Гибридизация ДНК
Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.
Содержание
Протокол эксперимента
- Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.
- Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.
- Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК гибридизуются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.
Анализ скорости отжига (= гибридизации) одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.
Вычисление температуры плавления ДНК
Вторичная структура ДНК играет важную роль в биологии, генетической диагностике и других методах молекулярной биологии и нанотехнологии. Поэтому, точное определение температуры плавления ДНК или РНК молекул играет самую главную роль во всех молекулярно-биологических методах, например, как подбор проб или олигонуклеотидов для микрочипов или для подбора ПЦР праймеров. Существует несколько простых формул вычисления температуры плавления для коротких олигонуклеотидов. Грубое вычисление температуры плавления (Tm) короткого олигонуклеотида (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C — сумма всех гуанинов и цитозинов, L — длина олигонуклеотида):
<math>T_m =2(L+G+C)</math>,[1]
Усредненная формула подсчета Tm для короткого олигонуклеотида (и для длинных ДНК фрагментов), с учетом концентрации ионов K+ и DMSO:
<math>T_m = 77.1+11.7\lg[K^+]+\frac{41(G+C)- 528}{L}-0.75[%DMSO]</math>,[2]
Однако, эти уравнения не учитывают инициацию связывания при гибридизации олигонуклеотида, не учитывают особенности самой последовательности и концевого эффекта, характерный для олигонуклеотидных дуплексов. Поэтому, данная формула пригодна в большей степени, где последовательность ДНК усредненная и длина дуплексов свыше 40 нуклеотидов.
ДНК термодинамика
Наиболее распространенный метод используемый сегодня для расчета температуры плавления двухцепочечной или одноцепочечной ДНК, основан на двухступенчатой термодинамической модели. Две комплементарные ДНК молекулы А и В, либо они связаны друг с другом либо свободны в растворе («random coil state»). Обычно считается, что обе молекулы А и В полностью комплементарны, поэтому очевидна их гибридизация, а также разрешены одна или несколько ошибок комплементарности в дуплекс, в том числе допустимы и некомплементарные G-G, G-T и G-A пары (wobble pairs). В случае же только одной молекулы предполагается упаковка её в петлевую структуру. Процесс гибридизации в дуплекс описывается формулой:
<math>A + B \longleftrightarrow AB</math>
где А и В разные цепи в растворе («random coil state»), и АВ образованный дуплекс. Данная реакция обратима. Константа равновесия k, для этой реакции определяется как:
<math>k=\frac{[AB]}{[A][B]}</math>.
Константа равновесия зависит от концентрации цепей, от температуры, концентрации солей, рН и других компонентов в реакции (например, глицерин или DMSO). Константа k меняется в ответ на изменение концентрации одной или обоих цепей ([At] и/или [Bt]), тогда вся система отвечает на изменения, и тогда индивидуальные концентрации [A], [B] и [AB] тоже изменятся. Например, если в системе больше цепи А, то концентрация [AB] увеличится. Предположим, константа равновесия равна 1.81x106 и концентрация цепей [At] = [Bt] = 10−5M:
<math>k=1.81 \cdot 10^6=\frac{[AB]}{[A][B]}</math>
<math>[At] = 10^{-5}M = [A] + [AB]</math>
<math>[Bt] = 10^{-5}M = [B] + [AB]</math>
Подставляем компоненты в формулы для вычисления k:
<math>k=\frac{[AB]}{([A]-[AB])([Bt]-[AB])}</math>
<math>k=1.81 \cdot 10^6=\frac{[AB]}{[A][B]}</math>
<math>1.81 \cdot 10^6=\frac{[AB]}{(10^{-5}-[AB])(10^{-5}-[AB])}</math>
После перестановки получаем:
<math>O = k [AB]^2-\frac{k[At] + k[Bt] + 1}{[AB] + k[At][Bt]}</math>
<math>O = aX^2 + bX + c</math>
где <math>[AB]=X=\frac{\pm b\sqrt(b^2-4ac)}{2a}</math>.
Например, подставить в эту формулу [AB] = 7.91x10−6M тогда концентрацию цепей составит [A] = [B] = 2.09x10−6M. То есть только 79 % [At] цепей будет связаны в дуплекс [AB].
Возможно ли определить константы равновесия при изменении температуры? Это подводит нас к пониманию важных термодинамическим параметрам как свободной энергии (dG), энтальпия (dH) и энтропия (dS).
Изменения свободной энергии, энтальпия и энтропия происходят при переходе от «температуре Т гибридизации» к беспорядочному, случайному состоянию. Эти отношения определяются формулой dG = dH – TdS, (для концентрации цепей [A] = [B] = [AB] = 1M), тогда идеальная формула для вычисления свободной энергии Гиббса:
<math>dG_T^0=\frac{dH^0-TdS^0}{1000}</math>
где T температура в кельвинах, dH° (cal/mol) и dS° (cal/mol K).
Существует полезное соотношение, связывающее изменение свободной энергии Гиббса в ходе химической реакции с её константой равновесия:
<math>dG_T^0=-RT\cdot\ln(k)</math>
где R — универсальная газовая постоянная (1.987cal/mol K).
Комбинируя обе формулы получаем:
<math>T=\frac{dH^0}{dS^0-R\ln(k)}</math>
Температура плавления (Tm) определяется при равновесии, когда половину цепей связаны друг с другом и другая половина находится в свободном состоянии, то есть k=1:
<math>T=\frac{dH^0}{dS^0}-273.15</math>
Температуру плавления для простой петли рассчитывают как <math>T_m(K)=\frac{dH^0}{dS^0}</math>. Для ДНК дуплекса необходимо учитывать концентрацию каждой цепи (в молях, М). Таким образом, если [A] и [B] концентрации молекул А и В, то общая концентрация цепей, C равна их сумме, [A] + [B].
Предполагается, что концентрация обоих цепей одинаковая [A] = [B] = C/2. В таком случае,
<math>T_m(K)=\frac{dH^0}{dS^0+R\cdot\ln(\frac{C}{f})}</math>
где f = 4. Для самокомплементарного олигонуклеотида [A0] = C и тогда и f = 1. Данная температура плавления определяется только в случае, когда половина молекул связаны друг с другом.
Для самокомплементарного олигонуклеотида, k = 1/[At] поэтому:
<math>T_m =\frac{dH^0}{dS^0+R\ln([At])}-273.15</math>
Для не комплементарного дуплекса, когда [At] ≥ [Bt], k =1/([At] — [Bt]/2), Tm вычисляют так:
<math>T_m =\frac{dH^0}{dS^0+R\ln([At]-\frac{[Bt]}{2})}-273.15</math>
где [At] молярная концентрация преобладающей цепи (как правило ПЦР праймер), а [Вt] молярная концентрация цепи с низкой концентрацией (геномная ДНК).
Вычисление температуры плавления
Термодинамические параметры dG, dH и dS рассчитываются на основе модели ближайших соседей (nearest neighbour). Для точного прогнозирования вторичной структуры ДНК при гибридизации с использованием динамических алгоритмов программирования требуется база данных по всем возможным термодинамическим параметрам для каждой комплементарной пары оснований, а также для для всех вариантов при не совпадающих нуклеотидов, для свободных концов, шпилек и петель. Термодинамическая формула вычисления короткого олигонуклеотида основывается на термодинамических параметрах — энтропии dS и энтальпии dH, для каждой из 10 вариантов сочетаний четырех нуклеотидов (Таблица 1). В Таблице 1 представлены термодинамические параметры для ближайших соседей (NN) для пар нуклеотидов при концентрации 1М NaCl.
Для подсчета Tm (°С) осуществляется суммирование всех значений свободной энергии Гиббса для каждой пары с шагом один нуклеотид:
dGобщая = dGначальное + dGсиметрия +∑dG + dGATконец
| 5’-CGTTGA-3’ | = dGначальное + dGсиметрия + | CG + GT + TT + TG + GA + ATконец |
| 3’-GCAACT-5’ | GC CA AA AC CT |
dGтеоретическая = 1.96 + 0 - 2.17 – 1.44 – 1.44 – 1.00 – 1.45 – 1.30 +0.05
dGтеоретическая = -5.35 kcal/mol
Аналогично подсчитываются значения энтропии (dH = -43.5 kcal/mol) и энтальпии (dS = -122.5):
<math>T_m =\frac{-43.5\cdot1000}{-122.5+1.9872\ln(\frac{0.0004}{4})}-273.15=35.8</math>
Многие ДНК дуплексы имеют конкурирующие однонитевые структуры, и это сдвигает равновесии системы и как результат снижение значения Tm от предсказуемой формулой значения.
Общая формула для вычисления Tm с коррекцией на соль в растворе:
<math>T_m =\frac{dH\cdot1000}{dS+R\ln(\frac{C}{4})+0.386(L-1)\ln([K^+])}-273.15</math>
где L - длина олигонуклеотида, R — газовая постоянная (1.987cal/K mol), c — концентрация олигонуклеотида в (обычно 2x10−7 M), [K+] — концентрация ионов калия в молях (обычно 5x10−2M).
| Последовательность пар (5'-3'/3'-5') |
<math>\Delta H</math>° kcal/mol |
<math>\Delta S</math>° cal/(mol·K) |
<math>\Delta G</math>°37 kcal/mol |
|---|---|---|---|
| AA/TT | -7.6 | -21.3 | -1.00 |
| AT/TA | -7.2 | -20.4 | -0.88 |
| TA/AT | -7.2 | -20.3 | -0.58 |
| CA/GT | -8.5 | -22.7 | -1.45 |
| GT/CA | -8.4 | -22.4 | -1.44 |
| CT/GA | -7.8 | -21.0 | -1.28 |
| GA/CT | -8.2 | -22.2 | -1.30 |
| CG/GC | -10.6 | -27.2 | -2.17 |
| GC/CG | -9.8 | -24.4 | -2.24 |
| GG/CC | -8.0 | -19.9 | -1.84 |
| инициация | +0.2 | -5.7 | +1.96 |
| концевая A-T пара | +2.2 | +6.9 | +0.05 |
| коррекция на симметрию | 0.0 | -1.4 | +0.43 |
Одиночная ошибка внутри дуплекса
Модель ближайших соседей для комплементарных нуклеотидных пар может расширен для пары, включающие некомплементарные нуклеотиды. Было показано, что существует тенденция уменьшающая стабильность не комплементарных пар оснований в порядке убывания:
G-C > A-T > G·G > G·T ≥ G·A > T·T ≥ A·A > T·C ≥ A·C ≥ C·C
Гуанидин G является наиболее «неразборчивым» основанием, поскольку он образует как самые «сильные» пары оснований так и стабильные пары с некомплементарными основаниями (G·G, G·T и G·A). С другой стороны, цитозин C является наиболее дискриминационным основанием, поскольку он образует самые стабильные комплементарные пары и неустойчивые пары с некомплементарными основаниями (T·C ≥ A·C ≥ C·C)[5],[6].
См. также
Напишите отзыв о статье "Гибридизация ДНК"
Примечания
- ↑ Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K (1979). «[dx.doi.org/10.1093/nar/6.11.3543 Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch]». Nucleic Acids Res 6 (11): 3543-57. DOI:10.1093/nar/6.11.3543.
- ↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz (2001). «[www.clinchem.org/content/47/11/1956.full Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas]». Clinical Chemistry 47 (11): 1956-1961.
- ↑ SantaLucia JJ, Hicks D (2004). «[dx.doi.org/10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800 The thermodynamics of DNA structural motifs]». Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 33. DOI:10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800.
- ↑ SantaLucia JJ (1998). «[dx.doi.org/10.1073/pnas.95.4.1460 A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics]». Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (4): 1460–1465. DOI:10.1073/pnas.95.4.1460. PMID 9465037.
- ↑ Peyret N, Seneviratne PA, Allawi HT, SantaLucia JJ (1999). «[dx.doi.org/10.1021/bi9825091 Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal A.A, C.C, G.G, and T.T mismatches]». Biochemistry 38: 3468-3477. DOI:10.1021/bi9825091.
- ↑ Allawi HT, SantaLucia JJ (1997). «[dx.doi.org/10.1021/bi962590c Thermodynamics and NMR of internal G-T mismatches in DNA]». Biochemistry (36): 10581-10594. DOI:10.1021/bi962590c.
Ссылки
- [primerdigital.com/tools/ PrimerDigital: инструменты онлайн для ПЦР и анализ олигонуклеотидов]
- [mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt DINAMelt: предсказание температуры плавления]
- [www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/POLAND//poland.html Сервер Poland вычисляет профиль денатурации двухцепочечных гибридов РНК, ДНК или РНК/ДНК]
- [www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ OligoAnalyzer]
- [biophysics.idtdna.com Вычисление Tm, термодинамика]
- [www.biophp.org/minitools/melting_temperature/demo.php Вычисление Tm] — bioPHP.org.
- [www.dna.utah.edu/umelt/umelt.html uMelt: предсказание кривой плавления ДНК]
- [www.dna.utah.edu/hets uMelt HETS: предсказание кривой плавления ДНК]
- [rna.urmc.rochester.edu/NNDB База данных термодинамических пареметров]
Отрывок, характеризующий Гибридизация ДНК
Въехав на гору и выехав в небольшую улицу деревни, Пьер увидал в первый раз мужиков ополченцев с крестами на шапках и в белых рубашках, которые с громким говором и хохотом, оживленные и потные, что то работали направо от дороги, на огромном кургане, обросшем травою.Одни из них копали лопатами гору, другие возили по доскам землю в тачках, третьи стояли, ничего не делая.
Два офицера стояли на кургане, распоряжаясь ими. Увидав этих мужиков, очевидно, забавляющихся еще своим новым, военным положением, Пьер опять вспомнил раненых солдат в Можайске, и ему понятно стало то, что хотел выразить солдат, говоривший о том, что всем народом навалиться хотят. Вид этих работающих на поле сражения бородатых мужиков с их странными неуклюжими сапогами, с их потными шеями и кое у кого расстегнутыми косыми воротами рубах, из под которых виднелись загорелые кости ключиц, подействовал на Пьера сильнее всего того, что он видел и слышал до сих пор о торжественности и значительности настоящей минуты.
Пьер вышел из экипажа и мимо работающих ополченцев взошел на тот курган, с которого, как сказал ему доктор, было видно поле сражения.
Было часов одиннадцать утра. Солнце стояло несколько влево и сзади Пьера и ярко освещало сквозь чистый, редкий воздух огромную, амфитеатром по поднимающейся местности открывшуюся перед ним панораму.
Вверх и влево по этому амфитеатру, разрезывая его, вилась большая Смоленская дорога, шедшая через село с белой церковью, лежавшее в пятистах шагах впереди кургана и ниже его (это было Бородино). Дорога переходила под деревней через мост и через спуски и подъемы вилась все выше и выше к видневшемуся верст за шесть селению Валуеву (в нем стоял теперь Наполеон). За Валуевым дорога скрывалась в желтевшем лесу на горизонте. В лесу этом, березовом и еловом, вправо от направления дороги, блестел на солнце дальний крест и колокольня Колоцкого монастыря. По всей этой синей дали, вправо и влево от леса и дороги, в разных местах виднелись дымящиеся костры и неопределенные массы войск наших и неприятельских. Направо, по течению рек Колочи и Москвы, местность была ущелиста и гориста. Между ущельями их вдали виднелись деревни Беззубово, Захарьино. Налево местность была ровнее, были поля с хлебом, и виднелась одна дымящаяся, сожженная деревня – Семеновская.
Все, что видел Пьер направо и налево, было так неопределенно, что ни левая, ни правая сторона поля не удовлетворяла вполне его представлению. Везде было не доле сражения, которое он ожидал видеть, а поля, поляны, войска, леса, дымы костров, деревни, курганы, ручьи; и сколько ни разбирал Пьер, он в этой живой местности не мог найти позиции и не мог даже отличить ваших войск от неприятельских.
«Надо спросить у знающего», – подумал он и обратился к офицеру, с любопытством смотревшему на его невоенную огромную фигуру.
– Позвольте спросить, – обратился Пьер к офицеру, – это какая деревня впереди?
– Бурдино или как? – сказал офицер, с вопросом обращаясь к своему товарищу.
– Бородино, – поправляя, отвечал другой.
Офицер, видимо, довольный случаем поговорить, подвинулся к Пьеру.
– Там наши? – спросил Пьер.
– Да, а вон подальше и французы, – сказал офицер. – Вон они, вон видны.
– Где? где? – спросил Пьер.
– Простым глазом видно. Да вот, вот! – Офицер показал рукой на дымы, видневшиеся влево за рекой, и на лице его показалось то строгое и серьезное выражение, которое Пьер видел на многих лицах, встречавшихся ему.
– Ах, это французы! А там?.. – Пьер показал влево на курган, около которого виднелись войска.
– Это наши.
– Ах, наши! А там?.. – Пьер показал на другой далекий курган с большим деревом, подле деревни, видневшейся в ущелье, у которой тоже дымились костры и чернелось что то.
– Это опять он, – сказал офицер. (Это был Шевардинский редут.) – Вчера было наше, а теперь его.
– Так как же наша позиция?
– Позиция? – сказал офицер с улыбкой удовольствия. – Я это могу рассказать вам ясно, потому что я почти все укрепления наши строил. Вот, видите ли, центр наш в Бородине, вот тут. – Он указал на деревню с белой церковью, бывшей впереди. – Тут переправа через Колочу. Вот тут, видите, где еще в низочке ряды скошенного сена лежат, вот тут и мост. Это наш центр. Правый фланг наш вот где (он указал круто направо, далеко в ущелье), там Москва река, и там мы три редута построили очень сильные. Левый фланг… – и тут офицер остановился. – Видите ли, это трудно вам объяснить… Вчера левый фланг наш был вот там, в Шевардине, вон, видите, где дуб; а теперь мы отнесли назад левое крыло, теперь вон, вон – видите деревню и дым? – это Семеновское, да вот здесь, – он указал на курган Раевского. – Только вряд ли будет тут сраженье. Что он перевел сюда войска, это обман; он, верно, обойдет справа от Москвы. Ну, да где бы ни было, многих завтра не досчитаемся! – сказал офицер.
Старый унтер офицер, подошедший к офицеру во время его рассказа, молча ожидал конца речи своего начальника; но в этом месте он, очевидно, недовольный словами офицера, перебил его.
– За турами ехать надо, – сказал он строго.
Офицер как будто смутился, как будто он понял, что можно думать о том, сколь многих не досчитаются завтра, но не следует говорить об этом.
– Ну да, посылай третью роту опять, – поспешно сказал офицер.
– А вы кто же, не из докторов?
– Нет, я так, – отвечал Пьер. И Пьер пошел под гору опять мимо ополченцев.
– Ах, проклятые! – проговорил следовавший за ним офицер, зажимая нос и пробегая мимо работающих.
– Вон они!.. Несут, идут… Вон они… сейчас войдут… – послышались вдруг голоса, и офицеры, солдаты и ополченцы побежали вперед по дороге.
Из под горы от Бородина поднималось церковное шествие. Впереди всех по пыльной дороге стройно шла пехота с снятыми киверами и ружьями, опущенными книзу. Позади пехоты слышалось церковное пение.
Обгоняя Пьера, без шапок бежали навстречу идущим солдаты и ополченцы.
– Матушку несут! Заступницу!.. Иверскую!..
– Смоленскую матушку, – поправил другой.
Ополченцы – и те, которые были в деревне, и те, которые работали на батарее, – побросав лопаты, побежали навстречу церковному шествию. За батальоном, шедшим по пыльной дороге, шли в ризах священники, один старичок в клобуке с причтом и певчпми. За ними солдаты и офицеры несли большую, с черным ликом в окладе, икону. Это была икона, вывезенная из Смоленска и с того времени возимая за армией. За иконой, кругом ее, впереди ее, со всех сторон шли, бежали и кланялись в землю с обнаженными головами толпы военных.
Взойдя на гору, икона остановилась; державшие на полотенцах икону люди переменились, дьячки зажгли вновь кадила, и начался молебен. Жаркие лучи солнца били отвесно сверху; слабый, свежий ветерок играл волосами открытых голов и лентами, которыми была убрана икона; пение негромко раздавалось под открытым небом. Огромная толпа с открытыми головами офицеров, солдат, ополченцев окружала икону. Позади священника и дьячка, на очищенном месте, стояли чиновные люди. Один плешивый генерал с Георгием на шее стоял прямо за спиной священника и, не крестясь (очевидно, пемец), терпеливо дожидался конца молебна, который он считал нужным выслушать, вероятно, для возбуждения патриотизма русского народа. Другой генерал стоял в воинственной позе и потряхивал рукой перед грудью, оглядываясь вокруг себя. Между этим чиновным кружком Пьер, стоявший в толпе мужиков, узнал некоторых знакомых; но он не смотрел на них: все внимание его было поглощено серьезным выражением лиц в этой толпе солдат и оиолченцев, однообразно жадно смотревших на икону. Как только уставшие дьячки (певшие двадцатый молебен) начинали лениво и привычно петь: «Спаси от бед рабы твоя, богородице», и священник и дьякон подхватывали: «Яко вси по бозе к тебе прибегаем, яко нерушимой стене и предстательству», – на всех лицах вспыхивало опять то же выражение сознания торжественности наступающей минуты, которое он видел под горой в Можайске и урывками на многих и многих лицах, встреченных им в это утро; и чаще опускались головы, встряхивались волоса и слышались вздохи и удары крестов по грудям.
Толпа, окружавшая икону, вдруг раскрылась и надавила Пьера. Кто то, вероятно, очень важное лицо, судя по поспешности, с которой перед ним сторонились, подходил к иконе.
Это был Кутузов, объезжавший позицию. Он, возвращаясь к Татариновой, подошел к молебну. Пьер тотчас же узнал Кутузова по его особенной, отличавшейся от всех фигуре.
В длинном сюртуке на огромном толщиной теле, с сутуловатой спиной, с открытой белой головой и с вытекшим, белым глазом на оплывшем лице, Кутузов вошел своей ныряющей, раскачивающейся походкой в круг и остановился позади священника. Он перекрестился привычным жестом, достал рукой до земли и, тяжело вздохнув, опустил свою седую голову. За Кутузовым был Бенигсен и свита. Несмотря на присутствие главнокомандующего, обратившего на себя внимание всех высших чинов, ополченцы и солдаты, не глядя на него, продолжали молиться.
Когда кончился молебен, Кутузов подошел к иконе, тяжело опустился на колена, кланяясь в землю, и долго пытался и не мог встать от тяжести и слабости. Седая голова его подергивалась от усилий. Наконец он встал и с детски наивным вытягиванием губ приложился к иконе и опять поклонился, дотронувшись рукой до земли. Генералитет последовал его примеру; потом офицеры, и за ними, давя друг друга, топчась, пыхтя и толкаясь, с взволнованными лицами, полезли солдаты и ополченцы.
Покачиваясь от давки, охватившей его, Пьер оглядывался вокруг себя.
– Граф, Петр Кирилыч! Вы как здесь? – сказал чей то голос. Пьер оглянулся.
Борис Друбецкой, обчищая рукой коленки, которые он запачкал (вероятно, тоже прикладываясь к иконе), улыбаясь подходил к Пьеру. Борис был одет элегантно, с оттенком походной воинственности. На нем был длинный сюртук и плеть через плечо, так же, как у Кутузова.
Кутузов между тем подошел к деревне и сел в тени ближайшего дома на лавку, которую бегом принес один казак, а другой поспешно покрыл ковриком. Огромная блестящая свита окружила главнокомандующего.
Икона тронулась дальше, сопутствуемая толпой. Пьер шагах в тридцати от Кутузова остановился, разговаривая с Борисом.
Пьер объяснил свое намерение участвовать в сражении и осмотреть позицию.
– Вот как сделайте, – сказал Борис. – Je vous ferai les honneurs du camp. [Я вас буду угощать лагерем.] Лучше всего вы увидите все оттуда, где будет граф Бенигсен. Я ведь при нем состою. Я ему доложу. А если хотите объехать позицию, то поедемте с нами: мы сейчас едем на левый фланг. А потом вернемся, и милости прошу у меня ночевать, и партию составим. Вы ведь знакомы с Дмитрием Сергеичем? Он вот тут стоит, – он указал третий дом в Горках.
– Но мне бы хотелось видеть правый фланг; говорят, он очень силен, – сказал Пьер. – Я бы хотел проехать от Москвы реки и всю позицию.
– Ну, это после можете, а главный – левый фланг…
– Да, да. А где полк князя Болконского, не можете вы указать мне? – спросил Пьер.
