоединяет ДНК-полимераза в данный момент.

Ion Torrent Sequencing

Метод основан на связи между химической и цифровой информацией, что позволяет быстрее и проще секвенировать большое количество образцов. Эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать.

Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК, проводить ChIP-seq. Более того, с его помощью можно изучать геномы микробных сообществ.

Нанопоровое секвенирование

Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей мембране. При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.

Применение секвенирования нового поколения

Быстрота и дешевизна методов СНП, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря СНП появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты.

Геномный анализ

Стали доступны геномы разных по сложности живых систем от микроорганизмов до человека, включая геном цитогенетически находящихся в норме клеток миелоидной лейкемии. Увеличение длины чтений ускорило сборку целых геномов.

Направленное пересеквенирование геномов

Секвенирование определенных регионов в геномах используется для выявления полиморфизмов (в частности однонуклеотидых полиморфизмов) и мутаций в генах, задействованных в развитии опухолевых и других заболеваний. Примером одной из таких широкомасштабных работ может служить проект 1000 геномов.

Применение в сочетании с другими методами

Использование СНП позволило определять места связывания белков с ДНК (ChIP-seq), взаимодействующие участки ДНК (Определение конформации хромосом) и участки открытого хроматина на протяжении всего генома.

Удешевление и распространение СНП позволяет осуществлять проекты ENCODE и modENCODE.

Метагеномика

СНП широко используется в исследованиях разнообразия микроорганизмов в различных образцах (например, микробные популяции в океане и почве, идентификация новых вирусов в органах, подлежащих трансплантации, описание характерной для ЖКТ микрофлоры и т. д.)

Секвенирование транскриптома

На основе СНП создан новый подход РНК-секвенирования (RNA-seq) для картирования и подсчёта транскриптов в биологических образцах. У этого метода есть преимущества над используемым ранее методом ДНК-микрочипов. Например, ДНК-чипы зависят от перекрытия геномных последовательностей, в то время как RNA-seq позволяет охарактеризовать транскрипцию без предварительного знания места начала транскрипции.

Картирование ДНК-связывающих белков и анализ хроматина

Идентификация регуляторных белков, ассоциированных с геномами, было значительно ускорено с помощью введения в лабораторную практику иммунопреципитации хроматина и гибридизации на микрочипах.

Перспективы применения секвенирования в медицине

В недалеком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их для идентификации мишеней для лекарственной терапии онкологических больных. Уже сейчас^{[когда?]} анализ по технологии секвенирования следующего поколения (NGS) от момента биопсии до завершения NGS занимает менее 100 дней. Столько же времени занимает секвенирование всего генома (whole genome sequencing, WGS) и секвенирование всего транскриптома (whole transcriptome sequencing, WTS)

См. также

• Секвенирование
• Секвенирование спаренных концов
• Полони-секвенирование
• Картирование коротких чтений
• Секвенирование РНК

Литература

• G. A. Pavlopoulos, A. Oulas, E. Iacucci, et al. (2013) [www.biodatamining.org/content/6/1/13?utm_campaign=31_10_13_TrackedIF_BioData_Mining_BMCUp&utm_content=7390020636&utm_medium=BMCemail&utm_source=Emailvision Unraveling genomic variation from next generation sequencing data]. BioData Mining, 6:13 doi:10.1186/1756-0381-6-13.
• Next-Generation DNA Sequencing Informatics by Stuart Brown, Cold Spring Harbor, 2013.

Отрывок, характеризующий Методы секвенирования нового поколения

«Наташа, сестра, черные глаза. На… ташка (Вот удивится, когда я ей скажу, как я увидал государя!) Наташку… ташку возьми…» – «Поправей то, ваше благородие, а то тут кусты», сказал голос гусара, мимо которого, засыпая, проезжал Ростов. Ростов поднял голову, которая опустилась уже до гривы лошади, и остановился подле гусара. Молодой детский сон непреодолимо клонил его. «Да, бишь, что я думал? – не забыть. Как с государем говорить буду? Нет, не то – это завтра. Да, да! На ташку, наступить… тупить нас – кого? Гусаров. А гусары в усы… По Тверской ехал этот гусар с усами, еще я подумал о нем, против самого Гурьева дома… Старик Гурьев… Эх, славный малый Денисов! Да, всё это пустяки. Главное теперь – государь тут. Как он на меня смотрел, и хотелось ему что то сказать, да он не смел… Нет, это я не смел. Да это пустяки, а главное – не забывать, что я нужное то думал, да. На – ташку, нас – тупить, да, да, да. Это хорошо». – И он опять упал головой на шею лошади. Вдруг ему показалось, что в него стреляют. «Что? Что? Что!… Руби! Что?…» заговорил, очнувшись, Ростов. В то мгновение, как он открыл глаза, Ростов услыхал перед собою там, где был неприятель, протяжные крики тысячи голосов. Лошади его и гусара, стоявшего подле него, насторожили уши на эти крики. На том месте, с которого слышались крики, зажегся и потух один огонек, потом другой, и по всей линии французских войск на горе зажглись огни, и крики всё более и более усиливались. Ростов слышал звуки французских слов, но не мог их разобрать. Слишком много гудело голосов. Только слышно было: аааа! и рррр!
– Что это? Ты как думаешь? – обратился Ростов к гусару, стоявшему подле него. – Ведь это у неприятеля?
Гусар ничего не ответил.
– Что ж, ты разве не слышишь? – довольно долго подождав ответа, опять спросил Ростов.
– А кто ё знает, ваше благородие, – неохотно отвечал гусар.
– По месту должно быть неприятель? – опять повторил Ростов.
– Може он, а може, и так, – проговорил гусар, – дело ночное. Ну! шали! – крикнул он на свою лошадь, шевелившуюся под ним.
Лошадь Ростова тоже торопилась, била ногой по мерзлой земле, прислушиваясь к звукам и приглядываясь к огням. Крики голосов всё усиливались и усиливались и слились в общий гул, который могла произвести только несколько тысячная армия. Огни больше и больше распространялись, вероятно, по линии французского лагеря. Ростову уже не хотелось спать. Веселые, торжествующие крики в неприятельской армии возбудительно действовали на него: Vive l'empereur, l'empereur! [Да здравствует император, император!] уже ясно слышалось теперь Ростову.
– А недалеко, – должно быть, за ручьем? – сказал он стоявшему подле него гусару.
Гусар только вздохнул, ничего не отвечая, и прокашлялся сердито. По линии гусар послышался топот ехавшего рысью конного, и из ночного тумана вдруг выросла, представляясь громадным слоном, фигура гусарского унтер офицера.
– Ваше благородие, генералы! – сказал унтер офицер, подъезжая к Ростову.
Ростов, продолжая оглядываться на огни и крики, поехал с унтер офицером навстречу нескольким верховым, ехавшим по линии. Один был на белой лошади. Князь Багратион с князем Долгоруковым и адъютантами выехали посмотреть на странное явление огней и криков в неприятельской армии. Ростов, подъехав к Багратиону, рапортовал ему и присоединился к адъютантам, прислушиваясь к тому, что говорили генералы.
– Поверьте, – говорил князь Долгоруков, обращаясь к Багратиону, – что это больше ничего как хитрость: он отступил и в арьергарде велел зажечь огни и шуметь, чтобы обмануть нас.
– Едва ли, – сказал Багратион, – с вечера я их видел на том бугре; коли ушли, так и оттуда снялись. Г. офицер, – обратился князь Багратион к Ростову, – стоят там еще его фланкёры?
– С вечера стояли, а теперь не могу знать, ваше сиятельство. Прикажите, я съезжу с гусарами, – сказал Ростов.
Багратион остановился и, не отвечая, в тумане старался разглядеть лицо Ростова.
– А что ж, посмотрите, – сказал он, помолчав немного.
– Слушаю с.
Ростов дал шпоры лошади, окликнул унтер офицера Федченку и еще двух гусар, приказал им ехать за собою и рысью поехал под гору по направлению к продолжавшимся крикам. Ростову и жутко и весело было ехать одному с тремя гусарами туда, в эту таинственную и опасную туманную даль, где никто не был прежде его. Багратион закричал ему с горы, чтобы он не ездил дальше ручья, но Ростов сделал вид, как будто не слыхал его слов, и, не останавливаясь, ехал дальше и дальше, беспрестанно обманываясь, принимая кусты за деревья и рытвины за людей и беспрестанно объясняя свои обманы. Спустившись рысью под гору, он уже не видал ни наших, ни неприятельских огней, но громче, яснее слышал крики французов. В лощине он увидал перед собой что то вроде реки, но когда он доехал до нее, он узнал проезженную дорогу. Выехав на дорогу, он придержал лошадь в нерешительности: ехать по ней, или пересечь ее и ехать по черному полю в гору. Ехать по светлевшей в тумане дороге было безопаснее, потому что скорее можно было рассмотреть людей. «Пошел за мной», проговорил он, пересек дорогу и стал подниматься галопом на гору, к тому месту, где с вечера стоял французский пикет.
– Ваше благородие, вот он! – проговорил сзади один из гусар.
И не успел еще Ростов разглядеть что то, вдруг зачерневшееся в тумане, как блеснул огонек, щелкнул выстрел, и пуля, как будто жалуясь на что то, зажужжала высоко в тумане и вылетела из слуха. Другое ружье не выстрелило, но блеснул огонек на полке. Ростов повернул лошадь и галопом поехал назад. Еще раздались в разных промежутках четыре выстрела, и на разные тоны запели пули где то в тумане. Ростов придержал лошадь, повеселевшую так же, как он, от выстрелов, и поехал шагом. «Ну ка еще, ну ка еще!» говорил в его душе какой то веселый голос. Но выстрелов больше не было.
Только подъезжая к Багратиону, Ростов опять пустил свою лошадь в галоп и, держа руку у козырька, подъехал к нему.
Долгоруков всё настаивал на своем мнении, что французы отступили и только для того, чтобы обмануть нас, разложили огни.
– Что же это доказывает? – говорил он в то время, как Ростов подъехал к ним. – Они могли отступить и оставить пикеты.
– Видно, еще не все ушли, князь, – сказал Багратион. – До завтрашнего утра, завтра всё узнаем.
– На горе пикет, ваше сиятельство, всё там же, где был с вечера, – доложил Ростов, нагибаясь вперед, держа руку у козырька и не в силах удержать улыбку веселья, вызванного в нем его поездкой и, главное, звуками пуль.
– Хорошо, хорошо, – сказал Багратион, – благодарю вас, г. офицер.
– Ваше сиятельство, – сказал Ростов, – позвольте вас просить.
– Что такое?
– Завтра эскадрон наш назначен в резервы; позвольте вас просить прикомандировать меня к 1 му эскадрону.
– Как фамилия?
– Граф Ростов.
– А, хорошо. Оставайся при мне ординарцем.
– Ильи Андреича сын? – сказал Долгоруков.
Но Ростов не отвечал ему.
– Так я буду надеяться, ваше сиятельство.
– Я прикажу.
«Завтра, очень может быть, пошлют с каким нибудь приказанием к государю, – подумал он. – Слава Богу».

Крики и огни в неприятельской армии происходили оттого, что в то время, как по войскам читали приказ Наполеона, сам император верхом объезжал свои бивуаки. Солдаты, увидав императора, зажигали пуки соломы и с криками: vive l'empereur! бежали за ним. Приказ Наполеона был следующий:
«Солдаты! Русская армия выходит против вас, чтобы отмстить за австрийскую, ульмскую армию. Это те же баталионы, которые вы разбили при Голлабрунне и которые вы с тех пор преследовали постоянно до этого места. Позиции, которые мы занимаем, – могущественны, и пока они будут итти, чтоб обойти меня справа, они выставят мне фланг! Солдаты! Я сам буду руководить вашими баталионами. Я буду держаться далеко от огня, если вы, с вашей обычной храбростью, внесете в ряды неприятельские беспорядок и смятение; но если победа будет хоть одну минуту сомнительна, вы увидите вашего императора, подвергающегося первым ударам неприятеля, потому что не может быть колебания в победе, особенно в тот день, в который идет речь о чести французской пехоты, которая так необходима для чести своей нации.
Под предлогом увода раненых не расстроивать ряда! Каждый да будет вполне проникнут мыслию, что надо победить этих наемников Англии, воодушевленных такою ненавистью против нашей нации. Эта победа окончит наш поход, и мы можем возвратиться на зимние квартиры, где застанут нас новые французские войска, которые формируются во Франции; и тогда мир, который я заключу, будет достоин моего народа, вас и меня.
Наполеон».


В 5 часов утра еще было совсем темно. Войска центра, резервов и правый фланг Багратиона стояли еще неподвижно; но на левом фланге колонны пехоты, кавалерии и артиллерии, долженствовавшие первые спуститься с высот, для того чтобы атаковать французский правый фланг и отбросить его, по диспозиции, в Богемские горы, уже зашевелились и начали подниматься с своих ночлегов. Дым от костров, в которые бросали всё лишнее, ел глаза. Было холодно и темно. Офицеры торопливо пили чай и завтракали, солдаты пережевывали сухари, отбивали ногами дробь, согреваясь, и стекались против огней, бросая в дрова остатки балаганов, стулья, столы, колеса, кадушки, всё лишнее, что нельзя было увезти с собою. Австрийские колонновожатые сновали между русскими войсками и служили предвестниками выступления. Как только показывался австрийский офицер около стоянки полкового командира, полк начинал шевелиться: солдаты сбегались от костров, прятали в голенища трубочки, мешочки в повозки, разбирали ружья и строились. Офицеры застегивались, надевали шпаги и ранцы и, покрикивая, обходили ряды; обозные и денщики запрягали, укладывали и увязывали повозки. Адъютанты, батальонные и полковые командиры садились верхами, крестились, отдавали последние приказания, наставления и поручения остающимся обозным, и звучал однообразный топот тысячей ног. Колонны двигались, не зная куда и не видя от окружавших людей, от дыма и от усиливающегося тумана ни той местности, из которой они выходили, ни той, в которую они вступали.
Солдат в движении так же окружен, ограничен и влеком своим полком, как моряк кораблем, на котором он находится. Как бы далеко он ни прошел, в какие бы странные, неведомые и опасные широты ни вступил он, вокруг него – как для моряка всегда и везде те же палубы, мачты, канаты своего корабля – всегда и везде те же товарищи, те же ряды, тот же фельдфебель Иван Митрич, та же ротная собака Жучка, то же начальство. Солдат редко желает знать те широты, в которых находится весь корабль его; но в день сражения, Бог знает как и откуда, в нравственном мире войска слышится одна для всех строгая нота, которая звучит приближением чего то решительного и торжественного и вызывает их на несвойственное им любопытство. Солдаты в дни сражений возбужденно стараются выйти из интересов своего полка, прислушиваются, приглядываются и жадно расспрашивают о том, что делается вокруг них.
Туман стал так силен, что, несмотря на то, что рассветало, не видно было в десяти шагах перед собою. Кусты казались громадными деревьями, ровные места – обрывами и скатами. Везде, со всех сторон, можно было столкнуться с невидимым в десяти шагах неприятелем. Но долго шли колонны всё в том же тумане, спускаясь и поднимаясь на горы, минуя сады и ограды, по новой, непонятной местности, нигде не сталкиваясь с неприятелем. Напротив того, то впереди, то сзади, со всех сторон, солдаты узнавали, что идут по тому же направлению наши русские колонны. Каждому солдату приятно становилось на душе оттого, что он знал, что туда же, куда он идет, то есть неизвестно куда, идет еще много, много наших.
– Ишь ты, и курские прошли, – говорили в рядах.
– Страсть, братец ты мой, что войски нашей собралось! Вечор посмотрел, как огни разложили, конца краю не видать. Москва, – одно слово!
Хотя никто из колонных начальников не подъезжал к рядам и не говорил с солдатами (колонные начальники, как мы видели на военном совете, были не в духе и недовольны предпринимаемым делом и потому только исполняли приказания и не заботились о том, чтобы повеселить солдат), несмотря на то, солдаты шли весело, как и всегда, идя в дело, в особенности в наступательное. Но, пройдя около часу всё в густом тумане, большая часть войска должна была остановиться, и по рядам пронеслось неприятное сознание совершающегося беспорядка и бестолковщины. Каким образом передается это сознание, – весьма трудно определить; но несомненно то, что оно передается необыкновенно верно и быстро разливается, незаметно и неудержимо, как вода по лощине. Ежели бы русское войско было одно, без союзников, то, может быть, еще прошло бы много времени, пока это сознание беспорядка сделалось бы общею уверенностью; но теперь, с особенным удовольствием и естественностью относя причину беспорядков к бестолковым немцам, все убедились в том, что происходит вредная путаница, которую наделали колбасники.