ДНК-гираза

ДНК-гира́за (или просто гира́за) — фермент бактерии E. coli и других прокариот, относится к группе топоизомераз, вызывающий образование отрицательных супервитков в релаксированной кольцевой молекуле ДНК. Хотя ДНК-гираза относится к топоизомеразам типа II и так же, как они, вносит двуцепочечные разрывы в ДНК, она осуществляет это без затрат энергии АТФ.

В 2007 году гираза была описана у паразитического простейшего Plasmodium falciparum из типа Апикомплексы. В отличие от гиразы E. coli, она требует затрат АТФ.

Бактериальная ДНК-гираза необходима для протекания репликации ДНК. Она является мишенью многих антибиотиков, например, налидиксовой кислоты, новобиоцина и ципрофлоксацина.

ДНК-гираза была описана в М. Геллертом с соавторами в 1976 году.

Механизм

В общих чертах механизм действия ДНК-гиразы таков. Она взаимодействует с ДНК так, что ДНК наматывается вокруг неё. В тех местах ДНК, что связаны с гиразой, возникает положительная сверхспирализация. После этого фермент вносит в ДНК двуцепочечный разрыв и переносит двойную нить с внутренней стороны на внешнюю. После этого гираза сшивает оба разрыва, превращая, таким образом, положительные супервитки в отрицательные. Скорость работы гиразы достигает около 100 супервитков в минуту.

Описанная выше модель действия ДНК-гиразы подтверждается рядом экспериментальных данных. Известно, что вокруг фермента обвивается часть ДНК длиной приблизительно 120 н. п. Точнее, гираза представляет собой тетрамер, и ДНК соединяется с ферментом в двух сайтах. Было также обнаружено, что взаимодействие ДНК и фермента не ограничивается внесением двуцепочечного разрыва: 5'-конец ДНК связывается с 122 аминокислотным остатком (тирозин) гиразы (субъединица А, см. ниже), а 3'-OH конец остаётся свободным. Поскольку связывание ДНК и гиразы является специфическим, в ДНК E. coli было обнаружено 2 специфических сайта со следующей консенсусной последовательностью: 5'-RNNNRNNRTGRYCTYNYNGNY-3'.

Было установлено, что разрыв происходит между нуклеотидами TG (выделено выше). Во всём геноме E. coli предположительно имеется порядка 45—50 крупных сайтов связывания с ДНК-гиразой, однако это не означает, что все они функциональны. Имеется также почти 10 тысяч сайтов, где имеется слабое связывания ДНК и гиразы. Это означает, что крупные сайты составляют приблизительно 0,5% от всех возможных сайтов связывания. Однако даже эти сайты в подавляющем большинстве случаев не проявляют никакой активности и работают лишь когда гираза находится в чрезвычайно высокой концентрации.

Известно, что для образования двух отрицательных супервитков (то есть для осуществления одного каталитического цикла) необходимо 2 молекулы АТФ. Однако эксперименты по работе гиразы в условиях наличия и отсутствия АТФ дали непредвиденные результаты. Как и предполагалось, наличие АТФ способствует образованию отрицательных супервитков ДНК, но в отсутствие АТФ отрицательные супервитки раскручивались. Из этого следует, что функция гиразы по внесению двуцепочечных разрывов ни активируется, ни находится в зависимости от наличия АТФ. Однако для нормальной работы гиразы АТФ всё-таки необходима.

Гираза E. coli состоит из двух субъединиц: А (GyrA) и В (GyrB). Они гомологичны белкам С и Е топоизомеразы IV, а также С- и N-концевым доменам эукариотической топоизомеразы II соответственно. Было показано, что субъединица В обладает очень слабой АТФазной активностью, которая очень сильно стимулируется наличием субстрата (то есть АТФ), ДНК и субъединицы А. Субъединица А вносит двуцепочечный разрыв (для этого процесса АТФ не нужен), субъединица В переносит одну из цепей (это осуществляется с затратой АТФ), а затем субъединица А сшивает цепи. Опытным путём было установлено, что активация фермента происходит лишь тогда, когда обе его субъединицы свяжутся с ДНК.

Биологическая роль

Как было показано выше, гираза обладает способностью релаксировать положительные супервитки, заменяя их отрицательными. Это делает гиразу чрезвычайно важной для процесса репликации ДНК. Когда по ДНК движется ДНК-полимераза, впереди фермента образуются положительные супервитки, поскольку спираль ДНК правозакручена. Создающееся таким образом напряжение препятствует дальнейшему продвижению ДНК-полимеразы. Эта проблема решается гиразой (а также топоизомеразой IV), релаксирующей положительные супервитки. Таким образом, гираза играет важную роль как в инициации, так и в элонгации и терминации репликации.

Взаимодействие с антибиотиками

Гираза имеется у прокариот и некоторых эукариот, однако у разных видов эти ферменты имеют разную аминокислотную последовательность и пространственную структуру. ДНК-гираза отсутствует у человека, в связи с чем её удобно использовать в качестве мишени для антибиотиков. Существует два класса антибиотиков, направленных на подавление гиразы:

• Аминокумарины (в том числе новобиоцин). Их действие основано на принципе конкурентного ингибирования: они связываются с АТФ-связывающим сайтом субъединицы В и тем самым нарушают работу фермента.
• Хинолоны (в том числе налидиксовая кислота и ципрофлоксацин). Хинолоны связываются с гиразой, не давая ей снимать положительные супервитки и таким образом препятствуя репликации ДНК. Устойчивые к хинолонам бактерии имеют мутантные топоизомеразы, не связывающиеся с хинолонами.

Обратная гираза

Помимо ДНК-гиразы, индуцирующей образование отрицательных супервитков, существует также обратная гираза, вызывающая образование положительных супервитков. На данный момент обратная гираза обнаружена у всех гипертермофильных организмов, в то время как ДНК-гираза обнаружена лишь у мезофилов. Обратная гираза имеется как у бактерий, так и у архей, однако ДНК-гираза обнаружена только у бактерий, хотя у галофильных архей выявлены гены, предположительно кодирующие ДНК-гиразу. Наличие обратной гиразы у термофильных архей связывают с наличием у них генетических элементов (плазмид, вирусных ДНК) в уникальной положительно закрученной форме, в то время как плазмиды мезофильных архей и бактерий отрицательно закручены.

Обратная гираза представляет собой уникальную комбинацию классической топоизомеразы I типа и белкового комплекса с хеликазными свойствами. ДНК-гираза, напротив, принадлежит к классическому семейству топоизомераз II типа, однако обладает уникальной способностью образовывать положительный тороидальный супервиток в сегменте ДНК.

Литература

• Коничев А. С., Севастьянова Г. А. Молекулярная биология. — Издательский центр «Академия», 2012. — 400 с. — ISBN 978-5-7695-9147-1.

Отрывок, характеризующий ДНК-гираза

– Что ж, али взаправду наша не взяла сила?
– А ты думал как! Гляди ко, что народ говорит.
Слышались вопросы и ответы. Целовальник, воспользовавшись увеличением толпы, отстал от народа и вернулся к своему кабаку.
Высокий малый, не замечая исчезновения своего врага целовальника, размахивая оголенной рукой, не переставал говорить, обращая тем на себя общее внимание. На него то преимущественно жался народ, предполагая от него получить разрешение занимавших всех вопросов.
– Он покажи порядок, закон покажи, на то начальство поставлено! Так ли я говорю, православные? – говорил высокий малый, чуть заметно улыбаясь.
– Он думает, и начальства нет? Разве без начальства можно? А то грабить то мало ли их.
– Что пустое говорить! – отзывалось в толпе. – Как же, так и бросят Москву то! Тебе на смех сказали, а ты и поверил. Мало ли войсков наших идет. Так его и пустили! На то начальство. Вон послушай, что народ то бает, – говорили, указывая на высокого малого.
У стены Китай города другая небольшая кучка людей окружала человека в фризовой шинели, держащего в руках бумагу.
– Указ, указ читают! Указ читают! – послышалось в толпе, и народ хлынул к чтецу.
Человек в фризовой шинели читал афишку от 31 го августа. Когда толпа окружила его, он как бы смутился, но на требование высокого малого, протеснившегося до него, он с легким дрожанием в голосе начал читать афишку сначала.
«Я завтра рано еду к светлейшему князю, – читал он (светлеющему! – торжественно, улыбаясь ртом и хмуря брови, повторил высокий малый), – чтобы с ним переговорить, действовать и помогать войскам истреблять злодеев; станем и мы из них дух… – продолжал чтец и остановился („Видал?“ – победоносно прокричал малый. – Он тебе всю дистанцию развяжет…»)… – искоренять и этих гостей к черту отправлять; я приеду назад к обеду, и примемся за дело, сделаем, доделаем и злодеев отделаем».
Последние слова были прочтены чтецом в совершенном молчании. Высокий малый грустно опустил голову. Очевидно было, что никто не понял этих последних слов. В особенности слова: «я приеду завтра к обеду», видимо, даже огорчили и чтеца и слушателей. Понимание народа было настроено на высокий лад, а это было слишком просто и ненужно понятно; это было то самое, что каждый из них мог бы сказать и что поэтому не мог говорить указ, исходящий от высшей власти.
Все стояли в унылом молчании. Высокий малый водил губами и пошатывался.
– У него спросить бы!.. Это сам и есть?.. Как же, успросил!.. А то что ж… Он укажет… – вдруг послышалось в задних рядах толпы, и общее внимание обратилось на выезжавшие на площадь дрожки полицеймейстера, сопутствуемого двумя конными драгунами.
Полицеймейстер, ездивший в это утро по приказанию графа сжигать барки и, по случаю этого поручения, выручивший большую сумму денег, находившуюся у него в эту минуту в кармане, увидав двинувшуюся к нему толпу людей, приказал кучеру остановиться.
– Что за народ? – крикнул он на людей, разрозненно и робко приближавшихся к дрожкам. – Что за народ? Я вас спрашиваю? – повторил полицеймейстер, не получавший ответа.
– Они, ваше благородие, – сказал приказный во фризовой шинели, – они, ваше высокородие, по объявлению сиятельнейшего графа, не щадя живота, желали послужить, а не то чтобы бунт какой, как сказано от сиятельнейшего графа…
– Граф не уехал, он здесь, и об вас распоряжение будет, – сказал полицеймейстер. – Пошел! – сказал он кучеру. Толпа остановилась, скучиваясь около тех, которые слышали то, что сказало начальство, и глядя на отъезжающие дрожки.
Полицеймейстер в это время испуганно оглянулся, что то сказал кучеру, и лошади его поехали быстрее.
– Обман, ребята! Веди к самому! – крикнул голос высокого малого. – Не пущай, ребята! Пущай отчет подаст! Держи! – закричали голоса, и народ бегом бросился за дрожками.
Толпа за полицеймейстером с шумным говором направилась на Лубянку.
– Что ж, господа да купцы повыехали, а мы за то и пропадаем? Что ж, мы собаки, что ль! – слышалось чаще в толпе.


Вечером 1 го сентября, после своего свидания с Кутузовым, граф Растопчин, огорченный и оскорбленный тем, что его не пригласили на военный совет, что Кутузов не обращал никакого внимания на его предложение принять участие в защите столицы, и удивленный новым открывшимся ему в лагере взглядом, при котором вопрос о спокойствии столицы и о патриотическом ее настроении оказывался не только второстепенным, но совершенно ненужным и ничтожным, – огорченный, оскорбленный и удивленный всем этим, граф Растопчин вернулся в Москву. Поужинав, граф, не раздеваясь, прилег на канапе и в первом часу был разбужен курьером, который привез ему письмо от Кутузова. В письме говорилось, что так как войска отступают на Рязанскую дорогу за Москву, то не угодно ли графу выслать полицейских чиновников, для проведения войск через город. Известие это не было новостью для Растопчина. Не только со вчерашнего свиданья с Кутузовым на Поклонной горе, но и с самого Бородинского сражения, когда все приезжавшие в Москву генералы в один голос говорили, что нельзя дать еще сражения, и когда с разрешения графа каждую ночь уже вывозили казенное имущество и жители до половины повыехали, – граф Растопчин знал, что Москва будет оставлена; но тем не менее известие это, сообщенное в форме простой записки с приказанием от Кутузова и полученное ночью, во время первого сна, удивило и раздражило графа.
Впоследствии, объясняя свою деятельность за это время, граф Растопчин в своих записках несколько раз писал, что у него тогда было две важные цели: De maintenir la tranquillite a Moscou et d'en faire partir les habitants. [Сохранить спокойствие в Москве и выпроводить из нее жителей.] Если допустить эту двоякую цель, всякое действие Растопчина оказывается безукоризненным. Для чего не вывезена московская святыня, оружие, патроны, порох, запасы хлеба, для чего тысячи жителей обмануты тем, что Москву не сдадут, и разорены? – Для того, чтобы соблюсти спокойствие в столице, отвечает объяснение графа Растопчина. Для чего вывозились кипы ненужных бумаг из присутственных мест и шар Леппиха и другие предметы? – Для того, чтобы оставить город пустым, отвечает объяснение графа Растопчина. Стоит только допустить, что что нибудь угрожало народному спокойствию, и всякое действие становится оправданным.
Все ужасы террора основывались только на заботе о народном спокойствии.
На чем же основывался страх графа Растопчина о народном спокойствии в Москве в 1812 году? Какая причина была предполагать в городе склонность к возмущению? Жители уезжали, войска, отступая, наполняли Москву. Почему должен был вследствие этого бунтовать народ?
Не только в Москве, но во всей России при вступлении неприятеля не произошло ничего похожего на возмущение. 1 го, 2 го сентября более десяти тысяч людей оставалось в Москве, и, кроме толпы, собравшейся на дворе главнокомандующего и привлеченной им самим, – ничего не было. Очевидно, что еще менее надо было ожидать волнения в народе, ежели бы после Бородинского сражения, когда оставление Москвы стало очевидно, или, по крайней мере, вероятно, – ежели бы тогда вместо того, чтобы волновать народ раздачей оружия и афишами, Растопчин принял меры к вывозу всей святыни, пороху, зарядов и денег и прямо объявил бы народу, что город оставляется.
Растопчин, пылкий, сангвинический человек, всегда вращавшийся в высших кругах администрации, хотя в с патриотическим чувством, не имел ни малейшего понятия о том народе, которым он думал управлять. С самого начала вступления неприятеля в Смоленск Растопчин в воображении своем составил для себя роль руководителя народного чувства – сердца России. Ему не только казалось (как это кажется каждому администратору), что он управлял внешними действиями жителей Москвы, но ему казалось, что он руководил их настроением посредством своих воззваний и афиш, писанных тем ёрническим языком, который в своей среде презирает народ и которого он не понимает, когда слышит его сверху. Красивая роль руководителя народного чувства так понравилась Растопчину, он так сжился с нею, что необходимость выйти из этой роли, необходимость оставления Москвы без всякого героического эффекта застала его врасплох, и он вдруг потерял из под ног почву, на которой стоял, в решительно не знал, что ему делать. Он хотя и знал, но не верил всею душою до последней минуты в оставление Москвы и ничего не делал с этой целью. Жители выезжали против его желания. Ежели вывозили присутственные места, то только по требованию чиновников, с которыми неохотно соглашался граф. Сам же он был занят только тою ролью, которую он для себя сделал. Как это часто бывает с людьми, одаренными пылким воображением, он знал уже давно, что Москву оставят, но знал только по рассуждению, но всей душой не верил в это, не перенесся воображением в это новое положение.