Долговременный эксперимент по эволюции E. coli

Долговременный эксперимент по эволюции E. coli — уникальный эксперимент по эволюции бактерии E. coli в искусственных условиях, проведённый группой под руководством Ричарда Ленски в университете штата Мичиган. В процессе эксперимента прослежены генетические изменения, происходившие в 12 популяциях E. coli на протяжении более чем 60 000 поколений. Эксперимент начался 24 февраля 1988 года и продолжается более 25 лет.

За время эксперимента обнаружен широкий спектр генетических изменений. Наиболее поразительной адаптацией стала появившаяся у одной из популяций способность усваивать цитрат натрия.

Цель эксперимента

Целью эксперимента был поиск ответа на некоторые важные вопросы эволюционной биологии:

• Каким образом меняется во времени скорость эволюционных изменений;
• Какова повторяемость эволюционных изменений для различных популяций, существующих в одинаковой среде;
• Каково соотношение эволюции на генотипическом и фенотипическом уровнях.

Методика эксперимента

Выбор бактерии E. coli объясняется быстрой сменой поколений у этого организма и небольшим размером генома, что позволяет за короткий период времени исследовать процессы, которые у более сложных организмов занимают тысячелетия. Благодаря тому, что эта бактерия десятилетиями используется в молекулярной биологии, она хорошо исследована, технологии работы с ней хорошо отлажены. Бактерия без потери жизнеспособности может длительно сохраняться в замороженном состоянии, что позволяет вести своеобразную «летопись эксперимента», а размораживание нужного поколения позволит при необходимости повторить эксперимент с любой ранее сохранённой точки.

В качестве предкового штамма E. coli был взят «штамм Bc251», описанный в 1966 году Сеймуром Ледербергом и использованный Брюсом Левиным в экспериментах по бактериологической экологии в 1972 году. Характерными чертами этого штамма были T6^r (устойчивость к бактериофагу T6), Str^r (устойчивость к стрептомицину), r⁻m⁻ (рестрикционная и модификационная активности выключены), Ara⁻ (неспособность усваивать арабинозу). Перед началом эксперимента путём точечной мутации оперона ara Ленски подготовил Ara⁺ вариант этого штамма, способный усваивать арабинозу.

В начале эксперимента были созданы 12 популяций исходного штамма (6 популяций Ara⁺ и 6 Ara⁻, получившие обозначение A+1…A+6 и A−1…A−6 соответственно). Для точной идентификации каждой популяции были задействованы генетические маркеры. Каждая популяция размножалась в искусственной среде, где скорость размножения ограничивалась стрессовыми условиями (недостатком основного продукта питания — глюкозы). Каждый день 0,1 мл содержимого каждой пробирки переносилось в пробирку с 10 мл свежей питательной среды, где размножение бактерий продолжалось. Каждое 500-е поколение (что соответствует интервалу в 75 дней) замораживалось в глицерине при температуре −80 °С, чтобы в будущем с появлением новых методов анализа имелась возможность провести более подробное исследование. По ходу эксперимента полностью секвенировался геном предкового штамма, а также геномы некоторых этапных поколений (поколения 2000, 5000, 10 000, 15 000, 20 000 и 40 000).

Поскольку размер генома E. coli составляет 4,6 млн нуклеотидных пар, то при наблюдаемой скорости мутаций (около 1000 замен нуклеотидных пар в день), каждая пара нуклеотидов в геноме за 20 лет заменяется в среднем более одного раза. Не все мутации, возникающие в геноме, равнозначны. Полезность мутации определяется скоростью размножения их носителей. Повышенная скорость размножения позволяет мутировавшей бактерии вытеснять из популяции бактерии с отсутствующей мутацией. При этом мутация «фиксируется» и присутствует в геноме всех последующих поколений. Вредные мутации действуют противоположным образом. Существуют также «нейтральные» мутации, которые не влияют на скорость размножения бактерий, так как возникают в незначимых участках генома. Эти мутации не фиксируются и не подавляются отбором и, таким образом, появляются и исчезают случайным образом.

В эксперименте использовалась линия E. coli, размножающаяся исключительно делением (без полового процесса). Таким образом, круг исследуемых явлений ограничивался вновь возникшими мутациями.

Питательная среда DM25

В эксперименте использовалась минимальная питательная среда Дэвиса с концентрацией глюкозы 25 мг/л, обозначаемая как DM25. Эта среда обеспечивает в стационарной фазе плотность 50 млн бактерий/мл.

Объём культуры составлял 10 мл. Культуры содержались в 50-мл конических колбах, свободно накрытых перевёрнутыми стеклянными стаканами. Инкубация происходила при температуре 37 °С и скорости вращения 120 об/мин. По прошествии суток 0,1 мл культуры переносился в колбу с 9,9 мл свежей среды.

Состав среды DM25 (на 500-мл флакон) следующий:

Компонент	Формула	Объём	Масса	Приготовление
Гидрофосфат калия	K2HPO4 · 3H2O		3,5 г	Приготовить раствор и автоклавировать
Дигидрофосфат калия	KH2PO4 · H2O		1,0 г
Сульфат аммония	(NH4)2SO4		0,5 г
Цитрат натрия	Na3C6H5O7		0,25 г
Вода	H2O	500 мл
Глюкоза (10 %)	C6H12O6	0,125 мл	12,5 мг	После автоклавирования добавить из стерильных флаконов
Сульфат магния (10 %)	Mg</sub>SO4	0,5 мл	25 мг
Тиамин (0,2 %)	C12H17N4OS	0,5 мл	25 мг

Следует отметить, что обычно бактерии E. coli не потребляют цитрат натрия, он используется только как хелатор железа.

Результаты эксперимента

Частота мутаций

В работе приводятся результаты исследования популяции A-1, одной из 12, участвовавших в эксперименте. Авторы разделяют эволюцию популяции на два этапа, граница между которыми примерно приходится на поколение 26 000.

При секвенировании генома поколения 20 000 и сравнении его с геномом исходного штамма были обнаружены 45 фиксированных мутаций разного типа (замена нуклеотидов, вставки, замены, инверсии, встраивание мобильных элементов), из которых основная масса (29) пришлась на однонуклеотидные замены. Скорость накопления фиксированных мутаций в течение первого этапа эксперимента оставалась примерно постоянной. Неожиданным оказалось то, что приспособленность бактерий к среде, выражавшаяся в скорости размножения, до поколения 1500 росла очень быстро, затем её рост замедлился при прежней скорости фиксирования мутаций.

В других популяциях за первые 20 000 поколений менее 100 фиксированных мутаций, из которых полезными были только от 10 до 20.

Картина эволюционных изменений в популяции А-1 кардинально изменилась после поколения 26 000. В этот момент произошла мутация в гене mutT, который кодирует белок, участвующий в репарации ДНК. В результате этого среднее число фиксированных мутаций резко возросло до 0,05 за поколение (по сравнению с 0,002 на первом этапе). Всего в поколениях 20 000—40 000 зафиксировалось 609 мутаций. Аналогичное увеличение скорости мутагенеза наблюдалось в трёх других популяциях из 12.

Изменения в метаболизме

Неожиданным оказался результат эволюции популяции А-3. В момент, соответствующий поколению 33 127, в колбе было замечено сильное помутнение, свидетельствующее о высокой плотности бактерий. Подобный эффект обычно наблюдался при загрязнении культуры бактериями другого вида, потребляющими цитрат натрия. Поскольку концентрация цитрата натрия в среде (500 мг/л) в 20 раз превышает концентрацию глюкозы (25 мг/л), потребление цитрата обеспечивает значительно более высокую плотность клеток.

Неспособность питаться цитратами является характерной особенностью E. coli, поскольку каналы в её мембране не пропускают молекулы цитратов. Тем не менее, исследование показало, что цитрат натрия потребляют именно мутантные бактерии E. coli (Cit⁺-бактерии). Проверка генетических маркеров, а также наличие мутаций pykF и nadR, характерных для предыдущих поколений А-3, подтвердили, что бактерии Cit⁺ не привнесены извне, а являются мутировавшими особями исходного штамма.

Ретроспективное обследование замороженных образцов показало, что в поколении 31 000 бактерий Cit⁺ нет вообще, в поколении 31 500 они составляют 0,5 %, в поколениях 32 000 и 32 500 — 15 и 19 % соответственно. В поколении 33 000 Cit⁺ практически исчезают (1,1 %), однако в поколении 33 500 так же неожиданно отвоёвывают жизненное пространство и в последующих поколениях полностью доминируют. Исследователи объясняют это появлением между поколениями 33 000 и 33 500 некоторой пока не установленной мутации, которая в сочетании со способностью питаться цитратом обеспечило бактериям Cit⁺ эволюционное преимущество.

Была проверена гипотеза о том, что способность усваивать цитрат (хотя и менее эффективно, чем глюкозу) имелась у бактерий изначально, однако до возникновения сопутствующих мутаций это качество явно не проявлялось. Гипотеза не подтвердилась, так как бактерии до 31 000-го поколения оказались неспособны размножаться в среде без глюкозы.

См. также

• Ленски, Ричард
• E. coli
• Опыты Г. Шапошникова по искусственной эволюции
• Доказательства эволюции

Ссылки

• [myxo.css.msu.edu/ Richard E. Lenski Hannah Distinguished Professor Michigan State University] — Страничка Ричарда Ленски на сайте Университета штата Мичиган. Здесь стоит динамический счётчик, который показывает, сколько поколений бактерий сменилось в продолжающемся эксперименте по эволюции E. coli. На 15 апреля 2016 года — 64 770 поколений.
• [www.newscientist.com/channel/life/dn14094-bacteria-make-major-evolutionary-shift-in-the-lab.html Bacteria make major evolutionary shift in the lab] Bob Holmes New Scientist 09 June 2008
• [myxo.css.msu.edu/ecoli/ E. coli Long-term Experimental Evolution Project Site]
• [www.nsf.gov/news/special_reports/darwin/textonly/bio_essay1.jsp Evolution: Past, Present and Future] Richard Lenski
• [myxo.css.msu.edu/cgi-bin/lenski/prefman.pl?group=aad List of publications on the experiment]
• [podrobnosti.ua/technologies/2009/10/20/637682.html Генетические мутации ускоряют сами себя].
• J. Lederberg [profiles.nlm.nih.gov/BB/A/B/E/Z/_/bbabez.pdf Isolation and Characterization of Biochemical Mutants of Bacteria].
• [elementy.ru/news?newsid=431543 В долгосрочном эволюционном эксперименте выявлен отбор на «эволюционную перспективность»]

Отрывок, характеризующий Долговременный эксперимент по эволюции E. coli

– Как же, мы вместе немного не съехались, – сказал дежурный штаб офицер, приятно улыбаясь Болконскому.
– Я не имел удовольствия вас видеть, – холодно и отрывисто сказал князь Андрей.
Все молчали. На пороге показался Тушин, робко пробиравшийся из за спин генералов. Обходя генералов в тесной избе, сконфуженный, как и всегда, при виде начальства, Тушин не рассмотрел древка знамени и спотыкнулся на него. Несколько голосов засмеялось.
– Каким образом орудие оставлено? – спросил Багратион, нахмурившись не столько на капитана, сколько на смеявшихся, в числе которых громче всех слышался голос Жеркова.
Тушину теперь только, при виде грозного начальства, во всем ужасе представилась его вина и позор в том, что он, оставшись жив, потерял два орудия. Он так был взволнован, что до сей минуты не успел подумать об этом. Смех офицеров еще больше сбил его с толку. Он стоял перед Багратионом с дрожащею нижнею челюстью и едва проговорил:
– Не знаю… ваше сиятельство… людей не было, ваше сиятельство.
– Вы бы могли из прикрытия взять!
Что прикрытия не было, этого не сказал Тушин, хотя это была сущая правда. Он боялся подвести этим другого начальника и молча, остановившимися глазами, смотрел прямо в лицо Багратиону, как смотрит сбившийся ученик в глаза экзаменатору.
Молчание было довольно продолжительно. Князь Багратион, видимо, не желая быть строгим, не находился, что сказать; остальные не смели вмешаться в разговор. Князь Андрей исподлобья смотрел на Тушина, и пальцы его рук нервически двигались.
– Ваше сиятельство, – прервал князь Андрей молчание своим резким голосом, – вы меня изволили послать к батарее капитана Тушина. Я был там и нашел две трети людей и лошадей перебитыми, два орудия исковерканными, и прикрытия никакого.
Князь Багратион и Тушин одинаково упорно смотрели теперь на сдержанно и взволнованно говорившего Болконского.
– И ежели, ваше сиятельство, позволите мне высказать свое мнение, – продолжал он, – то успехом дня мы обязаны более всего действию этой батареи и геройской стойкости капитана Тушина с его ротой, – сказал князь Андрей и, не ожидая ответа, тотчас же встал и отошел от стола.
Князь Багратион посмотрел на Тушина и, видимо не желая выказать недоверия к резкому суждению Болконского и, вместе с тем, чувствуя себя не в состоянии вполне верить ему, наклонил голову и сказал Тушину, что он может итти. Князь Андрей вышел за ним.
– Вот спасибо: выручил, голубчик, – сказал ему Тушин.
Князь Андрей оглянул Тушина и, ничего не сказав, отошел от него. Князю Андрею было грустно и тяжело. Всё это было так странно, так непохоже на то, чего он надеялся.

«Кто они? Зачем они? Что им нужно? И когда всё это кончится?» думал Ростов, глядя на переменявшиеся перед ним тени. Боль в руке становилась всё мучительнее. Сон клонил непреодолимо, в глазах прыгали красные круги, и впечатление этих голосов и этих лиц и чувство одиночества сливались с чувством боли. Это они, эти солдаты, раненые и нераненые, – это они то и давили, и тяготили, и выворачивали жилы, и жгли мясо в его разломанной руке и плече. Чтобы избавиться от них, он закрыл глаза.
Он забылся на одну минуту, но в этот короткий промежуток забвения он видел во сне бесчисленное количество предметов: он видел свою мать и ее большую белую руку, видел худенькие плечи Сони, глаза и смех Наташи, и Денисова с его голосом и усами, и Телянина, и всю свою историю с Теляниным и Богданычем. Вся эта история была одно и то же, что этот солдат с резким голосом, и эта то вся история и этот то солдат так мучительно, неотступно держали, давили и все в одну сторону тянули его руку. Он пытался устраняться от них, но они не отпускали ни на волос, ни на секунду его плечо. Оно бы не болело, оно было бы здорово, ежели б они не тянули его; но нельзя было избавиться от них.
Он открыл глаза и поглядел вверх. Черный полог ночи на аршин висел над светом углей. В этом свете летали порошинки падавшего снега. Тушин не возвращался, лекарь не приходил. Он был один, только какой то солдатик сидел теперь голый по другую сторону огня и грел свое худое желтое тело.
«Никому не нужен я! – думал Ростов. – Некому ни помочь, ни пожалеть. А был же и я когда то дома, сильный, веселый, любимый». – Он вздохнул и со вздохом невольно застонал.
– Ай болит что? – спросил солдатик, встряхивая свою рубаху над огнем, и, не дожидаясь ответа, крякнув, прибавил: – Мало ли за день народу попортили – страсть!
Ростов не слушал солдата. Он смотрел на порхавшие над огнем снежинки и вспоминал русскую зиму с теплым, светлым домом, пушистою шубой, быстрыми санями, здоровым телом и со всею любовью и заботою семьи. «И зачем я пошел сюда!» думал он.
На другой день французы не возобновляли нападения, и остаток Багратионова отряда присоединился к армии Кутузова.



Князь Василий не обдумывал своих планов. Он еще менее думал сделать людям зло для того, чтобы приобрести выгоду. Он был только светский человек, успевший в свете и сделавший привычку из этого успеха. У него постоянно, смотря по обстоятельствам, по сближениям с людьми, составлялись различные планы и соображения, в которых он сам не отдавал себе хорошенько отчета, но которые составляли весь интерес его жизни. Не один и не два таких плана и соображения бывало у него в ходу, а десятки, из которых одни только начинали представляться ему, другие достигались, третьи уничтожались. Он не говорил себе, например: «Этот человек теперь в силе, я должен приобрести его доверие и дружбу и через него устроить себе выдачу единовременного пособия», или он не говорил себе: «Вот Пьер богат, я должен заманить его жениться на дочери и занять нужные мне 40 тысяч»; но человек в силе встречался ему, и в ту же минуту инстинкт подсказывал ему, что этот человек может быть полезен, и князь Василий сближался с ним и при первой возможности, без приготовления, по инстинкту, льстил, делался фамильярен, говорил о том, о чем нужно было.
Пьер был у него под рукою в Москве, и князь Василий устроил для него назначение в камер юнкеры, что тогда равнялось чину статского советника, и настоял на том, чтобы молодой человек с ним вместе ехал в Петербург и остановился в его доме. Как будто рассеянно и вместе с тем с несомненной уверенностью, что так должно быть, князь Василий делал всё, что было нужно для того, чтобы женить Пьера на своей дочери. Ежели бы князь Василий обдумывал вперед свои планы, он не мог бы иметь такой естественности в обращении и такой простоты и фамильярности в сношении со всеми людьми, выше и ниже себя поставленными. Что то влекло его постоянно к людям сильнее или богаче его, и он одарен был редким искусством ловить именно ту минуту, когда надо и можно было пользоваться людьми.
Пьер, сделавшись неожиданно богачом и графом Безухим, после недавнего одиночества и беззаботности, почувствовал себя до такой степени окруженным, занятым, что ему только в постели удавалось остаться одному с самим собою. Ему нужно было подписывать бумаги, ведаться с присутственными местами, о значении которых он не имел ясного понятия, спрашивать о чем то главного управляющего, ехать в подмосковное имение и принимать множество лиц, которые прежде не хотели и знать о его существовании, а теперь были бы обижены и огорчены, ежели бы он не захотел их видеть. Все эти разнообразные лица – деловые, родственники, знакомые – все были одинаково хорошо, ласково расположены к молодому наследнику; все они, очевидно и несомненно, были убеждены в высоких достоинствах Пьера. Беспрестанно он слышал слова: «С вашей необыкновенной добротой» или «при вашем прекрасном сердце», или «вы сами так чисты, граф…» или «ежели бы он был так умен, как вы» и т. п., так что он искренно начинал верить своей необыкновенной доброте и своему необыкновенному уму, тем более, что и всегда, в глубине души, ему казалось, что он действительно очень добр и очень умен. Даже люди, прежде бывшие злыми и очевидно враждебными, делались с ним нежными и любящими. Столь сердитая старшая из княжен, с длинной талией, с приглаженными, как у куклы, волосами, после похорон пришла в комнату Пьера. Опуская глаза и беспрестанно вспыхивая, она сказала ему, что очень жалеет о бывших между ними недоразумениях и что теперь не чувствует себя вправе ничего просить, разве только позволения, после постигшего ее удара, остаться на несколько недель в доме, который она так любила и где столько принесла жертв. Она не могла удержаться и заплакала при этих словах. Растроганный тем, что эта статуеобразная княжна могла так измениться, Пьер взял ее за руку и просил извинения, сам не зная, за что. С этого дня княжна начала вязать полосатый шарф для Пьера и совершенно изменилась к нему.
– Сделай это для нее, mon cher; всё таки она много пострадала от покойника, – сказал ему князь Василий, давая подписать какую то бумагу в пользу княжны.
Князь Василий решил, что эту кость, вексель в 30 т., надо было всё таки бросить бедной княжне с тем, чтобы ей не могло притти в голову толковать об участии князя Василия в деле мозаикового портфеля. Пьер подписал вексель, и с тех пор княжна стала еще добрее. Младшие сестры стали также ласковы к нему, в особенности самая младшая, хорошенькая, с родинкой, часто смущала Пьера своими улыбками и смущением при виде его.
Пьеру так естественно казалось, что все его любят, так казалось бы неестественно, ежели бы кто нибудь не полюбил его, что он не мог не верить в искренность людей, окружавших его. Притом ему не было времени спрашивать себя об искренности или неискренности этих людей. Ему постоянно было некогда, он постоянно чувствовал себя в состоянии кроткого и веселого опьянения. Он чувствовал себя центром какого то важного общего движения; чувствовал, что от него что то постоянно ожидается; что, не сделай он того, он огорчит многих и лишит их ожидаемого, а сделай то то и то то, всё будет хорошо, – и он делал то, что требовали от него, но это что то хорошее всё оставалось впереди.
Более всех других в это первое время как делами Пьера, так и им самим овладел князь Василий. Со смерти графа Безухого он не выпускал из рук Пьера. Князь Василий имел вид человека, отягченного делами, усталого, измученного, но из сострадания не могущего, наконец, бросить на произвол судьбы и плутов этого беспомощного юношу, сына его друга, apres tout, [в конце концов,] и с таким огромным состоянием. В те несколько дней, которые он пробыл в Москве после смерти графа Безухого, он призывал к себе Пьера или сам приходил к нему и предписывал ему то, что нужно было делать, таким тоном усталости и уверенности, как будто он всякий раз приговаривал:
«Vous savez, que je suis accable d'affaires et que ce n'est que par pure charite, que je m'occupe de vous, et puis vous savez bien, que ce que je vous propose est la seule chose faisable». [Ты знаешь, я завален делами; но было бы безжалостно покинуть тебя так; разумеется, что я тебе говорю, есть единственно возможное.]
– Ну, мой друг, завтра мы едем, наконец, – сказал он ему однажды, закрывая глаза, перебирая пальцами его локоть и таким тоном, как будто то, что он говорил, было давным давно решено между ними и не могло быть решено иначе.
– Завтра мы едем, я тебе даю место в своей коляске. Я очень рад. Здесь у нас всё важное покончено. А мне уж давно бы надо. Вот я получил от канцлера. Я его просил о тебе, и ты зачислен в дипломатический корпус и сделан камер юнкером. Теперь дипломатическая дорога тебе открыта.
Несмотря на всю силу тона усталости и уверенности, с которой произнесены были эти слова, Пьер, так долго думавший о своей карьере, хотел было возражать. Но князь Василий перебил его тем воркующим, басистым тоном, который исключал возможность перебить его речь и который употреблялся им в случае необходимости крайнего убеждения.
– Mais, mon cher, [Но, мой милый,] я это сделал для себя, для своей совести, и меня благодарить нечего. Никогда никто не жаловался, что его слишком любили; а потом, ты свободен, хоть завтра брось. Вот ты всё сам в Петербурге увидишь. И тебе давно пора удалиться от этих ужасных воспоминаний. – Князь Василий вздохнул. – Так так, моя душа. А мой камердинер пускай в твоей коляске едет. Ах да, я было и забыл, – прибавил еще князь Василий, – ты знаешь, mon cher, что у нас были счеты с покойным, так с рязанского я получил и оставлю: тебе не нужно. Мы с тобою сочтемся.
То, что князь Василий называл с «рязанского», было несколько тысяч оброка, которые князь Василий оставил у себя.
В Петербурге, так же как и в Москве, атмосфера нежных, любящих людей окружила Пьера. Он не мог отказаться от места или, скорее, звания (потому что он ничего не делал), которое доставил ему князь Василий, а знакомств, зовов и общественных занятий было столько, что Пьер еще больше, чем в Москве, испытывал чувство отуманенности, торопливости и всё наступающего, но не совершающегося какого то блага.
Из прежнего его холостого общества многих не было в Петербурге. Гвардия ушла в поход. Долохов был разжалован, Анатоль находился в армии, в провинции, князь Андрей был за границей, и потому Пьеру не удавалось ни проводить ночей, как он прежде любил проводить их, ни отводить изредка душу в дружеской беседе с старшим уважаемым другом. Всё время его проходило на обедах, балах и преимущественно у князя Василия – в обществе толстой княгини, его жены, и красавицы Элен.
Анна Павловна Шерер, так же как и другие, выказала Пьеру перемену, происшедшую в общественном взгляде на него.
Прежде Пьер в присутствии Анны Павловны постоянно чувствовал, что то, что он говорит, неприлично, бестактно, не то, что нужно; что речи его, кажущиеся ему умными, пока он готовит их в своем воображении, делаются глупыми, как скоро он громко выговорит, и что, напротив, самые тупые речи Ипполита выходят умными и милыми. Теперь всё, что ни говорил он, всё выходило charmant [очаровательно]. Ежели даже Анна Павловна не говорила этого, то он видел, что ей хотелось это сказать, и она только, в уважение его скромности, воздерживалась от этого.
В начале зимы с 1805 на 1806 год Пьер получил от Анны Павловны обычную розовую записку с приглашением, в котором было прибавлено: «Vous trouverez chez moi la belle Helene, qu'on ne se lasse jamais de voir». [у меня будет прекрасная Элен, на которую никогда не устанешь любоваться.]