ДНК-маркер

Поделись знанием:
(перенаправлено с «ДНК-маркёр»)
Перейти к: навигация, поиск

ДНК-ма́ркеры (ДНК-маркёры) или молекулярно-генетические маркеры, полиморфный признак, выявляемый методами молекулярной биологии на уровне нуклеотидной последовательности ДНК, для определенного гена или для любого другого участка хромосомы при сравнении различных генотипов, особей, пород, сортов, линий.

За последние годы накопился большой массив данных об эффективности использования молекулярно-генетических маркеров, как на уровне белков, так и ДНК, РНК, для решения многих задач генетики, селекции, сохранения биоразнообразия, изучения механизмов эволюции, картирования хромосом, а также для семеноводства и племенного дела.

Наиболее широко используемые молекулярно-генетические маркеры условно можно подразделить на следующие типы — маркеры участков структурных генов, кодирующих аминокислотные последовательности белков (электрофоретические варианты белков), маркеры некодирующих участков структурных генов и маркеры различных последовательностей ДНК, отношение которых к структурным генам, как правило, неизвестно — распределение коротких повторов по геному (RAPD — случайно амплифицируемая полиморфная ДНК; ISSR — инвертированные повторы; AFLP — полиморфизм в сайтах рестрикции) и микросателлитные локусы (тандемные повторы с длиной элементарной единицы в 2-6 нуклеотидов).

Имеется целый набор современных технологий выявления полиморфизма на уровне ДНК, среди которых можно выделить следующие:



Маркеры на основе ДНК-зондов

  • RFLP (ПДРФ-маркеры) — Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов. ПДРФ — оценка полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК может быть осуществлена разными способами, но наиболее традиционен метод с использованием блот-гибридизации)[1]. Этот метод включает в себя выделение ДНК, получение фрагментов рестрикции, их электрофоретическое разделение, перенос на фильтры с последующей гибридизацией специфических ДНК-зондов с полученными фрагментами ДНК. ДНК-зонд — относительно короткая последовательность клонированной ДНК с определенным уровнем гомологии и способностью гибридизоваться с соответствующим участком геномной ДНК. Комбинации рестриктаз и зондов дают высоко-воспроизводимые полиморфные спектры фрагментов ДНК, специфичные для каждого индивидуума. Различия между последними могут быть обусловлены, например, мутациями, меняющими сайт рестрикции. ПДРФ имеет ряд важных преимуществ, в числе которых высокая воспроизводимость спектров в разных лабораториях, кодоминантное «поведение» маркера. ПДРФ эффективен при картировании генома, маркировании генов многих биологических и экономически важных признаков.
  • VNTR — (англ. Variable Number Tandem Repeat), метод получил название ДНК фингерпринта (отпечатки пальцев)[2]. Тандемные повторы широко распространены в разных геномах и высокополиморфны. В результате высокой вариабельности этих участков ДНК ПДРФ-анализ с зондами к микро- и минисателитным последовательностям позволяет получать мультилокусные спектры с высоким разрешением на популяционном уровне. Благодаря очень высокому уровню полиморфизма этот подход в настоящее время является хорошим инструментом для анализа внутри- и межпопуляционной изменчивости и определения генетических расстояний между группами организмов. VNTR-аллельные варианты имеют кодоминантный характер наследования.

ПЦР-маркеры

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК-продуктов амплификации отдельных участков геномной ДНК. Большое количество родственных технологий построено на этом принципе. Наиболее широко используемая RAPD технология основана на анализе амплифицированных полиморфных фрагментов ДНК с помощью единичных праймеров с произвольной нуклеотидной последовательностью[3],[4],[5].

  • SSR — (англ. Simple Sequence Repeats), ПЦР с флангирующими праймерами к короткому мини или микросателитному повтору позволяет выявлять маркеры с кодоминантным наследованием и, соответственно, удобен для выявления гетерозигот по данному локусу. Однако, одна пара праймеров для флангов в ПЦР позволяет рассматривать полиморфизм только одного локуса. Для многих микросателлитных локусов не удается выявить полиморфизм. Как правило, фланкирующие последовательности для данного микросателлитного локуса оказываются видоспецифичными.
  • RAPD — англ. Random Amplified Polymorphic DNA), полимеразная цепная реакция с использованием единичного короткого, обычно, 10-членным праймеров, с произвольной нуклеотидной последовательностью[6],[7]. Последовательность праймеров не абсолютно любая, а ограничена в пределах 40-70 % GC-состав и 50-100 % лингвистической сложности нуклеотидной последовательности. В RAPD можно использовать как одиночный праймер, так и несколько RAPD праймеров. Продукт RAPD образуется в результате амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкированной инвертированной последовательностью используемого праймера. Метод универсален для исследований разных видов, при использовании одних и те же праймеров. Как правило, праймер выявляющий высокий полиморфизм для одного вида, будет также эффективен и для других видов.
  • ISSR — (англ. Inter Simple Sequence Repeats)[8],[9], специализированный вариант RAPD метода, в котором праймер состоит из микросателлитной последовательности. В этом методе, также как и в RAPD, используется один или несколько праймеров, длиной в 15-24 нуклеотида. Но в данном случае, праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов, например: 5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA G и одним или двумя селективными нуклеотидами на 3’-конце праймера. Продукты ISSR амплификации содержат на флангах инвертированную микросателлитную последовательность праймера. Так как в данном методе последовательность праймеров специфична и подбирается более строго, чем в RAPD, поэтому, температуру отжига в ПЦР можно проводить выше (55-60°С), чем для RAPD метода, а поэтому фингерпринт, обычно, лучше воспроизводим.
  • AFLP — (англ. Amplified Fragment Length Polymorphism)[10], технология представляет собой комбинацию между ПДРФ и ПЦР методов. AFLP — сложный метод и состоит из нескольких этапов: геномная ДНК одновременно рестрицируется двумя рестриктазами (EcoRI и MseI), узнающими 4 и 6 оснований, соответственно, получая фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная геномная ДНК лигируется с адаптором, содержащим «липкие» концы для рестрикционных сайтов (EcoRI и MseI). После этого проводится две последовательные ПЦР. В первой ПЦР (преамплификация) используются праймеры полностью комплементарные адапторам EcoRI и MseI. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации между EcoRI и MseI адапторами, которые трудно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому, во второй ПЦР, праймеры с EcoRI и MseI адапторами содержат на 3’-конце дополнительные и не комплементарные адапторам от 1 до 3 основания, для селективной амплификации. Разделение фрагментов ДНК выполняется в полиакриламидном геле, с радиоактивной или флюоресцентной меткой, соответственно.
  • SSAP — (англ. Sequence Specific Amplification Polymorphism)[11] явился модификацией метода AFLP, для выявления полиморфизма как по сайту рестрикции, так и по вставки в геномную ДНК транспозона или ретротранспозона. Геномная ДНК исследуемых образцов расщепляется рестриктазами PstI и MseI, получаются фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная ДНК лигируется с PstI и MseI адапторами. Первая полимеразная цепная реакция (преамплификация) проводится с праймерами от PstI и МseI адапторов, то есть амплифицируются все возможные комбинации сочетания этих адапторов в рестрицированной геномной ДНК. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации фрагментов ДНК, локализованных между праймерами и адапторами. ПЦР продукты разбавляются и используются для второй, селективной ПЦР. Вторая ПЦР проводится с меченным праймером к LTR и любым праймером адапторов, либо с PstI или MseI. Во второй ПЦР можно использовать праймеры к адаптору с дополнительными нуклеотидами на 3'-конце, например, один, два или три нуклеотида, не комплементарные адаптору. Электрофорез после второй ПЦР проводят в полиакриламидном геле или в секвенаторе, если использовалась флюоресцентная метка. Продукты амплификации после второй ПЦР образуются в результате амплификации фрагмента ДНК между последовательностью LTR ретротранспозона и адаптором. Получение продуктов амплификации между только LTR последовательностями принципиально возможен, но, как правило, расстояние между двумя ретротранпозонами длиннее обычно получаемых размеров ПЦР продуктов (2500 — 3000 пар оснований). А продукты амплификации между адапторами не будут выявляться, поскольку используется метка только для LTR праймера.
  • [www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/irap-remap.html IRAP] — (англ. Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism)[12],[13], полимеразная цепная реакция между праймерами, комплементарными последовательностям двух рядом расположенных LTR ретротранспозона. Метод имеет несколько вариантов. В первом варианте IRAP используется единичный праймер из LTR. Продукты амплификации образуются между двумя инвертированными LTR с одинаковой последовательностью, то есть в одной цепи 5’-конец одного LTR ориентирован к 3’-концу другого LTR. Если центральная часть ретротрапозона длинее обычного размера ПЦР продуктов (около 3000 пар оснований), то ПЦР будет проходить только между двумя LTR из разных ретротранспозиций. В этом случае соседние LTR должны располагаться в инвертирванном положении. В другом варианте IRAP используются два разных праймера к ивертированным LTR: один праймер с 5’-конца, а другой с 3’-конца LTR, ориентированые в разные стороны от ретротранспозона. В данном случае соседние LTR располагаются как прямые длинные повторы. И, наконец, в третьем варианте IRAP используются праймеры к LTR из разных ретротрапозонов в различной ориентации. Можно комбинировать праймеры из LTR с другими праймерами из повторяющейся ДНК.
  • REMAP — (англ. Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism)[12],[13], полимеразная цепная реакция между праймером к фрагменту LTR ретротранспозона и праймером из рядом расположенного, простого микросателлитного повтора (ISSR праймер). В данном случае позиция амплифицируемого фрагмента ретротранспозона «заякоривается» путём использования праймера к микросателлитному локусу. Например, у растений удобным оказывается использование праймера к LTR и праймера к микросателлиту (5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G) c единичным селективным нуклеотидом на 3’-конце праймера. В REMAP применяют варианты LTR праймеров как для 5’-конца, так и для 3’-конца LTR, как и в IRAP.
  • RBIP — (англ. Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms)[14], метод, основанный на использовании праймеров к последовательностям ретротранспозонов и выявляющий кодоминантные аллельные варианты. Его принцип основан на мультилокусной ПЦР, в которой используются пара праймеров, фланкирующих участок ДНК до ретротранспозиции и праймер к LTR ретротранспозона, который встроен в данный участок между первыми двумя праймерами. В результате ПЦР будет амлифицироваться один из вариантов фрагментов, фланкированных парой праймеров, поскольку последовательность между LTR слишком длинная для ПЦР между сайтами геномной ДНК с ретротранспозоном внутри. Этот метод выявляет полиморфизм только для данного полиморфного локуса. К его достоинствам относят кодоминантность полиморфных вариантов, возможность использования для дот-блот анализа большого количества сортов.
  • iPBS — (англ. inter PBS amplification)[15], метод, основанный на использовании праймеров к PBS (англ. [en.wikipedia.org/wiki/Primer_binding_site Primer Binding Site], участок связывания тРНК) последовательностям ретротранспозонов. Метод эффективен для выявления полиморфизма между образцами, а также для клонирования новых ретротранспозонов у эукариот.
  • Однонуклеотидный полиморфизм (SNP).

Напишите отзыв о статье "ДНК-маркер"

Примечания

  1. Southern EM (1974). «[dx.doi.org/10.1016/S0022-2836(75)80083-0 Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis]». J Mol Biol 98 (3): 503-517. DOI:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.
  2. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SW (1984). «[dx.doi.org/10.1038/314067a0 Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA]». Nature 314: 67-73. DOI:10.1038/314067a0.
  3. Kalendar R (2011). «[www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/fvcr48_261.pdf The use of retrotransposon-based molecular markers to analyze genetic diversity]». Field and Vegetable Crops Research 48 (2): 261-274. DOI:10.5937/ratpov1102261K.
  4. Kalendar R, Flavell A, Ellis THN, Sjakste T, Moisy C, Schulman AH (2011). «[www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/hdy201093a.pdf Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular markers]». Heredity 106: 520-530. DOI:10.1038/hdy.2010.93.
  5. Календарь РН, Глазко ВИ (2002). «[commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Markers.pdf Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение]». Физиология и биохимия культурных растений 34 (4): 141-156.
  6. Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990). «[dx.doi.org/10.1093/nar/18.22.6531 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers]». Nucleic Acids Research 18 (22): 6531-6535. DOI:10.1093/nar/18.22.6531.
  7. Welsh J, McClelland M (1990). «[dx.doi.org/10.1093/nar/18.24.7213 Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers]». Nucleic Acids Research 18: 7213-7218. DOI:10.1093/nar/18.24.7213.
  8. Сиволап ЮМ, Календарь РН, Чеботарь СВ (1994). «[www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/zyt.pdf Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами]». Цитология и Генетика 28: 54-61.
  9. Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D (1994). «[dx.doi.org/10.1006/geno.1994.1151 Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification]». Genomics 20 (2): 176-183. DOI:10.1006/geno.1994.1151.
  10. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, et al. (1995). «[dx.doi.org/10.1093/nar/23.21.4407 AFLP: a new technique for DNA fingerprinting]». Nucleic Acids Research 23: 4407-4414. DOI:10.1093/nar/23.21.4407.
  11. Waugh R, McLean K, Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A, Thomas BB, Powell W (1997). «[dx.doi.org/10.1007/s004380050372 Genetic distribution of Bare-1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (S-SAP)]». Molecular General Genetics 253 (6): 687-694. DOI:10.1007/s004380050372.
  12. 1 2 Kalendar R, Grob T, Regina M, Suoniemi A, Schulman AH (1999). «[www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/IRAP-REM.PDF IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques]». Theoretical and Applied Genetics 98: 704-711. DOI:10.1007/s001220051124.
  13. 1 2 Kalendar R, Schulman AH (2006). «[www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/nprot.2006.377.pdf IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting]». Nature Protocols 1 (5): 2478-2484. DOI:10.1038/nprot.2006.377.
  14. Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN (1998). «[dx.doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x Retrotransposon-based insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput marker analysis]». The Plant Journal 16 (5): 643-650. DOI:10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x.
  15. Kalendar R, Antonius K, Smykal P, Schulman AH (2010). «[www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/PBS.pdf iPBS: A universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation]». Theoretical and Applied Genetics 121 (8): 1419-1430. DOI:10.1007/s00122-010-1398-2.

Отрывок, характеризующий ДНК-маркер

– Ну знаете, и прекрасно, и подите к ней.
– Соооня! Одно слово! Можно ли так мучить меня и себя из за фантазии? – говорил Николай, взяв ее за руку.
Соня не вырывала у него руки и перестала плакать.
Наташа, не шевелясь и не дыша, блестящими главами смотрела из своей засады. «Что теперь будет»? думала она.
– Соня! Мне весь мир не нужен! Ты одна для меня всё, – говорил Николай. – Я докажу тебе.
– Я не люблю, когда ты так говоришь.
– Ну не буду, ну прости, Соня! – Он притянул ее к себе и поцеловал.
«Ах, как хорошо!» подумала Наташа, и когда Соня с Николаем вышли из комнаты, она пошла за ними и вызвала к себе Бориса.
– Борис, подите сюда, – сказала она с значительным и хитрым видом. – Мне нужно сказать вам одну вещь. Сюда, сюда, – сказала она и привела его в цветочную на то место между кадок, где она была спрятана. Борис, улыбаясь, шел за нею.
– Какая же это одна вещь ? – спросил он.
Она смутилась, оглянулась вокруг себя и, увидев брошенную на кадке свою куклу, взяла ее в руки.
– Поцелуйте куклу, – сказала она.
Борис внимательным, ласковым взглядом смотрел в ее оживленное лицо и ничего не отвечал.
– Не хотите? Ну, так подите сюда, – сказала она и глубже ушла в цветы и бросила куклу. – Ближе, ближе! – шептала она. Она поймала руками офицера за обшлага, и в покрасневшем лице ее видны были торжественность и страх.
– А меня хотите поцеловать? – прошептала она чуть слышно, исподлобья глядя на него, улыбаясь и чуть не плача от волненья.
Борис покраснел.
– Какая вы смешная! – проговорил он, нагибаясь к ней, еще более краснея, но ничего не предпринимая и выжидая.
Она вдруг вскочила на кадку, так что стала выше его, обняла его обеими руками, так что тонкие голые ручки согнулись выше его шеи и, откинув движением головы волосы назад, поцеловала его в самые губы.
Она проскользнула между горшками на другую сторону цветов и, опустив голову, остановилась.
– Наташа, – сказал он, – вы знаете, что я люблю вас, но…
– Вы влюблены в меня? – перебила его Наташа.
– Да, влюблен, но, пожалуйста, не будем делать того, что сейчас… Еще четыре года… Тогда я буду просить вашей руки.
Наташа подумала.
– Тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать… – сказала она, считая по тоненьким пальчикам. – Хорошо! Так кончено?
И улыбка радости и успокоения осветила ее оживленное лицо.
– Кончено! – сказал Борис.
– Навсегда? – сказала девочка. – До самой смерти?
И, взяв его под руку, она с счастливым лицом тихо пошла с ним рядом в диванную.


Графиня так устала от визитов, что не велела принимать больше никого, и швейцару приказано было только звать непременно кушать всех, кто будет еще приезжать с поздравлениями. Графине хотелось с глазу на глаз поговорить с другом своего детства, княгиней Анной Михайловной, которую она не видала хорошенько с ее приезда из Петербурга. Анна Михайловна, с своим исплаканным и приятным лицом, подвинулась ближе к креслу графини.
– С тобой я буду совершенно откровенна, – сказала Анна Михайловна. – Уж мало нас осталось, старых друзей! От этого я так и дорожу твоею дружбой.
Анна Михайловна посмотрела на Веру и остановилась. Графиня пожала руку своему другу.
– Вера, – сказала графиня, обращаясь к старшей дочери, очевидно, нелюбимой. – Как у вас ни на что понятия нет? Разве ты не чувствуешь, что ты здесь лишняя? Поди к сестрам, или…
Красивая Вера презрительно улыбнулась, видимо не чувствуя ни малейшего оскорбления.
– Ежели бы вы мне сказали давно, маменька, я бы тотчас ушла, – сказала она, и пошла в свою комнату.
Но, проходя мимо диванной, она заметила, что в ней у двух окошек симметрично сидели две пары. Она остановилась и презрительно улыбнулась. Соня сидела близко подле Николая, который переписывал ей стихи, в первый раз сочиненные им. Борис с Наташей сидели у другого окна и замолчали, когда вошла Вера. Соня и Наташа с виноватыми и счастливыми лицами взглянули на Веру.
Весело и трогательно было смотреть на этих влюбленных девочек, но вид их, очевидно, не возбуждал в Вере приятного чувства.
– Сколько раз я вас просила, – сказала она, – не брать моих вещей, у вас есть своя комната.
Она взяла от Николая чернильницу.
– Сейчас, сейчас, – сказал он, мокая перо.
– Вы всё умеете делать не во время, – сказала Вера. – То прибежали в гостиную, так что всем совестно сделалось за вас.
Несмотря на то, или именно потому, что сказанное ею было совершенно справедливо, никто ей не отвечал, и все четверо только переглядывались между собой. Она медлила в комнате с чернильницей в руке.
– И какие могут быть в ваши года секреты между Наташей и Борисом и между вами, – всё одни глупости!
– Ну, что тебе за дело, Вера? – тихеньким голоском, заступнически проговорила Наташа.
Она, видимо, была ко всем еще более, чем всегда, в этот день добра и ласкова.
– Очень глупо, – сказала Вера, – мне совестно за вас. Что за секреты?…
– У каждого свои секреты. Мы тебя с Бергом не трогаем, – сказала Наташа разгорячаясь.
– Я думаю, не трогаете, – сказала Вера, – потому что в моих поступках никогда ничего не может быть дурного. А вот я маменьке скажу, как ты с Борисом обходишься.
– Наталья Ильинишна очень хорошо со мной обходится, – сказал Борис. – Я не могу жаловаться, – сказал он.
– Оставьте, Борис, вы такой дипломат (слово дипломат было в большом ходу у детей в том особом значении, какое они придавали этому слову); даже скучно, – сказала Наташа оскорбленным, дрожащим голосом. – За что она ко мне пристает? Ты этого никогда не поймешь, – сказала она, обращаясь к Вере, – потому что ты никогда никого не любила; у тебя сердца нет, ты только madame de Genlis [мадам Жанлис] (это прозвище, считавшееся очень обидным, было дано Вере Николаем), и твое первое удовольствие – делать неприятности другим. Ты кокетничай с Бергом, сколько хочешь, – проговорила она скоро.
– Да уж я верно не стану перед гостями бегать за молодым человеком…
– Ну, добилась своего, – вмешался Николай, – наговорила всем неприятностей, расстроила всех. Пойдемте в детскую.
Все четверо, как спугнутая стая птиц, поднялись и пошли из комнаты.
– Мне наговорили неприятностей, а я никому ничего, – сказала Вера.
– Madame de Genlis! Madame de Genlis! – проговорили смеющиеся голоса из за двери.
Красивая Вера, производившая на всех такое раздражающее, неприятное действие, улыбнулась и видимо не затронутая тем, что ей было сказано, подошла к зеркалу и оправила шарф и прическу. Глядя на свое красивое лицо, она стала, повидимому, еще холоднее и спокойнее.

В гостиной продолжался разговор.
– Ah! chere, – говорила графиня, – и в моей жизни tout n'est pas rose. Разве я не вижу, что du train, que nous allons, [не всё розы. – при нашем образе жизни,] нашего состояния нам не надолго! И всё это клуб, и его доброта. В деревне мы живем, разве мы отдыхаем? Театры, охоты и Бог знает что. Да что обо мне говорить! Ну, как же ты это всё устроила? Я часто на тебя удивляюсь, Annette, как это ты, в свои годы, скачешь в повозке одна, в Москву, в Петербург, ко всем министрам, ко всей знати, со всеми умеешь обойтись, удивляюсь! Ну, как же это устроилось? Вот я ничего этого не умею.
– Ах, душа моя! – отвечала княгиня Анна Михайловна. – Не дай Бог тебе узнать, как тяжело остаться вдовой без подпоры и с сыном, которого любишь до обожания. Всему научишься, – продолжала она с некоторою гордостью. – Процесс мой меня научил. Ежели мне нужно видеть кого нибудь из этих тузов, я пишу записку: «princesse une telle [княгиня такая то] желает видеть такого то» и еду сама на извозчике хоть два, хоть три раза, хоть четыре, до тех пор, пока не добьюсь того, что мне надо. Мне всё равно, что бы обо мне ни думали.
– Ну, как же, кого ты просила о Бореньке? – спросила графиня. – Ведь вот твой уже офицер гвардии, а Николушка идет юнкером. Некому похлопотать. Ты кого просила?
– Князя Василия. Он был очень мил. Сейчас на всё согласился, доложил государю, – говорила княгиня Анна Михайловна с восторгом, совершенно забыв всё унижение, через которое она прошла для достижения своей цели.
– Что он постарел, князь Василий? – спросила графиня. – Я его не видала с наших театров у Румянцевых. И думаю, забыл про меня. Il me faisait la cour, [Он за мной волочился,] – вспомнила графиня с улыбкой.
– Всё такой же, – отвечала Анна Михайловна, – любезен, рассыпается. Les grandeurs ne lui ont pas touriene la tete du tout. [Высокое положение не вскружило ему головы нисколько.] «Я жалею, что слишком мало могу вам сделать, милая княгиня, – он мне говорит, – приказывайте». Нет, он славный человек и родной прекрасный. Но ты знаешь, Nathalieie, мою любовь к сыну. Я не знаю, чего я не сделала бы для его счастья. А обстоятельства мои до того дурны, – продолжала Анна Михайловна с грустью и понижая голос, – до того дурны, что я теперь в самом ужасном положении. Мой несчастный процесс съедает всё, что я имею, и не подвигается. У меня нет, можешь себе представить, a la lettre [буквально] нет гривенника денег, и я не знаю, на что обмундировать Бориса. – Она вынула платок и заплакала. – Мне нужно пятьсот рублей, а у меня одна двадцатипятирублевая бумажка. Я в таком положении… Одна моя надежда теперь на графа Кирилла Владимировича Безухова. Ежели он не захочет поддержать своего крестника, – ведь он крестил Борю, – и назначить ему что нибудь на содержание, то все мои хлопоты пропадут: мне не на что будет обмундировать его.
Графиня прослезилась и молча соображала что то.
– Часто думаю, может, это и грех, – сказала княгиня, – а часто думаю: вот граф Кирилл Владимирович Безухой живет один… это огромное состояние… и для чего живет? Ему жизнь в тягость, а Боре только начинать жить.
– Он, верно, оставит что нибудь Борису, – сказала графиня.
– Бог знает, chere amie! [милый друг!] Эти богачи и вельможи такие эгоисты. Но я всё таки поеду сейчас к нему с Борисом и прямо скажу, в чем дело. Пускай обо мне думают, что хотят, мне, право, всё равно, когда судьба сына зависит от этого. – Княгиня поднялась. – Теперь два часа, а в четыре часа вы обедаете. Я успею съездить.
И с приемами петербургской деловой барыни, умеющей пользоваться временем, Анна Михайловна послала за сыном и вместе с ним вышла в переднюю.
– Прощай, душа моя, – сказала она графине, которая провожала ее до двери, – пожелай мне успеха, – прибавила она шопотом от сына.
– Вы к графу Кириллу Владимировичу, ma chere? – сказал граф из столовой, выходя тоже в переднюю. – Коли ему лучше, зовите Пьера ко мне обедать. Ведь он у меня бывал, с детьми танцовал. Зовите непременно, ma chere. Ну, посмотрим, как то отличится нынче Тарас. Говорит, что у графа Орлова такого обеда не бывало, какой у нас будет.


– Mon cher Boris, [Дорогой Борис,] – сказала княгиня Анна Михайловна сыну, когда карета графини Ростовой, в которой они сидели, проехала по устланной соломой улице и въехала на широкий двор графа Кирилла Владимировича Безухого. – Mon cher Boris, – сказала мать, выпрастывая руку из под старого салопа и робким и ласковым движением кладя ее на руку сына, – будь ласков, будь внимателен. Граф Кирилл Владимирович всё таки тебе крестный отец, и от него зависит твоя будущая судьба. Помни это, mon cher, будь мил, как ты умеешь быть…
– Ежели бы я знал, что из этого выйдет что нибудь, кроме унижения… – отвечал сын холодно. – Но я обещал вам и делаю это для вас.
Несмотря на то, что чья то карета стояла у подъезда, швейцар, оглядев мать с сыном (которые, не приказывая докладывать о себе, прямо вошли в стеклянные сени между двумя рядами статуй в нишах), значительно посмотрев на старенький салоп, спросил, кого им угодно, княжен или графа, и, узнав, что графа, сказал, что их сиятельству нынче хуже и их сиятельство никого не принимают.
– Мы можем уехать, – сказал сын по французски.
– Mon ami! [Друг мой!] – сказала мать умоляющим голосом, опять дотрогиваясь до руки сына, как будто это прикосновение могло успокоивать или возбуждать его.
Борис замолчал и, не снимая шинели, вопросительно смотрел на мать.
– Голубчик, – нежным голоском сказала Анна Михайловна, обращаясь к швейцару, – я знаю, что граф Кирилл Владимирович очень болен… я затем и приехала… я родственница… Я не буду беспокоить, голубчик… А мне бы только надо увидать князя Василия Сергеевича: ведь он здесь стоит. Доложи, пожалуйста.
Швейцар угрюмо дернул снурок наверх и отвернулся.
– Княгиня Друбецкая к князю Василию Сергеевичу, – крикнул он сбежавшему сверху и из под выступа лестницы выглядывавшему официанту в чулках, башмаках и фраке.
Мать расправила складки своего крашеного шелкового платья, посмотрелась в цельное венецианское зеркало в стене и бодро в своих стоптанных башмаках пошла вверх по ковру лестницы.
– Mon cher, voue m'avez promis, [Мой друг, ты мне обещал,] – обратилась она опять к Сыну, прикосновением руки возбуждая его.
Сын, опустив глаза, спокойно шел за нею.
Они вошли в залу, из которой одна дверь вела в покои, отведенные князю Василью.
В то время как мать с сыном, выйдя на середину комнаты, намеревались спросить дорогу у вскочившего при их входе старого официанта, у одной из дверей повернулась бронзовая ручка и князь Василий в бархатной шубке, с одною звездой, по домашнему, вышел, провожая красивого черноволосого мужчину. Мужчина этот был знаменитый петербургский доктор Lorrain.
– C'est donc positif? [Итак, это верно?] – говорил князь.
– Mon prince, «errare humanum est», mais… [Князь, человеку ошибаться свойственно.] – отвечал доктор, грассируя и произнося латинские слова французским выговором.
– C'est bien, c'est bien… [Хорошо, хорошо…]
Заметив Анну Михайловну с сыном, князь Василий поклоном отпустил доктора и молча, но с вопросительным видом, подошел к ним. Сын заметил, как вдруг глубокая горесть выразилась в глазах его матери, и слегка улыбнулся.
– Да, в каких грустных обстоятельствах пришлось нам видеться, князь… Ну, что наш дорогой больной? – сказала она, как будто не замечая холодного, оскорбительного, устремленного на нее взгляда.
Князь Василий вопросительно, до недоумения, посмотрел на нее, потом на Бориса. Борис учтиво поклонился. Князь Василий, не отвечая на поклон, отвернулся к Анне Михайловне и на ее вопрос отвечал движением головы и губ, которое означало самую плохую надежду для больного.
– Неужели? – воскликнула Анна Михайловна. – Ах, это ужасно! Страшно подумать… Это мой сын, – прибавила она, указывая на Бориса. – Он сам хотел благодарить вас.
Борис еще раз учтиво поклонился.
– Верьте, князь, что сердце матери никогда не забудет того, что вы сделали для нас.
– Я рад, что мог сделать вам приятное, любезная моя Анна Михайловна, – сказал князь Василий, оправляя жабо и в жесте и голосе проявляя здесь, в Москве, перед покровительствуемою Анною Михайловной еще гораздо большую важность, чем в Петербурге, на вечере у Annette Шерер.
– Старайтесь служить хорошо и быть достойным, – прибавил он, строго обращаясь к Борису. – Я рад… Вы здесь в отпуску? – продиктовал он своим бесстрастным тоном.
– Жду приказа, ваше сиятельство, чтоб отправиться по новому назначению, – отвечал Борис, не выказывая ни досады за резкий тон князя, ни желания вступить в разговор, но так спокойно и почтительно, что князь пристально поглядел на него.
– Вы живете с матушкой?