ДНК-микрочип
ДНК-микрочип (англ. DNA microarray) — технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. Современный ДНК-микрочип состоит из тысяч дезоксиолигонуклеотидов (зондов, или проб), сгруппированных в виде микроскопических точек и закреплённых на твёрдой подложке. Каждая точка содержит несколько пикомолей ДНК с определённой нуклеотидной последовательностью. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа могут быть короткими участками генов или других функциональных элементов ДНК и используются для гибридизации с кДНК или мРНК (кРНК). Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно характеризуется при помощи флюоресценции или хемилюминесценции, что позволяет определять относительное количество нуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.
В обычном ДНК-микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твёрдой поверхности — стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твёрдых поверхностей.
ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.
Содержание
История
Технология ДНК-микрочипов берёт начало от Саузерн блоттинга — методики, в которой фрагментированную ДНК переносят на подходящий носитель и затем с помощью зонда с известной нуклеотидной последовательностью определяют содержание целевой последовательности в образце. Впервые набор различных ДНК, объединённых в чип, был использован в 1987 году для определения особенностей регуляции экспрессии генов интерферонами[1]. Ранние ДНК-микрочипы были сделаны путём «раскапывания» микроколичеств кДНК на фильтровальную бумагу. Использование миниатюрных чипов для определения особенностей экспрессии генов было осуществлено в 1995 году[2] и полный эукариотический геном (Saccharomyces cerevisiae) был размещён на микрочипе в 1997 году[3].
Типы микрочипов
Printed (spotted) microarrays
"В этих ДНК-чипах пробы были изготовлены с помощью химического синтеза олигонуклеотидов и затем крепится к элементам массива. Пробы наносились иглой в наперед заданные точки подложки или печатались на мелкую сетку подложки принтером, который использовал ту же технологию печати, что и струйный принтер, но вместо капель чернил использовались капли проб нано- или пиколитрового объема."[4][5]
In-situ synthesized
"Такие микрочипы сделаны с использованием фотолитографии. Процесс выглядит следующим образом: на подложке находятся ковалентные молекулы-линкеры с защитной группой на свободном конце, которая может быть удалена с помощью света. УФ-свет направляется через фотолитографическую маску, снимает защиту и активирует выбранные сайты с гидроксильными группами, которые инициируют сцепление с защищенными нуклеотидами, которые крепятся к активированным сайтам. Маска разработана таким образом, что можно выбрать сайты экспозиции, и, таким образом, определить координаты в массиве, в которых нуклеотид будет прикреплена. Процесс повторяется, применяется новая маска, активизируя различные наборы сайтов и различные основания, позволяющих необходимым ДНК-пробам быть синтезированным на каждом сайте. Каждая проба на чипе требует четыре маски за раунд синтеза: одну маску для синтеза и три другие маски, чтобы предотвратить снятие защиты в том же месте в то время, как добавляются три других три нуклеотида. В среднем, каждая проба длиной в 25 нуклеотидов требует около 100 масок на чип. Такие микрочипы, как правило, используют несколько проб для каждого гена для повышения специфичности и поиска снипов."[4][5]
High-density bead arrays
«Технология [www.illumina.com/technology/beadarray_technology.ilmn Illumina BeadArray] основана на цветокодированных 3-мкм кварцевых бусинах, которые случайным образом распределяются на слайде из кварцевого стекла или субстрате из волоконно-оптических пучков, который собираются в массив. Бусины расположены друг от друга на расстоянии 5.7 мкм и, таким образом, достигается с плотностью упаковки в 40000 элементов массива на квадратный миллиметр. Каждая бусина покрыта сотнями тысяч копий специфической олигонуклеотидной последовательности, с которой гибридизуется анализируемая последовательности. Каждый шарик имеет адрес из 23 олигонуклеотидов и пробу длиной в 50 олигонуклеотидов.
В процессе производства массива бусины случайным образом распределяются по субстрату таким образом, что в каждый массив попадает 50000 бусин. Каждый ген представлен двумя последовательностями проб. Серия декодирующей гибридизации используются, чтобы определить, какие олигонуклеотиды присутствуют в каких координатах для каждого массива.»[4][5]
Декодирование BeadArray
Стеклянным шарикам в массиве присвоены адреса. Адрес состоит из последовательности флуоресцентно-помеченных олигонуклеотидов, каждый из которых может иметь три значения — 0 (OFF), 1 (ON — [en.wikipedia.org/wiki/Fluorescein_amidite FAM]), 2 (ON — [en.wikipedia.org/wiki/Cyanine#Cy3_and_Cy5 Cy3]). Самыми частыми ошибками являются ошибке перехода одного из состояний ON в состояние OFF, более редкими — состояния OFF в состояние ON. Самыми редкими являются ошибки перехода одного состояния ON в другое, так как они являются сочетанием двух ошибок — неправильного распознавания одного из состояний ON на одном канале и, в то же время, неправильным распознаванием сигнала ON как сигнала OFF. Для проверки корректности используется код, схожий с кодом Хэмминга. Например, для адреса длиной восемь олигонуклеотидов, в расшифрованном адресе должно быть ровно шесть состояний ON и два состояния OFF. Таким образом, существует 1520 корректных и используемых адресов, 272 корректных и не используемых адресов (они используются для распознавания редких двойных ошибок) и 4769 некорректных адресов.[6]
См. также
Напишите отзыв о статье "ДНК-микрочип"
Примечания
- ↑ Kulesh DA, Clive DR, Zarlenga DS, Greene JJ (1987). «Identification of interferon-modulated proliferation-related cDNA sequences». Proc Natl Acad Sci USA 84: 8453–8457. DOI:10.1073/pnas.84.23.8453. PMID 2446323.
- ↑ Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO (1995). «Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray». Science 270: 467–470. DOI:10.1126/science.270.5235.467. PMID 7569999.
- ↑ Lashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath AF, Gentile C, Hwang SY, Brown PO, Davis RW (1997). «Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis». Proc Natl Acad Sci USA 94: 13057–13062. DOI:10.1073/pnas.94.24.13057. PMID 9371799.
- ↑ 1 2 3 Miller, M. B., & Tang, Y.-W. (2009). «Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology.». Clinical Microbiology Reviews 22(4): 611–633. DOI:10.1128/CMR.00019-09.
- ↑ 1 2 3 [bitesizebio.com/7463/how-dna-microarrays-are-built/ How DNA Microarrays are Built]
- ↑ Gunderson, K. L., Kruglyak, S., Graige, M. S., Garcia, F., Kermani, B. G., Zhao, C., … Chee, M. S. (2004). «Decoding randomly ordered DNA arrays.». Genome Research 14(5): 870–877. DOI:10.1101/gr.2255804.
Литература
- Peterson, L.E. (2013) Classification Analysis of DNA Microarrays. John Wiley and Sons. ISBN 978-0-470-17081-6
Отрывок, характеризующий ДНК-микрочип
– Да ведь вы очень дружны с Болконским, верно что нибудь передать хочет, – сказал граф. – Ах, Боже мой, Боже мой! Как всё хорошо было! – И взявшись за редкие виски седых волос, граф вышел из комнаты.Марья Дмитриевна объявила Наташе о том, что Анатоль был женат. Наташа не хотела верить ей и требовала подтверждения этого от самого Пьера. Соня сообщила это Пьеру в то время, как она через коридор провожала его в комнату Наташи.
Наташа, бледная, строгая сидела подле Марьи Дмитриевны и от самой двери встретила Пьера лихорадочно блестящим, вопросительным взглядом. Она не улыбнулась, не кивнула ему головой, она только упорно смотрела на него, и взгляд ее спрашивал его только про то: друг ли он или такой же враг, как и все другие, по отношению к Анатолю. Сам по себе Пьер очевидно не существовал для нее.
– Он всё знает, – сказала Марья Дмитриевна, указывая на Пьера и обращаясь к Наташе. – Он пускай тебе скажет, правду ли я говорила.
Наташа, как подстреленный, загнанный зверь смотрит на приближающихся собак и охотников, смотрела то на того, то на другого.
– Наталья Ильинична, – начал Пьер, опустив глаза и испытывая чувство жалости к ней и отвращения к той операции, которую он должен был делать, – правда это или не правда, это для вас должно быть всё равно, потому что…
– Так это не правда, что он женат!
– Нет, это правда.
– Он женат был и давно? – спросила она, – честное слово?
Пьер дал ей честное слово.
– Он здесь еще? – спросила она быстро.
– Да, я его сейчас видел.
Она очевидно была не в силах говорить и делала руками знаки, чтобы оставили ее.
Пьер не остался обедать, а тотчас же вышел из комнаты и уехал. Он поехал отыскивать по городу Анатоля Курагина, при мысли о котором теперь вся кровь у него приливала к сердцу и он испытывал затруднение переводить дыхание. На горах, у цыган, у Comoneno – его не было. Пьер поехал в клуб.
В клубе всё шло своим обыкновенным порядком: гости, съехавшиеся обедать, сидели группами и здоровались с Пьером и говорили о городских новостях. Лакей, поздоровавшись с ним, доложил ему, зная его знакомство и привычки, что место ему оставлено в маленькой столовой, что князь Михаил Захарыч в библиотеке, а Павел Тимофеич не приезжали еще. Один из знакомых Пьера между разговором о погоде спросил у него, слышал ли он о похищении Курагиным Ростовой, про которое говорят в городе, правда ли это? Пьер, засмеявшись, сказал, что это вздор, потому что он сейчас только от Ростовых. Он спрашивал у всех про Анатоля; ему сказал один, что не приезжал еще, другой, что он будет обедать нынче. Пьеру странно было смотреть на эту спокойную, равнодушную толпу людей, не знавшую того, что делалось у него в душе. Он прошелся по зале, дождался пока все съехались, и не дождавшись Анатоля, не стал обедать и поехал домой.
Анатоль, которого он искал, в этот день обедал у Долохова и совещался с ним о том, как поправить испорченное дело. Ему казалось необходимо увидаться с Ростовой. Вечером он поехал к сестре, чтобы переговорить с ней о средствах устроить это свидание. Когда Пьер, тщетно объездив всю Москву, вернулся домой, камердинер доложил ему, что князь Анатоль Васильич у графини. Гостиная графини была полна гостей.
Пьер не здороваясь с женою, которую он не видал после приезда (она больше чем когда нибудь ненавистна была ему в эту минуту), вошел в гостиную и увидав Анатоля подошел к нему.
– Ah, Pierre, – сказала графиня, подходя к мужу. – Ты не знаешь в каком положении наш Анатоль… – Она остановилась, увидав в опущенной низко голове мужа, в его блестящих глазах, в его решительной походке то страшное выражение бешенства и силы, которое она знала и испытала на себе после дуэли с Долоховым.
– Где вы – там разврат, зло, – сказал Пьер жене. – Анатоль, пойдемте, мне надо поговорить с вами, – сказал он по французски.
Анатоль оглянулся на сестру и покорно встал, готовый следовать за Пьером.
Пьер, взяв его за руку, дернул к себе и пошел из комнаты.
– Si vous vous permettez dans mon salon, [Если вы позволите себе в моей гостиной,] – шопотом проговорила Элен; но Пьер, не отвечая ей вышел из комнаты.
Анатоль шел за ним обычной, молодцоватой походкой. Но на лице его было заметно беспокойство.
Войдя в свой кабинет, Пьер затворил дверь и обратился к Анатолю, не глядя на него.
– Вы обещали графине Ростовой жениться на ней и хотели увезти ее?
– Мой милый, – отвечал Анатоль по французски (как и шел весь разговор), я не считаю себя обязанным отвечать на допросы, делаемые в таком тоне.
Лицо Пьера, и прежде бледное, исказилось бешенством. Он схватил своей большой рукой Анатоля за воротник мундира и стал трясти из стороны в сторону до тех пор, пока лицо Анатоля не приняло достаточное выражение испуга.
– Когда я говорю, что мне надо говорить с вами… – повторял Пьер.
– Ну что, это глупо. А? – сказал Анатоль, ощупывая оторванную с сукном пуговицу воротника.
– Вы негодяй и мерзавец, и не знаю, что меня воздерживает от удовольствия разможжить вам голову вот этим, – говорил Пьер, – выражаясь так искусственно потому, что он говорил по французски. Он взял в руку тяжелое пресспапье и угрожающе поднял и тотчас же торопливо положил его на место.
– Обещали вы ей жениться?
– Я, я, я не думал; впрочем я никогда не обещался, потому что…
Пьер перебил его. – Есть у вас письма ее? Есть у вас письма? – повторял Пьер, подвигаясь к Анатолю.
Анатоль взглянул на него и тотчас же, засунув руку в карман, достал бумажник.
Пьер взял подаваемое ему письмо и оттолкнув стоявший на дороге стол повалился на диван.
– Je ne serai pas violent, ne craignez rien, [Не бойтесь, я насилия не употреблю,] – сказал Пьер, отвечая на испуганный жест Анатоля. – Письма – раз, – сказал Пьер, как будто повторяя урок для самого себя. – Второе, – после минутного молчания продолжал он, опять вставая и начиная ходить, – вы завтра должны уехать из Москвы.
– Но как же я могу…
– Третье, – не слушая его, продолжал Пьер, – вы никогда ни слова не должны говорить о том, что было между вами и графиней. Этого, я знаю, я не могу запретить вам, но ежели в вас есть искра совести… – Пьер несколько раз молча прошел по комнате. Анатоль сидел у стола и нахмурившись кусал себе губы.
– Вы не можете не понять наконец, что кроме вашего удовольствия есть счастье, спокойствие других людей, что вы губите целую жизнь из того, что вам хочется веселиться. Забавляйтесь с женщинами подобными моей супруге – с этими вы в своем праве, они знают, чего вы хотите от них. Они вооружены против вас тем же опытом разврата; но обещать девушке жениться на ней… обмануть, украсть… Как вы не понимаете, что это так же подло, как прибить старика или ребенка!…
Пьер замолчал и взглянул на Анатоля уже не гневным, но вопросительным взглядом.
– Этого я не знаю. А? – сказал Анатоль, ободряясь по мере того, как Пьер преодолевал свой гнев. – Этого я не знаю и знать не хочу, – сказал он, не глядя на Пьера и с легким дрожанием нижней челюсти, – но вы сказали мне такие слова: подло и тому подобное, которые я comme un homme d'honneur [как честный человек] никому не позволю.
