Индуцированные стволовые клетки

Индуцированные стволовые клетки (иСК) — стволовые клетки, полученные из каких-либо иных (соматических, репродуктивных или плюрипотентных) клеток путём эпигенетического перепрограммирования. В зависимости от степени дедифференцировки клетки при перепрограммировании различают: индуцированные тотипотентные, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и получаемые так называемым прямым перепрограммированием или каким-либо иным способом индуцированные прогениторные (мультипотентные или унипотентные) стволовые клетки, иногда называемые также индуцированными соматическими стволовыми клетками (ИССК).

В настоящее время существует три пути перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки:

1. пересадка ядер, взятых из соматических клеток, в оплодотворенную яйцеклетку, из которой предварительно удалено ядро
2. слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками;
3. модификация соматической клетки, индуцирующая её превращение в стволовую клетку, с помощью: генетического материала, кодирующего белковые репрограммирующие факторы; рекомбинантных белков; микроРНК, синтетической самореплицирующейся полицистронной РНК и низкомолекулярных биологически активных веществ.

Природные процессы индукции

Ещё в 1895 году Томас Морган, удалив один из двух бластомеров лягушки, обнаружил, что оставшаяся часть эмбриона способна, тем не менее, воссоздать цельный эмбрион. Это означало, что клетки, при необходимости, способны изменять направление своей специализации и такое изменение скоординировано. Позднее в 1924 году, Спеманн и Мангольд (Spemann and Mangold) показали, что важнейшую ключевую роль в процессах развития животных играют межклеточные взаимодействия называемые индукцией. Метаплазией называют обратимую замену одного дифференцированного типа клеток на другой тип зрелых дифференцированных клеток. Этот переход от одного типа клеток к другому может быть частью нормального процесса созревания или вызван каким-то индуцирующим его стимулом. Примерами этого перехода можно назвать трансформацию клеток радужной оболочки глаза в линзу в процессе созревания и превращение клеток пигментного эпителия сетчатки в нейральную сетчатку при регенерации глаза у взрослых тритонов. Этот процесс позволяет организму заменить исходные клетки, не подходящие к новым условиям, на новые которые больше подходят к новым условиям. В опытах на клетках имагинальных дисков дрозофилы было обнаружено, что существует ограниченное число стандартных дискретных состояний дифференцировки и клеткам приходится выбирать одно из них. Тот факт, что трансдетерминация (смена пути дифференцировки) часто происходит не в одной, а сразу в группе клеток доказывает, что она вызвана не мутацией, а именно индуцирована.

К настоящему времени удалось выявить минимальные условия и факторы, наличия которых достаточно для индукции каскада молекулярных и клеточных процессов, направляющих дифференцировку и самоорганизацию плюрипотентных клеток в эмбрион. Роль морфогенов, как оказалось, выполняют противоположно направленные градиенты концентрации морфогенетического белка костной ткани (BMP) и белка Nodal.

Некоторые типы зрелых, специализированных клеток взрослого организма способны естественным путём вернуться к стадии стволовой клетки. Например, дифференцированные клетки желудка, называющиеся аделоморфными или «главными клетками» и синтезирующие маркер стволовых клеток Troy, обычно производят пищеварительные жидкости. Однако, они, могут при необходимости превратиться обратно в стволовые клетки, для «ремонтных работ» в случае травм желудка, таких как порез или повреждение вызванное инфекцией. Более того, они осуществляют этот переход даже в отсутствие заметных травм и способны восполнить пул всех клеточных линий желудочного эпителия, по существу, выступая в качестве покоящихся «резервных» стволовых клеток. При повреждении трахеи, дифференцированные эпителиальные клетки дыхательных путей могут вернуться к фенотипу стабильных и функциональных стволовых клеток, если однако, они не имеют непосредственного контакта с базальной стволовой клеткой, которая предотвращает подобную дедифференцировку. Зрелые терминально дифференцированные эпителиальные клетки почки, после травмы, способны дедифференцироваться в свои более ранние версии, а затем снова дифференцироваться в типы клеток нуждавшихся в замене в поврежденной ткани. Макрофаги могут самообновляться путём локальной пролиферации зрелых дифференцированных клеток. Это происходит, когда понижаются концентрации или происходит ингибирование двух факторов транскрипции MafB и c-Maf, препятствующих активации программы самообновления. У тритонов мышечная ткань восстанавливается из специализированных мышечных клеток, которые для этого дедифференцируются забыв свою прежнюю специализацию. Эта способность к регенерации тканей не уменьшается с возрастом, что вероятно связано со способностью тритонов при необходимости образовывать из мышечных клеток новые стволовые клетки. Следует отметить, что в организме существует небольшой процент стволовых клеток, способных генерировать множество различных типов клеток. Например, мультилинейно-дифференцирующиеся устойчивые к стрессу (англ. muse cell) стволовые клетки взрослого человека обладают способностью к самообновлению и образуют в суспензионной культуре характерные скопления (кластеры) плюрипотентных клеток, которые могут дифференцироваться как in vitro, так и in vivo в энтодермальные, эктодермальные и мезодермальные клетки. Они также легко перепрограммируются в ИПСК.

Подробное описание некоторых других хорошо документированных примеров трансдифференцировки in vivo и их роль в развитии и регенерации рассматриваются в обзоре.

Индуцированные тотипотентные клетки (иТК)

Перепрограммирование в иТК с помощью SCNT

Индуцированные тотипотентные клетки обычно используют для клонирования и получения генетически модифицированных животных. Эти клетки можно получить с помощью перепрограммирования соматических клеток путём переноса ядер соматических клеток (Somatic cell nuclear transfer — SCNT) в ооциты-реципиенты. При этом ооциты не обязательно должны принадлежать тому же виду. Иногда удается использовать ооциты других видов, например овец или поросят. И хотя эффективность межвидовой SCNT была примерно в три раза ниже обычной, такие эмбрионы удавалось довести до стадии бластоцисты. Эффективность перепрограммирования можно повысить в два раза, если за сутки до пересадки остановить мейоз ооцитов-реципиентов с помощью бутиролактона1 в комбинации с нейротрофическим фактором мозга (BDNF). Кроме того эффективность клонирования может быть значительно повышена, а процедура SCNT упрощена благодаря использованию ингибиторов гистондеацетилазы таких как трихостатин А и ингибиторов полимеризации цитоскелетного актина таких как цитохалазин В или латранкулин A (latrunculin A).

Повторное клонирование на протяжении 25 поколений жизнеспособных мышей с помощью метода SCNT, основанном на добавлении в среду клеточной культуры ингибитора деацетилазы гистонов — трихостатина А, показало, что можно достаточно долго (на протяжении 16 лет) неоднократно повторно клонировать животных без видимого накопления нарушений в геноме.

До настоящего времени бытует представление о возможности преждевременного старения клонированных животных, полученных методом SCNT. Показано, что теломеры у эмбрионов клонированных свиней, полученных с помощью стандартных методов SCNT хуже восстановлены, по сравнению с эмбрионами образующимися по естественному пути. Обработка же трихостатином А значительно увеличивает длину теломер у клонированных свиней и это может быть одним из механизмов, лежащих в основе улучшенного развития клонированных животных, после обработки трихостатином А.

При использовании технологии SCNT разработанной Миталиповым можно получать ЭСК человека используя ядра из фибробластов кожи даже пожилых людей, что открывает широкие перспективы для технологий регенеративной медицины

Разработан метод, открывающий новые возможности для создания генетически модифицированных животных с помощью гаплоидных эмбриональных стволовых клеток, которые могут быть использованы вместо спермы. Для этого из ооцита удаляют ядро. Затем в него вводят микроинъекцией сперму. Из образующейся в результате этого бластоцисты получают гаплоидные эмбриональные стволовые клетки. Эти клетки, синхронизованные в М фазе, вводят в ооцит вместо спермы, в результате чего развивается жизнеспособное потомство. Эти разработки, вместе с данными о возможности неограниченного получения ооцитов из митотически активных половых стволовых клеток, открывают возможность промышленного производства трансгенных сельскохозяйственных животных. Так, в Китае с помощью упрощенной техники клонирования получены трансгенные овцы, у которых улучшено качество мяса и молока за счет увеличения в них незаменимых ненасыщенных жирных кислот, которые снижают риск развития ишемической болезни сердца и необходимы для поддержки глаз и головного мозга. Ген, вызывающий синтез ω-3 полиненасыщенных жирных кислот успешно удалось передать трансгенной овце. Клонирование животных для исследовательских целей в Китае уже приобрело промышленные масштабы. Одних только различных клонов поросят производится порядка 500.

Подобные технологии могут также найти клиническое применения для преодоления цитоплазматических дефектов в ооцитах человека. Например, разработаны технологии, которые могут воспрепятствовать нежелательному наследованию митохондриального заболевания, которое передается следующему поколению. Митохондрии, которые часто называют «электростанцией клетки», содержат генетический материал, который передается от матери к ребёнку. Мутации митохондриальной ДНК могут вызвать диабет, глухоту, заболевания глаз, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, деменцию и ряд других неврологических заболеваний. Пересадкой ядра из яйцеклетки одного человека (несущей дефектную митохондриальную ДНК) в другую (здоровую) можно эффективно заменить цитоплазму клетки и вместе с ней митохондрии (и их ДНК). Полученная таким образом яйцеклетка может рассматриваться как имеющая двух матерей. Эмбрион образующийся после оплодотворения такой яйцеклетки будет иметь здоровую митохондриальную ДНК. Однако насколько оправданы подобные манипуляции с клетками человека с точки зрения биоэтики пока не ясно.

Подробнее о новейших достижениях техники клонирования и получении тотипотентных клеток с помощью SCNT см.:

Перепрограммирование в иТК без помощи SCNT

До недавнего времени получить тотипотентные клетки удавалось лишь с помощью SCNT. Однако появились работы где было продемонстрировано получение иТК с помощью перепрограммирования факторами Яманаки in vivo, а также in vitro с помощью таких эпигенетических факторов ооцита как зародышевая изоформа гистонов. Перевести эмбриональные стволовые клетки в состояние тотипотентности характерное для ранних эмбрионов 2-клеточной стадии можно также путём подавления активности CAF-1 необходимой для сборки хроматина.

Получение репродуктивных клеток из ИПСК

Используя среды, содержащие ретиноевую кислоту и фолликулярную жидкость свиньи, можно получить in vitro, дифференцировкой из ИПСК, клетки ранних стадий гаметогенеза подобные репродуктивным клеткам, из которых образуются сперма и ооциты. Примечательно, что для образования примордиальных половых клеток человека требуется активность двух ключевых регуляторов: гена SOX17 направляющего дифференцировку в сторону образования предшественников половых клеток и [en.wikipedia.org/wiki/Germ_line_development#Germ_line_development_in_mammals Blimp1] подавляющего энтодермальные и другие соматические гены во время этой специализации.

В статье китайских ученых с первым автором Чжоу (Zhou) описана технология дифференциации мышиных эмбриональных стволовых клеток которые претерпевают мейоз in vitro превращаясь в гаплоидные сперматиды, способные к оплодотворению, о чем свидетельствовало получение с их помощью жизнеспособного и фертильного потомства.

Подробный обзор методов искусственного получения мужских половых клеток можно найти в статье Hou с соавт. и Irie, Kim, Surani

Разработана технология позволяющая получать зрелые ооциты in vitro из эмбриональных стволовых клеток, а также из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из взрослых фибробластов взятых с кончика мышиного хвоста. Более того оплодотворив такие яйцеклетки in vitro и подсадив их матку мыши удалось с выходом в 1% получить жизнеспособное потомство. Эта технология послужит платформой для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе тотипотентности и для разработки методов производства ооцитов из других (в том числе редких) видов млекопитающих в лабораторных условиях.

ИПСК как результат радикального омоложения

Впервые ИПСК были получены в виде перевиваемой тератокарциномы индуцированной трансплантатом, взятым из мышиных эмбрионов. Было доказано, что тератокарциномы образуются из соматических клеток. Тот факт, что из клеток тератокарциномы можно получить нормальную мышь доказывал их плюрипотентность. Оказалось, что клетки тератокарциномы, выделяя в культуральную среду различные факторы, способны поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток эмбриона в недифференцированном состоянии. Таким образом, ещё в 1980-е годы стало ясно, что трансплантация плюрипотентных или эмбриональных стволовых клеток во взрослый организм млекопитающих обычно приводит к образованию тератомы, которая затем может превратиться в злокачественную опухоль — тератокарциному. Если, однако, поместить клетки тератокарциномы в ранний зародыш млекопитающего (на стадии бластоцисты), то они включаются в состав клеточной массы бластоцисты и из такого химерного (то есть состоящего из клеток от разных организмов) эмбриона нередко развивается нормальное химерное животное. Почти во всех органах и тканях которого часть дифференцированных клеток происходит из клеток тератокарциномы, которые совместно с клетками нормального происхождения участвуют в построении здорового организма. Это свидетельствовало о том, что причиной образования тератомы является диссонанс в стадии развития донорных клеток и окружающих их клеток реципиента (так называемой ниши). Уже тогда, используя ретровирусные векторы, удалось ввести инородные гены в мышиные химеры, полученные с помощью клеток тератокарциномы.

В августе 2006 года японские исследователи сумели превратить клетки мышиной кожи (фибробласты) в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — ИПСК (induced pluripotent stem cells — iPSC), используя для модификации клетки всего четыре репрограммирующих фактора: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc, доставленных в ядро ретровирусами. Этим они доказали, что гиперэкспрессия небольшого количества факторов иногда может подтолкнуть клетки к переходу в новое стабильное состояние, связанному с изменениями активности тысяч генов. По своим свойствам ИПСК оказались очень похожи на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Так, сравнение протеома и фосфопротеома ЭСК и ИПСК, проведенное на 4-х линиях человеческих эмбриональных стволовых клеток и 4-х линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, показало, что большинство идентифицированных белков и участков фосфорилирования в белках всех линий совпадают. Хотя были и небольшие, но статистически воспроизводимые различия, свидетельствующие об определенном функциональном различии. Не было отмечено и особых изменений в последовательности ДНК, особенно если ИПСК были получены с помощью неинтегрирующихся в геном плазмид. Позднее, с развитием технологии перепрограммирования, лучшим доказательством идентичности ИПСК и ЭСК стала возможность получения взрослой мыши полностью из некоторых линий ИПСК. Несмотря на то, что рядом исследований была доказана идентичность ЭСК и ИПСК, получаемые клоны сильно отличаются друг от друга и не для всех из них можно доказать идентичность с ЭСК, далеко не все клоны способны дать жизнь химерным мышам или подвергнуться эффективной дифференциации в те или иные соматические клетки. Одной из причин таких различий является разница между составом транскрипционных факторов при репрограммировании в ИПСК и набором факторов в материнском ооците. К числу таких "упущенных" факторов относится, в частности способствующий процессу репрограммирования особый, характерный для ооцитов линкерный (связующий, компонующий нуклеосомы) гистон H1foo. Замена одного из факторов Яманаки, а именно c-Myc на H1foo, значительно повысили количество и качество получаемых клонов ИПСК - они стали более однородными по свойствам, из них чаще стали получаться мыши-химеры.

Важным преимуществом ИПСК перед ЭСК является то, что они могут быть получены из клеток взрослого организма, а не из эмбриона. Поэтому стало возможным получать ИПСК от взрослых и даже пожилых пациентов. Перепрограммирование соматических клеток в ИПСК приводит к их омоложению о чём свидетельствуют данные исследования теломеров— концевых участков хромосом состоящих из коротких следующих друг за другом повторов эволюционно консервативной последовательности ДНК. Выяснилось, что перепрограммирование приводит к удлинению теломеров и их нормальному укорочению по мере дифференцировки ИПСК обратно в фибробласты. Таким образом, при индуцированной плюрипотенции восстанавливается эмбриональная длина теломеров, а значит, увеличивается потенциальное число делений клетки, ограниченное так называемым лимитом Хайфлика (Hayflick limit). Более того омолаживаются и митохондрии клетки при этом восстанавливается характерный для молодых клеток уровень дыхания Поэтому технологию получения ИПСК следует рассматривать как способ радикального омоложения. Из-за диссонанса в стадии развития омоложенных клеток и окружающих их старых клеток реципиента, инъекция пациенту его же собственных ИПСК, обычно приводит к иммунной реакции, что может быть использовано в медицинских целях, или образованию опухолей типа тератомы. Одной из причин иммуногенности аутологичных ИПСК и ЭСК считается группа из 9 генов (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a,Chi3L4, Olr1, Retn), синтез которых повышен в тератомах, полученных из этих клеток Очевидно, некоторые клетки, дифференцированные из ИПСК и ЭСК, продолжают синтезировать эмбриональные изоформы белков и неадекватно интерпретируют сигналы окружающих их клеток реципиента. В связи c этим следует отметить, что образование тератомы из плюрипотентных стволовых клеток может быть вызвано низкой активностью фермента PTEN, способствующей выживанию, в процессе дифференцировки, небольшой популяции (не превышающей 0,1-5 % от общей численности клеток) высоко онкогенных клеток карциномы, инициирующих тератомы. Выживание этих инициирующих тератомы клеток связано с недостаточной репрессией Nanog, а также с повышением метаболизма глюкозы и холестерина. Эти, инициирующие образование тератом, клетки характеризуются также более низким соотношением p53/p21 по сравнению с неонкогенными клетками.

Недавно методом отбора удалось найти небольшие молекулы (цитотоксические селективные ингибиторы плюрипотентных стволовых клеток человека), которые предотвращают образование тератомы у мышей после трансплантации им плюрипотентных стволовых клеток человека. Самое мощное и селективное из этих соединений — PluriSIn #1, вызывало ингибирование стеароил-КоА десатуразы (ключевого фермента в биосинтезе олеиновой кислоты), что в конечном итоге приводило к апоптозу плюрипотентных стволовых клеток. С помощью этой молекулы удается выборочно удалить из культуры недифференцированные клетки.. Ещё одной молекулой избирательно удаляющей недифференцированные клетки является STF-31, являющийся ингибитором GLUT1. Эффективной стратегией избирательного устранения плюрипотентных клеток, которые способны дать начало тератоме является ингибирование характерных для этих клеток антиапоптотических факторов, таких как сурвивин или Bcl10. Обработкой малыми молекулами, которые могут ингибировать эти антиапоптотические факторы, можно добиться селективного удаления подобных клеток вызвав их апоптоз. В частности, одной обработки смешанной популяции химическими ингибиторами сурвивина (такими как, например, кверцетин или YM155) достаточно чтобы вызвать избирательную и полную гибель недифференцированных клеток, вызванную накоплением р53 в митохондриах. Этого, по мнению авторов исследования, достаточно, чтобы предотвратить образование тератомы после трансплантации клеток полученных из ИПСК. Тем не менее, маловероятно, что какая либо, пусть даже самая изощренная, предварительная очистка, не способна обезопасить подсадку ИПСК или ЭСК, так как при избирательном удалении плюрипотентных клеток, они вновь довольно быстро возникают путём превращения дифференцированных клеток обратно в стволовые (к обратному переходу может в частности подтолкнуть гипоксия), что приводит к образованию опухоли. Это может быть связано с нарушением регуляции осуществляемой микро РНК let-7 по отношению к её мишени — белку Nr6a1 (известному также как ядерный фактор зародышевых клеток — GCNF), являющемуся эмбриональным репрессором транскрипции генов плюрипотентности, который необходим для правильной дифференцировки индуцированных плюрипотентных клеток. Обнаружена также малая молекула названная Дисплюригеном (Displurigen), которая воздействуя на белок теплового шока HSPA8 (Heat shock 70 kDa protein 8), необходимый для связывания OCT4 с ДНК, способна вывести клетку из состояния плюрипотентности

Использование ИПСК для клеточной терапии пока ограничено. Тем не менее, они могут быть использованы для целого ряда иных целей — включая моделирование болезней, скрининг (селективный отбор) лекарств, проверку токсичности различных препаратов. Важными факторами для получения высококачественных ИПСК являются определенные небольшие молекулы, способствующие сохранению геномной целостности, образующихся при перепрограммировании ИПСК, путём ингибирования двухцепочечных разрывов ДНК и активации гена Zscan4, содействующего процессам репарации ДНК. Перепрограммирование вызывает репликативный стресс, который можно снизить повысив уровень чекпоинт киназы 1 (CHK1), благодаря чему повышается качество и эффективность образования ИПСК. Кроме того добавление во время перепрограммирования нуклеозидов позволяет снизить повреждения ДНК и число геномных перестроек в получаемых ИПСК

Интересно отметить, что ткани, выращенные из ИПСК, помещенных в «химерные» эмбрионы на ранних стадиях развития мыши, практически не вызывают иммунного ответа (после того, как эмбрионы выросли во взрослых мышей) и пригодны для аутологичной трансплантации, причем даже в том случае когда ИПСК получены от очень старых животных. В то же время, полное перепрограммирование взрослых клеток в тканях у мышей in vivo путём временной активации факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, приводит к образованию в различных органах множества тератом. Смотри рисунок. Более того, частичное перепрограммирование клеток в ИПСК in vivo показало, что неполное перепрограммирование приводит к эпигенетическим изменениям (нарушению репрессии Поликомб целей и изменению метилирования ДНК) в клетках, которые ведут к развитию рака

Алгоритм для предсказания набора транскрипционных факторов необходимых для преобразования клеток

Определение уникального набора транскрипционных факторов, которые необходимы для репрограммирования клеток представляет собой длительный и дорогостоящий процесс. Международная группа исследователей разработала алгоритм, называемый Магрифи (Mogrify), который помогает предсказать оптимальный набор клеточных факторов, необходимых для преобразования одного типа клеток человека в другой.

Стратегии получения ИПСК для клинических испытаний

Разработаны критерии качества и стратегия производства ИПСК для клинических испытаний, так называемая cGMP (англ. current Good Manufacturing Practice).

Система индуцируемого апоптоза для безопасности

Чтобы обезопасить применение ИПСК в клинике, было предложено одновременно с перепрограммированием клеток пациента в ИПСК, вводить в эти клетки индуцируемый малой молекулой ген каспазы-9 (IC9) для запуска каскадов апоптоза для самоубийства клеток образованных из этих ИПСК. Такой «предохранитель» позволит избавляться от омоложенных клеток после того как они выполнили свою терапевтическую функцию или в случае образования опухоли из этих клеток.

Устойчивость к онкогенезу у ИПСК Голого землекопа

У голых землекопов уровень заболеваемости раком крайне низок по сравнению с другими млекопитающими. Обнаружено, что у ИПСК этого животного ослаблена способность к образованию тератом при трансплантации, что может быть связано:

• с видоспецифической активацией супрессора опухоли ARF (англ. alternative reading frame), который является продуктом альтернативной рамки считывания гена CDKN2A (другой продукт этого гена — маркер старения белок p16), а также
• с мутацией, приводящей к разрушению онкогена ERAS, являющегося аналогом Ras и отвечающего за онкогенность ЭСК.

Более того, удалось найти сигнальный путь ASIS (англ. ARF suppression-induced senescence), с помощью которого вероятно удастся защитить ИПСК от возникновения из них опухолей

Эффективность перепрограммирования в ИПСК

До настоящего времени недостаточно понятно, почему эффективность перепрограммирования с помощью факторов транскрипции значительно ниже, чем при пересадке ядра в ооцит. Показано, что большинство фибробластов кожи взрослого человека начинают процесс перепрограммирования сразу после обработки трансгенами Яманаки (Oct4, Sox2, Klf4, и c-Myc). Тем не менее, только небольшая часть (~ 1 %) из этих «новоиспеченных» ИПСК образуют впоследствии колонии ИПСК. Причиной, понижающего эффективность перепрограммирования, возврата большинства клеток к состоянию дифференцировки может быть:

• недостаточная деятельность активируемой цитидиндезаминазы (AID) из-за чего клетки не могут стабилизироваться и долго поддерживать состояние плюрипотенции.
• недостаточная активность гена SMC1 кодирующего один из белков когезина (необходимого для образования внутрихромосомной петли сближающей промоутер гена с последующим энхансером, что необходимо для активации эндогенных генов плюрипотентности), делает невозможным достижение плюрипотентности
• важную роль на поздних этапах перепрограммирования играют и ферментативные модификации гистонов. Показано, что необходимым условием эффективного перепрограммирования является подавление переносчика гистонов CAF-1 и белкового комплекса ремоделирования нуклеосом и деацетилирования (nucleosome remodeling and deacetylation — NuRD. Избыточная экспрессия субъединицы NuRD, называемой Mbd3, ингибирует индукцию ИПСК. Причиной этого является деацетилирование комплексом NuRD лизина 27 в молекуле гистона Н3К27ac, что позволяет Поликомб Репрессорному комплексу 2 (PRC2) осуществить триметилирование лизина 27 в гистоне H3, приводящее, в конечном счете, к ингибированию ряда генов-маркеров плюрипотентности , в том числе генов Oct4 и Nanog. Ингибирование Mbd3, с другой стороны, повышает эффективность перепрограммирования и способствует образованию плюрипотентных стволовых клеток, которые способны генерировать жизнеспособных химерных мышей, даже в случае отсутствия с-Мус или Sox2. Очевидно, Mbd3/NuRD исполняет роль эпигенетического регулятора, который ограничивает экспрессию ключевых генов плюрипотентности. Поэтому подавление Mbd3/NuRD (например, с помощью бутирата, вальпроевой кислоты, субероиланилидгидроксамовой кислоты или трихостатина А) может стать мощным средством для повышения эффективности и точности перепрограммирования. Действительно, подавив Mbd3 удалось впервые осуществить детерминированное и синхронизированное перепрограммирование клеток кожи мыши и человека в ИПСК в течение всего семи дней и с невиданной ранее эффективностью — около 100 %

Найден фактор BRD3 (bromodomain-containing protein 3), который опознаёт "коды" ацетилированных гистонов в хромосоме, а также активирует большой набор митотических генов, повышая таким образом митотическую активность клетки. Этот фактор позволил более чем в 20 раз повысить эффективность выхода ИПСК, сократить длительность перепрограммирования до нескольких дней и повысить качество перепрограммирования. Как отмечено выше повысить эффективность репрограммирования позволяет также замена с-Мус на H1foo . В случае когда требуется репрограммировать клетки пожилых пациентов повысить эффективность позволяет ингибирование H3K79 гистон метилтрансферазы называемой DOT1L (Disruptor of telomeric silencing 1-like)

Элитные клетки

В первичных после биопсии культурах клеток при перепрограммировании лишь очень немногие клетки способны превратиться в ИПСК, и тех из них, которые такой способностью обладают, называют «элитными» клетками. Ученые нашли способ получения таких элитных клеток из соматических с помощью фактора C/EBPα (CCAAT/enhancer binding protein-α). В первичной культуре мышиных В-клеток непродолжительная экспрессия C/EBPα с последующим перепрограммированием факторами Яманаки позволила добиться 100-кратного увеличения эффективности перепрограммирования в плюрипотентные клетки, причём с участием 95% клеточной популяции. Такие искусственно созданные элитные клетки очень похожи на белые кровяные прогениторные клетки-предшественники костного мозга, известные как миелобласты.

Дифференцировка ИПСК в условиях in vivo в тератоме

Тот факт, что ИПСК человека способны к образованию тератом не только в теле человека, но и в организме некоторых животных, в частности в организме мыши или свиньи, позволил разработать метод дифференцировки ИПСК в условиях in vivo. Для этого ИПСК вводят, вместе с клетками индуцирующими направленную дифференцировку, генмодифицированной свинье или мыши, у которой подавлена активация иммунной системы на клетки человека, а затем, вырезав образовавшуюся тератому, выделяют из неё необходимые дифференцированные клетки человека, используя моноклональные антитела к тканеспецифичным маркерам на поверхности полученных клеток. Этот метод был успешно использован для получения функциональных миелоидных, лимфоидных и эритроидных клеток человека пригодных для трансплантации (пока только мышам). Таким образом, доказана возможность производства in vivo из клеток пациента необходимых ему дифференцированных клеток для трансплантации, изготовления антител или скрининга лекарственных средств. Используя лектин rBC2LCN избирательно связывающий ИПСК, или же MitoBloCK-6 и /или PluriSIn #1 можно очистить полученные прогениторные клетки от плюрипотентных клеток образующих тератому. Тот факт, что дифференцировка проходит в условиях тератомы позволяет надеяться, что полученные клетки достаточно устойчивы к стимулам способным запустить их обратный переход к дедифференцированному (плюрипотентному) состоянию, а значит безопасны. Беспокойство, однако, вызывает тот факт, что «воспитанные» в тератоме у животных человеческие клетки за время своего «воспитания», по всей вероятности, поглощают значительное количество экзосом произведенных окружающими клетками организма носителя тератомы, а значит, попав в организм человека, могут повести себя неадекватно.

Методика основанная на обнаружении ген-репортер-GFP-положительных клеток в тератоме, полученной из ИПСК, позволит идентифицировать и вырастить культуры ткани, используя индуцированные взрослые стволовые клетки различных типов, выделение которых ранее было затруднительно.

Весьма перспективной средой для первоначальной дифференцировки ИПСК in vivo могут также оказаться куриные эмбрионы. Есть доказательства того, что микросреда этих эмбрионов оказывает анти-онкогенное действие на человеческие клетки и намного лучше чем условия in vitro

Смотри также: Robert Lanza, Michael West (2013) [www.google.com/patents/US20130058900 Method for facilitating the production of differentiated cell types and tissues from embryonic and adult pluripotent and multipotent cells]. Patent US 20130058900 A1

Получение клеток хрусталика и сетчатки глаза из ИПСК

В ближайшее время предполагается приступить к клиническим испытаниям, призванным продемонстрировать безопасность использования ИПСК для клеточной терапии людей с катарактой а также с возрастной дегенерацией жёлтого пятна — заболевания, которое повреждая сетчатку, может привести к слепоте. Описаны методы получения из ИПСК клеток хрусталика и сетчатки и способы их использования для клеточной терапии, которая по крайней мере на 6 недель улучшала зрение у подопытных животных.

Получение из ИПСК легочных эпителиальных клеток

Хронические заболевания легких, такие как идиопатический фиброзирующий альвеолит, Силикоз, хроническая обструктивная болезнь легких и бронхиальная астма входят в число основных причин инвалидности и смертности. Поэтому исследователи ищут пути эффективной клеточной терапии и тканевой инженерии легких, которые бы позволили бороться с этими заболеваниями. Были разработаны способы получения различных типов легочных клеток из ИПСК, которые могут быть взяты за основу для получения терапевтических клеток из материала, полученного от пациента.

Получение нервных стволовых клеток человека из ИПСК

Юань и коллеги сообщили, что нервные стволовые клетки человека, индуцированные из ИПСК с помощью ретиноевой кислоты в бессывороточной среде имеют стабильный нейронный фенотип. После трансплантации крысам со смоделированным ишемическим инсультом, эти клетки не только выжили, но и мигрировали в зону ишемии мозга, где дифференцировались в зрелые нервные клетки, что оказало благотворное влияние на функциональное восстановление утраченных от повреждения в результате инсульта неврологических функций.

Получение стволовых клеток почки из ИПСК

Разработана система для быстрого (за 3 дня) и эффективного (70 %-80 % популяции) превращения ИПСК в клоны характерные для клеток почки с помощью ингибитора CHIR99021 и некоторых ростовых факторов. Более того, удалось излечивать в опытах на мышах острые поражения почек, используя стволовые клетки почки, полученные из ИПСК.

Получение остеобластов из ИПСК

Известно что аденозин и его рецепторы, в частности A2bR играют важную роль в регенерации костных переломов. Простое добавление в культуральную среду аденозина позволило превратить человеческие ИПСК в остеобласты. При трансплантации этих остеобластов мышке, с использованием макропористой синтетической матрицы, остеобласты полученные из ИПСК, участвовали в регенерации повреждений кости образуя новые ткани и стимулируя кальцификацию. При этом не наблюдалось образования тератом, что очевидно свидетельствует о 100% дифференцировке клеток ИПСК в остеобласты.

Наивные плюрипотентные стволовые клетки (нПСК)

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки, независимо от того, получены ли они из бластоцисты или являются результатом перепрограммирования соматических клеток, существенно отличаются от классических мышиных эмбриональных стволовых клеток и по мнению ряда исследователей представляют более позднюю стадию развития эпибласта. Удалось получить нПСК у которых утеряна эпигенетическая "память" метилирования ДНК как гаметы (ооцита), так и человеческой бластоцисты. Такие клетки в отличие от ИПСК не имеют антиген SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4). Перевести ЭСК и ИПСК человека в наивное состояние позволяет гиперэкспрессия фактора YAP (Yes-associated protein). Гиперэкспрессию YAP с получением наивного состояния можно также имитировать путём добавления к культуральной среде (лизофосфатидной кислоты (LPA), являющейся активатором YAP.

Репрограммирование человеческих ЭСК и ИПСК с помощью рекомбинантного, усеченного человеческого NME7 (найденного в семенниках фактора, содержащего два домена нуклеозид дифосфат киназы (NDPK) и способного связываться с расщепленной формой трансмембранного рецептора MUC1, называемой MUC1*) позволило получить стабильно наивные клетки, которые более пригодны для широкомасштабного клонирования и имеют расширенный потенциал дифференциации. На основе таких клеток можно создать "фабрики клеток" для промышленного производства продукции необходимой для нужд клеточной терапии.

Регион-селективные плюрипотентные стволовые клетки (рсПСК)

Ву и его коллеги обнаружили, что комбинация свободной от сыворотки среды, фактора роста фибробластов 2 (FGF2) и ингибитора сигнальных путей Wnt позволяет получить в результате устойчивую линию рсПСК (регион-селективных плюрипотентных стволовых клеток, по англ rsPSCs) клеток человека. По транскриптому эти клетки напоминали таковые из задних клеток раннего эмбриона мыши. Трансплантация этих клеток в 7,5-дневные эмбрионы мыши привела к их эффективному включению в задний, но не в другие части эмбриона. После 36 часов культивирования этих химерных эмбрионов, клетки рсПСК проявили способность к пролиферации и способность к дифференцировке в ткани трёх зародышевых листков. Хотя исследователи остановили дальнейшую дифференцировку этих клеток, предполагается, что каждый из образованных этими клетками зародышевых листков способен дать начало определённым тканям и органам. Важно отметить, что в отличие от других человеческих стволовых клеток, которые, как правило, не удается интегрировать в эмбрион мыши, человеческие rsPSCs способны к такой интеграции и к развитию в ранние стадии тканей человека.

Клетки F класса

Клетки F класса в отличие от ИПСК не способны включаться в ткани организма и участвовать в построении химерного организма. Тем не менее они удовлетворяют другому тесту на плюрипотентность — способны образовывать тератомы. По сравнению с обычными стволовыми клетками подобными эмбриональным и ИПСК,клетки F-типа растут в лаборатории быстрее и их выращивать проще и дешевле — их можно просто поместить в большой сосуд с питательной средой и вырастить за несколько дней или часов, а не за несколько недель как обычные ИПСК.

Индуцированные прогениторные стволовые клетки

Методы прямой трансдифференцировки

В связи с тем, что использование ИПСК для клеточной терапии сопряжено с большим риском опухолей и рака, необходима разработка методов получения более безопасных клеточных линий, пригодных для применения в клинике. Альтернативой методам ИПСК стала техника так называемого «прямого репрограммирования», то есть индуцируемой определёнными факторами прямой трансдифференцировки, без предварительного прохождения клеток через стадии плюрипотентного состояния. Основу для такого подхода заложили исследования Тейлор и Джонса (Taylor and Jones), показавших, что воздействие 5-азацитидина — реактива, вызывающего деметилирование ДНК — на бессмертную линию клеток мышиных эмбриональных фибробластов способно вызвать образование миогенных, хондрогенных и адипогенных клонов и Вейнтрауба с соавторами, обнаруживших, что для репрограммирования достаточно активации всего одного гена, позднее названного MyoD1. По сравнению с ИПСК, для получения которых требуются не менее двух недель, образование индуцированных прогениторных клеток происходит сравнительно быстро — иногда за несколько дней. Эффективность перепрограммирования также обычно во много раз выше. Для этого перепрограммирования не всегда требуется деление клетки. Но главное, это то, что получаемые в результате перепрограммирования мультипотентные соматические стволовые клетки более пригодны для клеточной терапии, так как не образуют тератомы.

Трансдифференцировка с помощью 5-азацитидина и тромбоцитарного фактора роста

Разработан метод получения, так называемых, индуцированных мультипотентных стволовых клеток (ИМПСК) путём непродолжительной обработки постнатальных стволовых клеток костного мозга и жировых клеток комбинацией фактора роста (тромбоцитарный фактор роста - АВ (PDGF-AB)) и 5-азацитидина. Авторы этого исследования утверждают, что: "В отличие от первичных мезенхимальных стволовых клеток, которые хотя и используются в клинической практике для содействия восстановлению тканей, но не способны сами включаться в эту ткань, ИМПСК способны к непосредственному участию процессах регенерации тканей и при этом не образуют опухолей", в связи с чем "могут быть использованы для регенерации различных тканей"

Трансдифференцировка зрелых клеток всего одним фактором транскрипции

Особенностью нематоды Caenorhabditis elegans является настолько жёсткая программа развития, что соматическая клетка, находящаяся в определённом участке организма, как правило, имеет одинаковую родословную у всех особей. При этом зрелые клетки, в отличие от ранних эмбриональных клеток, обычно очень устойчивы к изменению их фенотипа. Тем не менее, обнаружено, что как у интактных личинок, так и у неповреждённых взрослых нематод краткосрочный синтез всего одного фактора транскрипции, а именно фактора ELT-7 GATA может превратить фенотип полностью дифференцированной, высокоспециализированной не-энтодермальной клетки фаринкса (глотки) в фенотип полностью дифференцированной энтодермальной клетки кишечника. Это превращение происходит «в одну стадию» — путём прямой трансдифференцировки, без каких-либо промежуточных стадий дедифференцировки.

Трансдифференцировка с помощью CRISPR-опосредованного активатора

Фенотип клетки можно изменять с помощью активации определенных эндогенных генов, используя для этого CRISPR — опосредованный активатор. Если соединить домен dCas9 (который изменен таким образом, что он больше не режет ДНК, но все ещё может находить и связываться с конкретными последовательностями ДНК) с активатором транскрипции (таким как p65HSF1), то можно с большой точностью изменять эндогенную экспрессию конкретных генов. Пользуясь этим методом, Вэй и др. усиливали экспрессию эндогенных генов Cdx2 и Gata6, воздействуя на них с помощью CRISPR-опосредованных активаторов, и таким образом, сумели осуществить прямое репрограммирование мышиных эмбриональных стволовых клеток в две внезародышевые линии, а именно в типичные трофобласты и клетки внеэмбриональной энтодермы. Аналогичным образом активация эндогенных генов Brn2, Ascl1, и Myt1l позволила преобразовать эмбриональные фибробласты в индуцированные нервные клетки.

Перепрограммирование путём поэтапного моделирования процессов регенерации

Ещё один способ перепрограммирования заключается в поэтапном моделировании на скелетной мышце млекопитающих процессов, которые происходят у амфибий при регенерации конечности. Таким образом, с помощью химических веществ: миосеверина (myoseverin), реверсина (2-(4-морфолиноанилино)-6-циклогексиламинопурина) и некоторых других веществ, в условиях культуры мышечных клеток млекопитающих, которые, как известно, не способны регенерировать конечности, удалось индуцировать процессы аналогичные тем которые протекают при регенерации конечностей у амфибий и получить предшественники мышечных, костных, жировых и нервных клеток.

Трансдифференцировка с помощью антител

Обнаружены моноклональные антитела, способные преобразовывать стволовые клетки костного мозга непосредственно в прогениторные клетки нейронов головного мозга.

Для этой трансдифференцировки как оказалось достаточно всего одного белка — антитела имитирующего фактор GCSF. Для поиска подобных антител используется специальный метод селекции антител.

Условно перепрограммированные клетки (УПК)

Ричард Шлегель и его исследовательская группа разработали метод, который позволяет размножать in vitro культуру клеток похожих на взрослые стволовые клетки, без каких-либо генетических манипуляций. Они показали, что под воздействием облученных фибробластов (см. обзоры и) и ингибитора Rho киназы — Y-27632, первичные эпителиальные клетки млекопитающих переходят к состоянию неограниченной пролиферации (что, по мнению авторов, связано с ростом концентрации β-катенина в ядре и снижением Notch сигнализации). Индукция УПК происходит довольно быстро (в течение 2 дней) и является результатом «перепрограммирования» всей клеточной популяции, а не одной из её субпопуляций. При этом в УПК не наблюдалась характерная для ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) активация синтеза Sox2, Oct4, Nanog, и Klf4. Эта индукция УПК обратима — достаточно удалить Y-27632 и облученные фибробласты, чтобы клетки перешли к обычной дифференцировке. Обнаружено, что факторы, вызывающие индукцию условно перепрограммированных клеток, переходят из «питающих» клеток подложки в культуральную среду в результате обусловленного радиацией апоптоза этих клеток. Этот метод может иметь большое будущее в регенеративной медицине, так как эти клетки в отличие от ИПСК не образуют опухоли. Так, например, используя технологию условно-перепрограммированных клеток, исследователи смогли найти эффективную терапию для пациента с редким типом опухоли легких.

Иной подход к получению условно перепрограммированных клеток заключается в ингибировании мембранного белка CD47, являющегося рецептором тромбоспондина-1. Показано, что потеря CD47 снимает запрет на устойчивую пролиферацию первичных мышиных эндотелиальных клеток, повышая частоту их асимметричного деления, а также позволяет этим клеткам спонтанно перепрограммироваться в мультипотентные клетки формирующие эмбриональные тела. Нокдаун гена CD47 резко увеличивает в клетках уровни мРНК с-Мус и других факторов перепрограммирования Яманаки как in vitro, так и in vivo. Очевидно, тромбоспондин-1 является ключевым сигналом нишы, который подавляет способность стволовых клеток к самообновлению влияя на них через CD47. Поэтому антагонисты CD47 могут активировать самообновление и перепрограммирование клеток выключая механизмы негативной регуляции с-Мус и других факторов транскрипции стволовых клеток По мнению авторов исследования, образующиеся при этом мультипотентные клетки не образуют тератом.

Интересно отметить, что in vivo блокада CD47 с помощью антисмыслового морфолино повышает выживаемость мышей, тело которых подверглось воздействию летальной дозы облучения. Эта устойчивость к радиации обусловлена увеличением пролиферативной способности клеток крови, образующихся из костного мозга, и активации защитной аутофагии радиочувствительных желудочно-кишечных тканей.

Косвенное перепрограммирование клеток (ILC)

Разработан метод при котором соматические клетки переходят в промежуточное пластическое состояние- частично перепрограммированные ИПСК (pre-iPSC), индуцированное кратковременным воздействием перепрограммирующих факторов, а затем дифференцируются с помощью специально разработанной химической среды (искусственной ниши). Предполагается, что этот новый метод может быть более эффективным и безопасным, так как он, по мнению его авторов, не вызывает опухоли или другие нежелательные генетические изменения, и при этом позволяет получать требуемые клетки быстрее и c гораздо большим выходом по сравнению с другими методами. Тем не менее, безопасность этих клеток все же сомнительна — учитывая то, что преобразование из пре-ИПСК опирается на использование условий перепрограммирования в ИПСК, и нельзя исключить что часть клеток может все же приобрести плюрипотентные свойства(если они не прекратят процесса де-дифференцировки in vitro или в связи с дальнейшей де-дифференцировкой in vivo).

Перепрограммирование воздействием на гликопротеин наружней мембраны

Общей особенностью, взятых из разных источников, плюрипотентных стволовых клеток, отличающей их от большинства (исключение составляют лейкоциты) неплюрипотентных клеток, является особый характер гликозилирования белков их наружней мембраны. Расположенные на поверхности стволовых клеток гликаны быстро реагируют на изменения в состоянии клетки и поэтому идеально подходят в качестве маркеров для выявления изменений в клеточных популяциях. Многие широко используемые маркеры стволовых клеток (в том числе SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, и Тра 1-81.) являются гликанами клеточной поверхности. Так, например, гликопротеин подокаликсин (podocalyxin) расположен исключительно только на недифференцированных клетках человека (ИПСК и ЭСК), но не на поверхности дифференцированных соматических клеток, что позволяет отделить эти клетки с помощью лектина BC2L-C из Burkholderia cenocepacia (rBC2LCN). Suila Хели с соавт. полагают, что у стволовых клеток человека внеклеточные о-GlcNAc и о-LacNAc, выполняют решающую роль в тонкой настройке сигнального пути Notch — высококонсервативной системы клеточной сигнализации, от которой зависят судьбы стволовых клеток, их дифференцировка, лево- и правосторонняя асимметрия, апоптоз, и пролиферация (см. обзоры:)

Очевидно, изменения характера гликозилирования белков наружней мембраны являются маркерами состояния клетки каким-то образом связанными с плюрипотенцией и дифференцировкой. Причем «сдвиг» в характере гликозилирования, по всей видимости, это не просто результат инициализации экспрессии генов, а механизм играющий роль важного регулятора группы генов, вовлеченных в приобретении и поддержании недифференцированного состояния. Так, показано, что активация гликопротеина ACA, связывающего гликозилфосфатидилинозитол на поверхности прогениторных клеток периферической крови человека, посредством сигнального каскада PI3K/Akt/mTor/PTEN индуцирует повышение экспрессии генов Wnt, Notch1, Bmi-1 и HoxB4, а также способствует образованию и самообновлению популяции гемопоэтических стволовых клеток. Более того показано, что индуцируемая посредством ACA-зависимого сигнального пути дедифференцировка прогениторных клеток, приводит к образованию ACA-индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, способных дифференцироваться in vitro в клетки всех трёх зародышевых листков.. Изучение избирательно связывающих гликопротеины лектинов, на предмет их способности поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека, привело к открытию лектина эритрина кристагалли (Erythrina Cristagalli — ЕСА) способного служить в качестве простой и высокоэффективной матрицы для культивации человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Индуцированные стрессом стволовые клетки (ИССК)

Клетки STAP (Stimulus-triggered acquisition of pluripotency)

В 2014 году группа японских исследователей опубликовала в статью в журнале Nature, где было заявлено открытие нового способа быстрого перепрограммирования соматических клеток млекопитающих в плюрипотентные клетки — так называемые клетки STAP в ответ на действие сильных внешних раздражителей, таких как временное повышение кислотности окружающей среды. Однако другим исследователям не удалось воспроизвести эти результаты. Впоследствии материал о клетках STAP был отозван журналом Nature как ошибочный, один из соавторов работы покончил жизнь самоубийством, а сами работы по этому направлению были прекращены.

Перепрограммирование индуцированное физическим воздействием

Плюрипотентные клетки содержат E-кадгерин, который при дифференцировке заменяется на N-кадгерин. Уникальной особенностью Е-кадгерина, помимо того, что он ответственен за межклеточную адгезию, является способность регулировать сигнальные пути клетки и заменять фактор Oct4 при индукции плюрипотентности. Фибробласты в которых подавлен синтез E-кадгерина не могут перепрограммироваться. Во время перепрограммирования, N-кадгерин может заменять функции E-кадгерина, что предположительно указывает на необходимость адгезии для перепрограммирования. Однако, согласно Гуаньнань Су с соавт., формирование в культуре клеток 3D сфер, в связи с вынужденным ростом клеток на поверхности с низкой связывающей способностью, иногда приводит к репрограммированию клеток. В качестве примера они показали, что нервные клетки-предшественники могут быть получены непосредственно из фибробластов путём физического воздействия, без введения экзогенных перепрограммирующих факторов. Ранее подобные сферы были получены в опытах с фибробластами мыши с мутацией инактивирующей ген-супрессор опухолей ретинобластомы — RB1, белка без которого клетки теряют способность к старым контактам и контактному ингибированию пролиферации в результате чего выходят за пределы колонии и образуют сферы где доминируют новые межклеточные контакты, по всей видимости, и вызывающие самопроизвольное перепрограммирование в тератомоподобные стволовые клетки.

Физические сигналы, в виде параллельных микродорожек на поверхности подложки для культивации клеток, могут заменить действие низкомолекулярных эпигенетических модификаторов и значительно повысить эффективность перепрограммирования. Механизм основан на механомодуляции изменяющей морфологию и эпигенетическое состояние клеток. В частности, по мнению авторов исследования: «снижение активности гистоновой дезацетилазы и повышение экспрессии WD повторяющего домена 5 (WDR5)-субъединицы H3 метилтрансферазы вызванное поверхностью с микродорожками приводит к увеличению ацетилирования и метилирования гистона Н3». Аналогичное действие на клетки оказывали нановолоконные подложки с выровненной ориентацией волокон.

Важным биофизическим фактором влияющим на дифференцировку клеток является жесткость подложки. Например, мягкие субстраты способствуют образованию из ЭСК, по BMP4-зависимому пути, нейроэпителиальных клеток, в то же время предотвращают дифференцировку в клетки нервного гребня. Исследования показали, что в этом механизме задействованы механочувствительное Smad фосфорилирование и ядерно-цитоплазматические перемещения, зависящие от регулируемой жесткостью подложки активности Hippo/YAP1 и сократительной способности комплекса актомиозин-цитоскелет. Механизмы механомодуляции см. в обзорах:

Разработан метод, который превращает соматические клетки в стволовые клетки «сжимая» их с помощью 3D микроокружения состоящего из специально подобранного геля, что открывает путь для крупномасштабного производства стволовых клеток для медицинских целей.

Как отмечено выше, в процессе перепрограммирования клетки морфологически изменяются, что приводит к изменению их способности к адгезии. Эти характерные различия в адгезии позволили разработать процесс выделения плюрипотентных стволовых клеток с помощью микрожидкостныхустройств. Преимуществом этого метода является то что: разделение занимает менее 10 минут, при этом удается получить более чем на 95 % чистую культуру ИПСК клеток, причем выживаемость клеток больше 80 % и полученные клетки сохраняют нормальные транскрипционный профиль, потенциал дифференцировки и кариотип.

Индуцированные нервные стволовые клетки (иНСК)

Центральная нервная система млекопитающих имеет крайне ограниченные возможности для регенерации. Поэтому для лечения многих нервных расстройств (таких как: инсульт, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и т. д.) требуются нервные стволовые клетки, автологичным источником которых могут стать иНСК пациента. В ряде новейших публикаций описано прямое преобразование соматических клеток в индуцированные нервные стволовые клетки.

Так, например, предшественники нервных клеток можно получить прямым преобразованием и без введения экзогенных транскрипционных факторов, пользуясь только химическим коктейлем. Эти клетки, называемые ciNPCs (chemical-induced neural progenitor cells) можно к примеру получить из фибробластов кончика хвоста мыши или мочевыводящих соматических клеток человека, используя для этого коктейль состоящий из:

1. ингибитора HDAC (в качестве такового можно использовать либо вальпроевую кислоту), либо бутират натрия, либо трихостатин А;
2. ингибитора GSK-3 (в качестве такового можно использовать либо CHIR99021, либо карбонат или хлорид лития);
3. ингибитора сигнальных путей TGF бета (либо RepSox, либо SB-431542, либо Tranilast) и поместив клетки в условия гипоксии.

Аналогичным образом без введения экзогенных транскрипционных факторов, пользуясь только химическим коктейлем можно получить Шванновские клетки. По некоторым данным, в принципе, возможно, преобразовать трансплантированные в мозг мыши фибробласты и астроциты человека, спроектированные методами генной инженерии на выработку факторов (Ascl11, Brn2a и Myt1l) индуцирующих их перепрограммирование в нейроны, активируя после трансплантации соответствующие гены с помощью активатора добавленного к питьевой воде животных. Было также показано, что in situ эндогенные астроциты мыши могут быть напрямую преобразованы в функциональные нейроны, способные участвовать в формировании нейросетей. Важно отметить, что в отличие от ИПСК, полученные таким образом клетки не пролиферируют, а значит более безопасны. Наблюдения за подвергшимися этой процедуре мышами в течение года, не выявили у них признаков образования опухоли. Те же исследователи превратили астроциты спинного мозга в прогениторные клетки, называемые нейробластами, которые способны дифференцироваться в нейроны при поврежденнии спинного мозга. В то время как нейроны взрослого человека обычно не в состоянии регенерировать после травмы спинного мозга, нейроны, полученные из человеческих ИПСК, после трансплантации крысам с травмами спинного мозга продемонстрировали значительный рост по всей длине центральной нервной системы животных. Важно отметить, что в эксперименте были использованы ИПСК полученные из клеток кожи, взятых от 86-летнего мужчины. Авторы исследования продемонстрировали, что полученные из ИПСК омоложенные нейроны способны прожить в костном мозге крысы не менее трёх месяцев и в течение этого срока не образовывали опухолей. К сожалению, такая клеточная терапия не привела к излечению крысы от паралича.

Inoue и его коллеги трансплантировали глиальные нервные клетки-предшественники, полученные из человеческих иПСК в поясничный отдел спинного мозга мышей с моделью бокового амиотрофического склероза (БАС). Трансплантированные клетки дифференцировались в астроциты и продлевали жизнь мышей с БАС. Очевидно ИПСК могут стать перспективным ресурсом для трансплантационной терапии БАС.

Разработана технология для прямого преобразование фибробластов в функциональные астроциты с помощью транскрипционных факторов NFIA (Nuclear factor 1 A), NFIB (Nuclear factor 1 B) и SOX9

Как показано в обзоре Бельмонто с соавт. способы прямого преобразования соматических клеток в индуцированные нервные стволовые клетки отличаются по своим методическим подходам. Какой из этих подходов окажется наиболее приемлемым для клиники покажут исследования.

Прогениторные клетки олигодендроцитов (ПКОД)

Без миелиновой оболочки, выполняющей роль изоляции волокон нейронной сети, сигналы посланные по нервам быстро затухают. Поэтому при заболеваниях, связанных с потерей миелиновой оболочки, таких как рассеянный склероз, наблюдается снижение интеллекта, парез, атаксия туловища и конечностей, нарушения зрения, потеря чувствительности и ряд других неврологических симптомов. Перспективным подходом к лечению подобных заболеваний является трансплантация клеток-предшественников олигодендроцитов (ПКОД), способных заново создать миелиновую оболочку вокруг пораженных нервных клеток. Для такой терапии необходимо иметь доступный источник этих клеток. Основу для решения этой проблемы заложил метод прямого преобразования фибробластов мышей и крыс в олигодендроглиальные стволовые клетки индуцированного путём принудительной гиперэкспрессии восьми или всего трёх транскрипционных факторов Sox10, Olig2 и Zfp536. Показано, что аутологичная клеточная терапия с использованием полученных in vitro из ИПСК пациента клеток-предшественниц олигодендроцитов приводит к миелинизации in vivo, что свидетельствует о функциональности этих человеческих клеток в организме мыши и об открывшейся перспективе их использования в клинике.

Индуцированные кардиомиоциты (иКМ)

Одной из наиболее актуальных задач клинической науки нынешнего столетия является развитие терапевтических стратегий, способных обратить вспять прогрессирование сердечной недостаточности — основной причины инвалидности и смертности населения. Большие надежды в этом плане возлагаются на методы клеточной терапии, которые могли бы предотвратить образование соединительной рубцовой ткани вместо мышечной. Простейшим подходом к решению этой задачи могло бы быть перепрограммирование сердечных фибробластов непосредственно в организме путём доставки в сердце факторов транскрипции или микроРНК. Была предпринята попытка перепрограммировать сердечные фибробласты в кардиомиоцит-подобные клетки in vivo путём гиперэкспрессии в них факторов транскрипции Gata4, Mef2c и Tbx5 (GMT). В случае удачи, такой поход позволил бы превращать рубцовую ткань в мышечную непосредственно в сердце, без необходимости клеточной трансплантации. Эффективность такого перепрограммирования оказалась очень низкой, а фенотип полученных кардиомиоцитов существенно отличался от фенотипа нормальных зрелых кардиомиоцитов. Результатом чего явилась низкая выживаемость перепрограммированных клеток. Позднее в опытах in vitro фенотип удалось несколько исправить (добавлением ESRRG, MESP1, Myocardin, ZFPM2 и TGF-β), но эффективность перепрограммирования осталась низкой.

Между тем определенные успехи наметились в методах получения и выращивания большого количества кардиомиоцитов in vitro. Так, например, удалось с высокой степенью эффективности получить из ИПСК человека прогениторные сердечные клетки способные, при трансплантации их в сердечную мышцу, снизить её перерождение в рубцовую ткань после инфаркта. С помощью малых молекул и путём активации синтеза β-катенина или же ингибирования синтеза Wnt в ИПСК человека in vitro, удалось повысить эффективность получения кардиомиоцитов до 80 %.

Возможно, что в будущем удастся заменить искусственные электрокардиостимуляторы, необходимые людям с медленным или нерегулярным сердцебиением, на биологический кардиостимулятор (пейсмекер) из индуцированных стволовых клеток. Надежду на это вселяют эксперименты в которых поросятам делали инъекцию индуцированных сердечных клеток, способных синхронизировать ритм сердцебиения. Более того, при ишемической кардиомиопатии, вызванной смоделированным на мышах инфарктом миокарда, трансплантация ИПСК способствовала синхронизации поврежденных желудочков сердца, улучшая их проводимость и сократимость за счет активации процессов восстановления. Перепрограммированием соматических клеток in vivo с помощью эмбрионального фактора транскрипции T-box 18 (TBX18) можно преобразовать кардиомиоциты в клетки пейсмекера. Это открытие открывает возможность легко и быстро вылечить пациентов зависящих от кардиостимулятора. Перенос гена TBX18 In situ с помощью инъекции его аденовирусного носителя позволяет создать в месте инъекции естественный источник биологического водителя ритма уже через 2-3 дня после введения. При этом пока не наблюдалось возникновения опухолей или каких-либо нарушений в деятельности сердца. Таким образом, минимально инвазивный перенос генов TBX18 может рассматриваться как перспективный метод лечения больных с блокадой сердца, который в будущем, очевидно, заменит лечение искусственными кардиостимуляторами.

Создан коктейль для прямой (без прохождения через плюрипотентное состояние) трансдифференцировки, состоящий из четырёх низкомолекулярных компонентов (SB431542 (ингибитора ALK4/5/7), CHIR99021 (ингибитора GSK3), парната (ингибитора LSD1/KDM1, называемого также транилципромином), и форсколина (активатора аденилатциклазы)). Этот коктейль позволил с высокой эффективностью превратить фибробласты мыши в клетки сердечной мышцы с помощью всего одного фактора транскрипции — Oct4. Полученные таким способом индуцированные кардиомиоциты спонтанно сокращались. Методом прямой трансдифференциации без использования генетических векторов, т.е. чисто фармакологически, с помощью коктейля из девяти компонентов, удалось получить с выходом 97% из фибробластов кожи бьющиеся химически индуцированные кардиомиоцит-подобные клетки (ciCMs), которые почти не отличались от человеческих кардиомиоцитов по данным исследования их транскриптома, эпигенетически и по электрофизиологическим параметрам. Более того, при трансплантации в сердце мыши с инфарктом, обработанные этим коктейлем фибробласты превращались в выглядевшие здоровыми клетки сердечной мышцы.

Лу с соавторами создали биоинженерную конструкцию сердца путём заселения очищенного от клеток (децеллюларизованного) сердца мыши мультипотентными сердечно-сосудистыми прогениторными клетками, полученными из ИПСК человека. Они обнаружили, что мультипотентные сердечно-сосудистые прогениторные клетки направленно мигрируют в соответствии с архитектурой сердца, а прибыв на место, размножаются и дифференцируются в кардиомиоциты, клетки гладких мышц и эндотелиальные клетки, как это необходимо для восстановления утраченной структуры сердца. Очевидно, что внеклеточный матрикс сердца мыши (оставшаяся после удаления клеток мыши подложка сердца) может посылать сигналы мультипотентным сердечно-сосудистым прогениторным клеткам человека, необходимые для их навигации и превращения в специализированные клетки, обеспечивающие нормальную работу сердца. Через 20 дней после перфузии сердца средой содержащей факторы роста, оно, после электростимуляции, начинало биться с темпом 40-50 ударов в минуту и реагировало на медикаменты.

Омоложение мышечных стволовых клеток

Пожилые люди нередко страдают от прогрессирующей дистрофии и слабости мышц, что отчасти связано с повышенной активностью сигнальных путей p38α и p38β митоген-активированных протеин киназ в стареющих мышечных стволовых клетках. Подвергнув такие стволовые клетки непродолжительному воздействию SB202190 — ингибитора p38α и p38β — в сочетании с культивированием на мягкой подложке из гидрогеля, можно быстро омолодить их и размножить. Более того, после имплантации в организм такие омоложенные клетки способны повысить силу старых мышц. Восстановить способность сателлитных стволовых клеток к регенерации можно и подавив синтез на гене p16^INK4a (называемом также Cdkn2a).

Миогенные предшественники, которые могут быть использованы для моделирования болезней или клеточной терапии скелетных мышц, могут быть также получены непосредственно из ИПСК с помощью свободно-плавающей шаровой культуры (EZ сфер) в культуральной среде, содержащей высокие концентрации (100 нг / мл) фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) и эпидермального фактора роста.

Внешние изображения
	[cirmresearch.blogspot.com/2014/02/turning-skin-into-mature-liver-cells.html Так выглядят фибробласты меченые зеленым флуоресценцентным красителем]

Индуцированные гепатоциты

Получение клеток печени из ИПСК

Гепатоциты человека имеют очень ограниченную способность к восстановлению после повреждений печени. Поэтому трансплантация печени нередко является единственным способом лечения таких болезней как цирроз. Клеточная терапия печени затрудняется тем, что культура гепатоцитов плохо размножается in vitro. Поэтому удобнее размножить клетки в виде ИПСК, и только затем превратить их в гепатоциты. Разработано несколько способов получения гепатоцитов из ИПСК Так, например для очистки и размножения самообновляющихся гепатобласт-подобных клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК/ИПСК), их культивировали на чашках покрытых человеческим ламинином-111 в течение более 3 месяцев, после чего они подобно овальным клеткам печени были способны дифференцироваться в гепатоцит-подобные клетки, а также в клетки желчных путей — холангиоцит-подобные клетки. Было показано, что такие гепатобласт-подобные клетки могут интегрироваться в паренхиму печени мыши. Предполагается, что, благодаря подавлению неблагоприятных генных регуляторных сетей при культивировании на поверхности покрытой ламинином, гепатоциты имеют большое сходстве с взрослыми гепатоцитами и могут быть использованы для скрининга лекарственных средств, а также в качестве источника клеток для регенеративной терапии печени.

В 2010 году была продемонстрирована возможность индуцировать полученные из жировой ткани стромальные клетки (ASC) в клетки похожие по ряду функций на гепатоциты человека, способные прижиться в поврежденной токсинами печени мыши. Позднее был разработан быстрый (до десяти дней) и эффективный (с выходом более 50 процентов) способ превращать клетки полученные путём липосакции в клетки печени. Клетки, полученные из собственных клеток человека с помощью этой новой методики, превращаются в клетки печени без промежуточной фазы плюрипотентных клеток и, очевидно, не образуют опухоли. В печени они формируют многоклеточные структуры необходимые для образование желчных протоков. Особенностью этой методики является культивирование адипоцитов в жидкой суспензии, в которой они образуют сфероиды

Обнаруженная у совместной культуры гепатоцитов, полученных из ИПСК, с эндотелиальными (для образования сосудов) и мезенхимальными (для образования поддерживающего внеклеточного матрикса) клетками, способность к самоорганизации (самосборке) в трёхмерные шарообразные структуры, представляющие собой зачаток печени позволяет надеяться, что в будущем трансплантологам: не надо будет искать и ждать донора, больному будут пересаживать зачаток нужного органа, полученный из его же собственных клеток, и этот зачаток будет уже на месте дорастать до нужных размеров. Эта методика позволяет использовать клетки всего одной мыши для предварительной проверки 1.000 лекарственных препаратов на их пригодность для лечения болезней печени, что открывает новые возможности для медицинских исследований и проверки безопасности лекарств.

Методы получения гепатоцитов без использования ИПСК

Для получения гепатоцитов из человеческих фибробластов не обязательно вначале получить ИПСК. Используя небольшие молекулы можно добиться прямого перехода фибробластов в индуцированные мультипотентные прогениторные клетки (iMPC) из которых затем образуются сначала прогениторные клетки эндодермы, а затем гепатоциты. После трансплантации мышкам с иммунодефицитом и смоделированным поражением печени, клетки iMPC интенсивно размножаются и приобретают функциональные способности характерные для взрослых гепатоцитов. Важно отметить, что при этом не наблюдалось образование опухолей, потому что клетки не проходили через стадию плюрипотентного состояния. С помощью инфицирования лентивирусами, вызывающими экспрессию генов FOXA3, HNF1A и HNF4A, удалось осуществить прямое преобразование фибробластов человека во взрослые гепатоцито-подобные клетки, которые могут быть размножены в культуре, а затем использованы для лечения острой печеночной недостаточности и метаболической болезни печени..

Инактивация сигнального пути Hippo in vivo с высокой эффективностью приводит к дедифференцировке взрослых гепатоцитов в клетки, несущие характеристики прогениторных клеток. Эти клетки-предшественники продемонстрировали способность к самообновлению и смогли прижиться в печени. Эти данные продемонстрировали беспрецедентный уровень фенотипической пластичности зрелых гепатоцитов . Подробнее см. обзор:

Клетки продуцирующие инсулин

Осложнения сахарного диабета, такие как сердечно-сосудистые заболевания, ретинопатия, невропатия, нефропатия и заболевания периферического кровообращения обусловлены дисрегуляцией сахара в крови из-за недостаточной продукции инсулина панкреатическими бета-клетками и при отсутствии адекватного лечения могут привести к летальному исходу. Одним из перспективных подходов к лечению диабета является трансплантация β-клеток, источником которых могли бы стать плюрипотентные стволовые клетки, (в том числе ЭСК и ИПСК). Однако β-клетки, получаемые из плюрипотентных стволовых клеток, имеют фенотип характерный для функционально незрелых β-клеток эмбрионального типа и отличаются от взрослых β-клеток повышенным уровнем базальной секреции глюкозы и отсутствием способности реагировать на сигналы стимуляции её синтеза (что подтверждают и результаты секвенирования РНК транскриптов).

Избыточная экспрессия комбинации трёх транскрипционных факторов (PDX1, NGN3 и MAFA) называемой PNM, способна привести к трансформации некоторых видов клеток в состояние подобное β-клеткам. Оказалось, что наиболее подходящим и доступным источником для перепрограммирования в инсулин-продуцирующие клетки, является эпителий кишечника. Под действием PMN трёхмерная культура зачатков органа (так называемые органоиды) стимулирует превращение эпителиальных клеток кишечника в β-подобные клетки, которые можно использовать для трансплантации.

Биоинженерия клеток кровеносных сосудов

Кровеносные сосуды образуют обширные сети, которые в течение всей жизни обеспечивают клетки организма питательными веществами и кислородом. Когда кровеносные сосуды становятся старше, их структура и функции, нередко, отклоняются от нормы, способствуя тем самым многочисленным возрастным заболеваниям, таким как: инфаркт миокарда, ишемический инсульт и атеросклероз артерий, питающих сердце, мозг и нижние конечности. Поэтому, важной задачей является стимулирование роста сосудов для обеспечения циркуляции, чтобы предотвратить обострение этих заболеваний. Одим из способов стимулирования роста сосудов является имплантация индуцированных прогениторных клеток эндотелия (иПЭк). Так, например, с помощью иПЭк, полученных путём частичного репрограммирования клеток эндотелия, удалось добиться увеличения коронарного кровотока и по данным эхокардиографии улучшить функционирование сердца. Стволовые клетки, извлеченные из жировой ткани после липосакции можно превратить в прогениторные гладкие мышечные клетки (иПГМк), участвующие в формировании артерий и вен. Это клетки могут быть использованы для создания кровеносных сосудов, необходимых для замены неисправных артерий сердца. Так, например, обнаружено, что с помощью культуры ИПСК человека в сочетании с селекцией с помощью трёх маркеров: CD34 (поверхностного гликофосфопротеина ранних эмбриональных фибробластов), NP1 (рецептора — нейрофилин1) и KDR (киназы содержащей домен рецептора), удалось получить эндотелиальные клетки, которые после трансплантации мышам образовали in vivo стабильные функциональные кровеносные сосуды, работавшие на протяжении по меньшей мере 280 дней..

При лечении инфаркта миокарда важно предотвратить образование фиброзных тканей шрама и стимулировать регенерацию. Достичь этого in vivo можно применив паракринные факторы способные изменить направление дифференцировки сердечных стволовых клеток предшественников от специализации в фиброзную рубцовую ткань в сторону образования сердечно-сосудистой ткани. Например, на мышиной модели инфаркта миокарда, было показано, что однократная интрамиокардиальная инъекция мРНК фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A modRNA), синтетически модифицированной так чтобы предотвратить её деградацию организмом, приводит к длительному улучшению функции сердца, обусловленному перенаправлением дифференцировки эпикардиальных клеток-предшественников в сердечно-сосудистый тип клеток.

Мервин Иодер с соавт., описали метод для преобразования ИПСК человека в клетки, подобные эндотелиальным колониеобразующим клеткам пуповинной крови (CB-ECFCs). Полученные ими CB-ECFC-подобные клетки имели стабильный эндотелиальный фенотип, высокий пролиферативный потенциал и способность, при трансплантации мышкам, образовывать человеческие кровеносные сосуды, а также участвовать в регенерации сетчатки и конечностей мыши после ишемии. Важно отметить, что индуцированные CB-ECFC-подобные клетки практически не образуют тератомы.

Прямое перепрограммирование клеток взрослого организма в прогениторные нефроны (ИПН)

Взрослые клетки проксимальных канальцев почки могут быть непосредственно перепрограммированы в прогениторные нефроны эмбриональной почки, с использованием пула из шести генов кодирующих «инструктирующие» факторы транскрипции (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes absent homolog 1(EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) и Snail homolog 2 (SNAI2)). Возможность получения таких клеток позволит в будущем приступить к разработке методов клеточной терапии почечных заболеваний. Первые успехи на этом пути уже есть. Так, недавно было показано, что эмбриональные органоиды почки, сформированные путём самоорганизации из клеточной суспензии, после трансплантации их во взрослую почку крысы могут в ней прижиться.

Биоинженерия стволовых клеток крови

Одной из самых востребованных целей регенеративной медицины является возможность получения в неограниченном количестве гемопоэтических стволовых клеток, пригодных для трансплантации, из более зрелых или дифференцированных клеток крови, для того чтобы покрыть дефицит трансплантатов костного мозга. Чтобы запустить в фибробластах процессы гемопоэза в условиях in vitro достаточно всего четырёх транскрипционных факторов: Gata2, Gfi1b, cFos, и Etv6 . Их воздействие приводит к образованию клеток подобных эндотелиальным — прогениторным клеткам с последующим возникновением из них кроветворных клеток. Аналогичным образом, используя 6 транскрипционных факторов: Run1t1, Hlf, Lmo2, Prdm5, Pbx1, и Zfp37, а также ещё два фактора Mycn и Meis1 для повышения эффективности перепрограммирования, удалось получить гемопоэтические стволовые клетки из зрелых дифференцированных клеток крови.

См. также обзоры:

Эритроциты

Переливание эритроцитов необходимо для многих пациентов с травмами или гематологическими заболеваниями. Однако, на сегодняшний день, поставка эритроцитов зависит от добровольных доноров число которых недостаточно. Кроме того, переливание крови от доноров сопряжено с определенным риском из-за возможности передачи ряда инфекций. Решить эту проблему могло бы производство необходимых количеств эритроцитов вне организма. В принципе уже доказано, что эритроциты, полученные вне организма из мобилизованных CD34-позитивных клеток (CD это на англ. сокращенно кластер дифференцировки), способны выжить при переливании аутологичному реципиенту. Эритроциты, получаемые in vitro, как правило, содержат исключительно зародышевый гемоглобин (HbF), который непригоден для нормального функционирования эритроцитов во взрослом организме. Тем не менее, in vivo, после трансфузии полученных из ИПСК эритроидных прогениторных клеток содержащих ядро, наблюдалось переключение на синтез взрослой изоформы гемоглобина. Однако в этом случае возникает другая проблема: несмотря на то, что эритроциты не имеют ядер, и, следовательно, не могут образовывать опухоли, их непосредственные предшественники эритроидные прогениторные клетки ядром обладают и следовательно потенциально опасны. Созревание эритробластов в функционально зрелые эритроциты требует сложного процесса реорганизации, который заканчивается удалением ядра с образованием безъядерных эритроцитов. Увы, методы перепрограммирования клеток в настоящее время часто приводят к нарушению этих процессов энуклеации и поэтому использование эритроцитов или их непосредственных предшественников эритробластов для переливания ещё недостаточно защищено от возможности образования опухолей. Тем не менее Bouhassira и его коллеги обнаружили, что кратковременное воздействие цитокинов, благоприятствующих дифференцировке стволовых клеток в эритроидные, на CD34 позитивные клетки, до их размножения с последующей пролиферацией полученных предшественников, позволяет получать на порядок больший выход эритроидных клеток, чем наблюдалось ранее. И что самое главное: эти красные кровяные клетки имели те же изоформы глобина что и использованные в качестве источника CD34 позитивные клетки. Значительно повысить выход эритроидных клеток из ИПСК или же эритроцитов из человеческих гемопоэтических стволовых клеток позволяет подавление гена SH2B3 или его инактивация генным редактированием с помощью CRISPR/Cas9

Интересно также отметить, что важную роль в развитии нормальных клеток крови играет сигнальный путь рецептора арил-углеводородов (AhR) (который как было установлено, содействует и образованию раковых клеток). Активация AhR в человеческих гемопоэтических клетках-предшественницах (HPS) приводит к беспрецедентной пролиферации HPS, мегакариоцитов и клеток эритроидных линий..

Подробный обзор методов получения эритроцитов см. в

Тромбоциты

Тромбоциты играют важную роль в предотвращении кровоизлияния у больных с тромбоцитопенией или с тромбоцитемией. Серьезной проблемой для пациентов после повторных переливаний тромбоцитов является развитие иммунных реакций. Поэтому для клиники большое значение имеет возможность получения тромбоцитов, не содержащих HLA-антигены, вне организма и на средах, не содержащих сыворотки. Некоторых успехов в этом направлении добились Figueiredo с соавторами. Используя РНК-интерференцию для подавления синтеза β2-микроглобулина в CD34-положительных клетках, они сумели получить тромбоциты, в которых на 85 % было снижено содержание антигенов HLA.

Разработан метод получения тромбоцитов, который заключается в создании из ИПСК человека устойчивых иммортализованных линий клеток-предшественников мегакариоцитов (imMKCLs) путём доксициклин-зависимой гиперэкспрессии Bmi1 и BCL-XL. Полученные imMKCLs можно размножать и культивировать в течение длительного периода (4—5 месяцев), причем даже после криоконсервации. Прекращение сверхэкспрессии c-MYC, Bmi1 и Bcl-X L (путём удаления доксициклина из среды) заставляло эти клетки производить тромбоциты CD42b+, которые по большинству параметров не отличались от тромбоцитов крови.

Альтернативный подход получения мегакариоцитов, с высоким выходом (3 единицы (2.4 × 10¹¹ тромбоцитов на единицу) тромбоцитов для переливания с одного миллиона клеток ИПСК) и с чистотой более 90%, позволяет культивирование на среде без продуктов животного происхождения (а потому с достаточно определенными, предсказуемыми условиями, что важно для получения надёжно воспроизводимых результатов). Для перепрограммирования использовалась лентивирусная трансдукция, приводящая к одновременной экзогенной экспрессии трех факторов транскрипции: GATA1, FLI1 и TAL1.

Обзор по проблемам связанным с производством тромбоцитов см.

Иммунные клетки

Вырабатываемый иммунной системой специализированный тип белых кровяных клеток, известный как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), способен распознать специфические маркеры на поверхности различных инфекционных или опухолевых клеток и уничтожить эти вредоносные клетки. Поэтому иммунотерапия с использованием антиген-специфических Т-клеток в будущем может быть использована для борьбы со многими видами рака и вирусных инфекций. Организм производит очень мало таких клеток и выделить их в количестве необходимом для терапии очень сложно. Потенциально эффективным подходом получения этих клеток для терапии может быть технология заключающаяся в том чтобы превратить зрелые CTL в ИПСК, которые обладают способностью к неограниченной пролиферации in vitro, размножить эти ИПСК до необходимого количества и затем провести их дифференцировку обратно в зрелые CTL. Ещё большие возможности обещает метод, который сочетает две технологии — 1. получение ИПСК и превращение их в Т-клетки, и 2. последующую их генетическую модификацию, с помощью технологии конструирования химерных рецепторов антигенов (CAR), позволяющую им распознавать раковые клетки-мишени по антигенам, в частности по CD19 — антигену, синтезируемому злокачественными В-клетками. По аналогичной технологии можно было бы создать распознающие белок PBP2A Т-клетки направленные против устойчивых к антибиотикам бактерий таких как метициллин-резистентный золотистый стафилококк.

Большой клинический потенциал в качестве адъюванта для иммунотерапии рака имеют инвариантные естественные киллеры T (INKT) — клетки, которые могут служить в качестве моста между врожденной и приобретенной иммунной системами. Они повышают противоопухолевую активность организма, производя гамма-интерферон (ИФН-γ). Предложен концептуальный метод использования INKT клеток, полученных из ИПСК, для терапии рака, который состоит из четырёх ступеней: (1) выделение минимального количества INKT клеток, (2) перепрограммирования этих INKT клеток в ИПСК, (3) размножение этих ИПСК в культуре и дифференцировка их обратно в INKT клетки и (4) инъекция, полученных INKT клеток, подопытным животным для терапии рака.

Для терапии могут быть использованы также дендритные клетки, которые участвуют в контроле Т-клеточного ответа. После инъекции они могут выжить достаточно долго, чтобы стимулировать антиген-специфические CTL, после чего могут быть полностью устранены. Неисчерпаемым источником для терапии вакцинами могут служить антиген-представляющие дендритные клетки, полученные из человеческих ИПСК.

В-клетки способны к быстрой (за 2-3 дня) трансдифференцировке в макрофаги под воздействием транскрипционного фактора C / EBPα. Кроме того эффективность перепрограммирования В-клеток в ИПСК с помощью транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и Myc под воздействием C / EBPα возрастает 100-кратно и охватывает порядка 95 % популяции клеток. Интересно отметить, что с помощью C / EBPα можно преобразовать некоторые линии в-клеток лимфомы человека и лейкоза в макрофаг-подобные клетки уже не способные к дальнейшему онкогенезу.

Омоложение эпителиальных клеток тимуса

Тимус является органом, размеры которого существенно сокращаются с возрастом. Это сокращение является одной из основных причин того, что иммунная система с возрастом становится менее эффективной. Одним из центральных звеньев механизма возрастной инволюции тимуса является снижение синтеза транскрипционного фактора FOXN1. Клэр Блэкберн и её коллеги показали, что даже далеко зашедшая возрастная инволюция тимуса может быть обращена вспять путём принудительного усиления активности в эпителиальных клетках тимуса всего одного фактора транскрипции — FOXN1 с целью содействия омоложению, пролиферации и дифференцировки этих клеток в полностью функциональный эпителий. Более того они показали, что принудительная экспрессия Foxn1 позволяет перепрограммировать клетки кожи — фибробласты в функциональные эпителиальные клетки тимуса. Эти FOXN1-индуцированные эпителиальные клетки тимуса (iTECs) поддерживали эффективное развитие in vitro линий клеток CD4+ и CD8+ тимуса. Но, что самое главное, после трансплантации в почку мыши, iTECs собирались и образовывали полностью организованный и функциональный тимус, который содержал все подтипы эпителиальных клеток тимуса, необходимых для поддержки дифференцировки Т-клеток, в результате чего иммунная система реципиента пополнялась новыми Т-клетками. Это открытие можно считать первым примером выращивания органов из трансплантированных индуцированных стволовых клеток. В будущем этот метод может быть широко использован для повышения иммунной функции у пациентов путём трансплантации тимуса.

Индуцированные стволовые/стромальные клетки мезенхимы (ИМСК)

Благодаря своим способностям вызывать иммуносупрессию и способности к дифференцировке во многие типы мезенхимальных тканей, стволовые/стромальные клетки мезенхимы (МСК) интенсивно исследуются на предмет их применения для лечения сердца, почек, нервной ткани, суставов и регенерации костей, а также терапии воспалительных заболеваний и подавления реакции отторжения при трансплантации. МСК, как правило, получают путём болезненных, инвазивных процедур из взрослого костного мозга или жира, при этом выход очищенных МСК составляет всего лишь 0,001 % — 0,01 % от клеток костного мозга и 0,05 % от аспирата липосакции. На практике удобнее всего получать МСК из аспирата липосакции, при этом удаляют взрослые адипоциты, которые успели потерять способность к пролиферации. Между тем взрослые адипоциты легко можно выделить и подвергнуть дедифференцировке в так называемые дедифференцированные жировые клетки (ДДЖК), которые возвращают способность к пролиферации и мультипотентность. При соответствующих условиях культивирования in vitro или окружения in vivo ДДЖК могут дать начало адипогенным, остеогенным, хондрогенным или миогенным прогениторным клеткам, а также стимулировать неоваскуляризацию то есть проявляют те же свойства, что и МСК костного мозга. У пожилых пациентов, которые больше всего нуждаются в восстановлении тканей путём аутологичной клеточной терапии, с возрастом наблюдается резкое возрастное снижение количества и качества МСК и адипоцитов. Вместе с тем, известно, что ИПСК могут быть получены путём омоложения клеток даже от столетних людей. Поэтому ИПСК, которые легко можно получить перепрограммированием клеток из тканей пациента и затем практически неограниченно размножать in vitro, может стать удобным источником омоложенных МСК.

Chen с соавт. обнаружили, что воздействуя на ИПСК человека препаратом SB-431542 можно достаточно быстро получить однородную культуру клеток ИМСК, которые по свойствам мало чем отличаются от молодых МСК. По мнению авторов статьи такие ИМСК не обладают способностью к образованию тератом и имеют стабильный кариотип, а поэтому могут быть использованы для терапии В настоящее время пока мало данных об эффективности и долгосрочной безопасности полученных этим методом ИМСК in vivo. Известно только что ИМСК могут быть использованы в клинике для лечении периодонтита и разработки методов ортопедии

Культуры мезенхимальных стволовых клеток человека могут быть использованы in vitro для массового производства экзосом, которые, как выяснилось, идеально подходят в качестве средства для доставки лекарств и для доставки в клетку-мишень факторов транскрипции или микроРНК индуцирующих перепрограммирование (дедифференцировку, дифференцировку или трансдифференцировку).

Индуцированные хондрогенные клетки (ИХОНК)

Хрящ соединительной ткани обеспечивает движение суставов без трения. Его дегенеративное перерождение в конечном счете, приводит к полной потере функции сустава на поздних стадиях остеоартрита. Единственным типом клеток в хряще являются хондроциты окруженные выделяемым ими внеклеточным матриксом. В настоящее время исследователи используют два способа восстановления хрящевой ткани:

• получением хондроцитов из плюрипотентных клеток (ЭСК/ИПСК).
• получением хондроцитов прямым преобразованием фибробластов человека непосредственно в индуцированные хондрогенные клетки, минуя промежуточную стадию плюрипотентных клеток, с помощью трёх факторов репрограммирования (с-Мус, KLF4, и SOX9).

Преимуществом первого метода является быстрое размножение культуры исходных клеток. Преимуществом второго — отсутствие в культуре плюрипотентных клеток, которые могли бы вызвать тератому. Клетки, полученные прямым перепрограммированием, синтезировали коллаген типа II. После имплантации в область поражения они смогли выжить и в течение не менее четырёх недель участвовали в образовании хрящевой ткани у мышей.

Источники соматических клеток

Наиболее часто для перепрограммирования используют получаемые биопсией фибробласты кожи и клетки крови, однако удобнее получать соматические клетки из мочи. Этот способ не требует биопсии или взятия образцов крови и поэтому безвреден для пациента. Стволовые клетки мочи имеют способность к мультипотентной дифференцировке. Они способны дифференцироваться в эндотелиальные, остеогенные, хондрогенные, адипогенные, скелетные миогенные и нейрогенные линии и вместе с тем не образуют тератомы.. Поэтому их эпигенетическая память хорошо подходит для перепрограммирования в ИПСК. Вместе с тем, клеток в моче мало, эффективность их превращения в стволовые клетки низка, тогда как риск бактериального заражения выше, по сравнению с другими источниками клеток.

Ещё одним перспективным источником клеток для перепрограммирования являются мезенхимальные стволовые клетки, полученные из фолликулов человеческого волоса. и кератиноциты

Важно отметить, что происхождение соматических клеток используемых для перепрограммирования может оказывать влияние на эффективность перепрограммирования, функциональные свойства получаемых индуцированных стволовых клеток и способность к образованию опухолей.

При выборе источника для перепрограммирования, во внимание следует принимать тот факт, что ИПСК сохраняют эпигенетическую память о тканях из которых они произошли, и что это влияет на их способность к направленной дифференцировке Остаточная эпигенетическая память не обязательно проявляется на стадии плюрипотентности — ИПСК, полученные из разных тканей имеют надлежащую морфологию, в них активны гены характерные для плюрипотентности, и они способны дифференцироваться в ткани трёх эмбриональных слоев как in vitro, так и in vivo. Однако, эта эпигенетическая память может проявиться позже, во время повторной дифференцировки в специфические типы клеток, которая требует активации локусов, сохранивших элементы остаточной эпигенетической памяти.

Культуральная среда для плюрипотентных стволовых клеток свободная от питающих клеток и сыворотки

Для выращивания плюрипотентных стволовых клеток человека обычно используются так называемые питающие клетки (feeder cells) и сыворотка из эмбрионов быка (FBS). И то и другое является продуктами животного происхождения и может изменять свойства от партии к партии, что затрудняет стандартизацию условий. Кроме того выращивание стволовых клеток на клетках другого человека или животных создает риск загрязнения патогенными микроорганизмами, которые могут стать источником болезни для пациента после клеточной терапии.. Поэтому компоненты животного происхождения требуют дорогостоящего контроля на качество, и их свободу от патогенов, полиаминоксидазы и антигенов. Для замены питающих клеток используются различные подложки, такие как: Matrigel, CELLstart, рекомбинантные белки и синтетические полимеры такие как Synthemax (см. обзор к статье .

Известно, что важную роль в адгезии клеток друг к другу и к внеклеточному матриксу играет тримерный белок ламинин. Было найдено что ламинин-511, названный так за то, что он содержит α5 , β1 и γ1 цепи, если его нанести на дно чашки Петри способен поддерживать стабильную культуру ЭСК или ИПСК. На основе этого открытия была разработана стандартная методика для длительного культивирования ЭСК и ИПСК человека в чашках покрытых rLN511E8 — рекомбинантным фрагментом ламинина −511 и с безсывороточной средой StemFit™. Аналогичная методика но с использованием ламинина-521 и E-кадгерина позволила клонировать in vitro эмбриональные стволовые клетки без необходимости использовать ингибиторы ROCK (англ. Rho-associated protein kinase). Интересно было бы применить её и для ИПСК.

В стадии разработки находится также очень дешевая подложка из углеродных нанотрубок. Она позволит выращивать и проводить дифференцировку стволовых клеток в промышленных масштабах. По заверениям авторов изобретения, изменяя условия изготовления этой подложки, можно так изменить её свойства, что она будет влиять на способность выращиваемых клеток к адгезии, на их пролиферацию и морфологию образуемых клеточных колоний.

Для трёхмерного культивирования широко используют гидрогели, такие как, например, гидрогель для получения кардиомиоцитов в одну стадию

Способы доставки репрограммирующих факторов в ядро

Способы доставки можно подразделить на вирусные и невирусные, а также на те, что связаны с интеграцией векторов несущих репрограммирующие факторы в геном и действующие без интеграции.

(Значками отмечены свойства соответствующего вектора: (+)- Геномная интеграция происходит; (±)- интеграция происходит, но очень редко; (-)- вектор не интегрируется; (тр)- после интеграции векторная конструкция должна быть удалена транспозазой.)

Доставка вирусами

Чаще всего для доставки используются вирусные векторные системы. Вирусы используют свой врожденный механизм заражения клетки, что позволяет использовать их для доставки и внедрения кассеты генов необходимых для экспрессии репрограммирующих факторов В качестве вирусов для доставки генов обычно используют:

• Ретровирусы(+). Они в качестве генома содержат одноцепочечную молекулу РНК. С помощью обратной транскрипции на РНК вируса синтезируется линейная двухцепочечная ДНК которая затем интегрируется в двухцепочечную ДНК генома клетки-хозяина. Описан метод эффективного перепрограммирования клеток человека в ИПСК с помощью одного вектора содержащего четыре ТФ, в сочетании с коктейлем, содержащим три небольшие молекулы. Приведены прописи аналогичных методов.
• Лентивирусы(+). Они являются подклассом ретровирусов. В отличие от ретровирусных векторов, лентивирусные векторы могут заражать не только делящиеся клетки, но и находящиеся в покое терминально дифференцированные клетки. Удаляемая полицистронная кассета STEMCCA представляющая собой вырезаемый Cre-рекомбиназой перепрограммирующий лентивирусный вектор позволяет осуществлять свободное от трансгенов перепрограммирование взрослых фибробластов кожи человека в ИПСК.

• Вирус Сендай (-) — вирус из семейства Paramyxoviridae, содержащий одноцепочечную РНК. Вирус Сендай считается безопасным, потому что его генетический материал не включается в ДНК клетки, и от него достаточно легко избавиться инкубацией культуры клеток при повышенной температуре. Вирус от тепла погибает, тогда как трансформируемым клеткам такая обработка не вредит. Для получения ИПСК этим методом можно воспользоваться готовыми наборами. В отличие от ретровирусных и эписомных векторов, при перепрограммировании с использованием вируса Сендай пока не наблюдалось дефектных клонов, не способных к дифференцировке. Описание метода см.
• Венесуэльский вирус лошадиного энцефалита (VEE) (-) у которого структурные белки удалены, но все ещё присутствуют неструктурные белки, позволяет с помощью самореплицирующегося полицистронного репликона РНК внести в клетку однократной трансфекцией четыре перепрограммирующих фактора (OCT4, KLF4, SOX2 и либо c-MYC либо GLIS1) .
• Не интегрирующиеся аденовирусы (±). По мнению некоторых авторов, векторную кассету, после того как перепрограммирование достигнуто, можно удалить с помощью трансфекции мРНК Cre рекомбиназы, что якобы позволяет сочетать высокую эффективность вирусной доставки с достоинствами перепрограммированных клеток, свободных от остатков трансгенов, которые могут вызывать злокачественную трансформацию.

Невирусная доставка векторов

По сравнению с вирусными векторами, не-вирусные векторы являются потенциально менее иммуногенными и их сравнительно легче использовать в условиях клиники.

Невирусным подходом является прямая доставка в клетку синтетической мРНК(-) кодирующей четыре канонических фактора Яманаки: KLF4, c-MYC, OCT4, и SOX2. Метод позволяет достичь высокой эффективности перепрограммирования, но технически сложен и сильно зависит от качества реактивов. Недавно он был модифицирован, что позволило сократить продолжительность процесса и число необходимых реагентов.

Перепрограммирование мышечных клеток головастиков Xenopus в недифференцированные клетки может быть достигнуто In vivo с помощью ДНК(±) мыши кодирующей Oct4, Sox2, и Klf4 в условиях способствующих регенерации.

Привлекательным методом невирусной доставки генов, который позволяет эффективно встраивать желаемую ДНК в геном различных клеток является использование транспозонов — сложных структур содержащих дискретные куски ДНК, обладающие способностью изменять своё местоположение в геноме посредством механизма транспозиции (инсерции), вынуждающего его включиться или наоборот покинуть определенный участок генома. Транспозон состоит из инсерционных сегментов ДНК, которые могут перемещаться как единое целое, захватывая лежащие между ними гены. Описано несколько транспозонных систем пригодных для транспортировки генов в клетки млекопитающих. Это «Спящая красавица» — Sleeping Beauty (SB), SB100X, и Tol2 и PiggyBac (PB). Разработаны эффективные методики получения ИПСК мыши и человека введением в соматические клетки векторов на основе PiggyBac (тр) В том числе с кассетой из ДНК кодирующей 6 факторов (Oct4, c-Myc, Klf4, Sox2 плюс Rarg (retinoic acid receptor gamma — RAR-γ) и Lrh-1 (liver receptor homologue 1 известный также как Nr5a2)., что позволило сократить продолжительность перепрограммирования до 4-12 дней и поднять его эффективность до уровня сопоставимого с методами переноса ядер и слияния клеток.

Векторные системы на основе эписомных плазмид(±). Перепрограммирование основанное на использовании эписомных плазмид считается наиболее эффективным и безопасным так как не требует интеграции трансгенов в геном. Однако первоначально эффективность перепрограммирования этим методом была крайне низка (менее 0,0002 %.) . Значительно увеличить эффективность индукции ИПСК позволило использование комбинации плазмид, кодирующих OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 и малой интерферирующей РНК для ингибирования гена TP53, кодирующего белок p53 (супрессор опухолей, ингибирующий перепрограммирование) в сочетании с Эпштейн-Барр ядерным антигеном 1 (EBNA1), который является белком вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), необходимым для амплификации эписомных векторов Разработаны полицистронные свободные от вирусов плазмиды (±), содержащие последовательности самовыщепляющегося 2A пептида (пептида, который взаимодействуя с рибосомой инициирует отделение от растущего полипротеина, вызвав «пропуск» последней пептидной связи на С-конце 2А) и постоянно активный промотор вируса энцефаломиокардита (CMV).

Рекомбинантные белки (-) представляют собой проникающие в ядро белки, полученные путём рекомбинации (в данном случае, присоединения последовательности, кодирующей поли-аргининовый домен трансдукции, к генам четырёх перепрограммирующих факторов: Oct4, Sox2, Klf4 и C-Myc, на участке соответствующем их С-концевой последовательности, и, кроме того, постоянно активного промотора вируса энцефаломиокардита) с последующим синтезом этих белков в тельцах включения бактерии E.coli. Выделенные из E. coli и очищенные рекомбинантные белки используются для репрограммирования без интеграции. Эффективность репрограммирования с помощью рекомбинантных белков ничтожно мала, но может быть существенно увеличена при воспалении вызываемом поли I:C (синтетическим аналогом двухцепочечной РНК).

Химически индуцированные плюрипотентные клетки (ХИПСК)

Используя для перепрограммирования исключительно малые молекулы, китайские ученые Дэн Хонгкуй с коллегами показали, что для перепрограммирования клеток достаточно эндогенных «мастер генов». Они индуцировали плюрипотентное состояние у взрослых клеток мыши, используя семь низкомолекулярных соединений. Эффективность метода оказалась достаточно высокой: она была в состоянии преобразовать 0,2 % взрослых клеток ткани в ИПСК, что сопоставимо с результатами получаемыми при использовании экзогенных «мастер генов» доставляемых вирусными векторами. Авторы отмечают, что полученные от мышей CiPSCs были на «100 % жизнеспособными и здоровы на протяжении, по меньшей мере, 6 месяцев наблюдения». В число этих семи низкомолекулярных соединений входили:

• вальпроевая кислота — жирная кислота с разветвленной цепью — ингибитор гистондеацетилазы, повышает эффективность перепрограммирования соматических мышиных эмбриональных фибробластов (примерно в 100 раз), способствуя активации генов плюрипотентности и репрессии генов линейной дифференцировки.
• ингибитор GSK3 — гликоген синтез киназы 3 (CHIR) (подробнее см.). Ингибирование GSK3 имитирует активацию сигнального пути Wnt в результате чего β-катенин избежав деградации входит в ядро, где активирует синтез ферментативной субъединицы теломеразы (TERT);
• ингибитор трансформирующего ростового фактора бета (E-616452). Низкомолекулярный ингибитор TGF-[бета] сигнализации в ходе перепрограммирования заменяет Sox2 активируя Nanog;
• ингибитор моноаминоксидазы антидепрессант транилципромин одновременно является ещё и ингибитором деметилазы которая избирательно удаляет метильные группы с лизина в положении Лиз4 или Лиз9 гистона H3. Действуя на хроматин транилципромин вызывает глобальное увеличение H3K4 метилирования и как следствие этого дерепрессию генов . Интересно отметить, что ингибиторы деметилаз обладают ещё и способностью подавлять избыточную пролиферацию клеток и таким образом подавлять развитие раковых опухолей
• Форсколин (forskolin) — препарат, активирующий аденилатциклазу — фермент, катализирующий превращение АТФ в цАМФ;
• ингибитор гидролазы S-аденозилгомоцистеина (под названием 3-деазанепланоцин (DZNep)), вещество вызывающее разрушение поликомб репрессорного комплекса PRC2 и ингибирующее метилирование гистонов.
• PD-0325901 — высокоизбирательный и сильнодействующий синтетический ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы MEK, избирательно фосфорилирующей серин / треонин и остатки тирозина в активационной петле её субстратов. PD-0325901 проходит испытания в качестве противоопухолевого препарата.

Методы и составы «коктейлей» из малых молекул для химического воздействия на мышечную ткань с целью активации процессов образования функциональных сердечных, скелетных и гладкомышечных клеток и регенерации поврежденных тканей in situ можно найти в обзоре Джанга и Виллиамса. С механизмами действия малых молекул при перепрограммировании можно ознакомиться в обзорах.

В 2015-м году система химического перепрограммирования была усовершенствована — разбита на три этапа с использованием разных «коктейлей» на разных этапах. Были найдены новые малые молекулы. Это позволило поднять выход перепрограммированных клеток почти в 1000 раз.

Краситель для выявления плюрипотентных клеток человека

Для безопасной терапии индуцированными стволовыми клетками необходимы несложные методы обнаружения и разрушения недифференцированных стволовых клеток. С этой целью широко используются антитела SSEA-4 и SSEA-5, а также антитела на антигены: антитело TRA-1-60 на трансмембранный гликопротеин подокаликсин (podocalyxin), Oct3/Oct4 и Nanog. Эти вещества как и большинство белков стоят недешево и быстро портятся. Гораздо более стабильным и дешевым реагентом способным отличить плюрипотентные стволовые клетки от дифференцированных клеток оказался флуоресцентный краситель KP-1 (Kyoto probe 1), который избирательно красит в митохондриях альдегиддегидрогеназу 2 (ALDH2). Эта селективность KP-1 зависит от способности митохондрии удалить его с помощью транспортных белков множественной лекарственной устойчивости ABCB1 и ABCG2, экспрессия которых подавляется в плюрипотентных клетках человека и индуцируется после дифференцировки.

Фотодинамическая технология удаления ИПСК

Способность плюрипотентных клеток, и в частности ИПСК, избирательно окрашиваться красным красителем CD1 может быть использована для их селективного удаления из инкубационной среды, с помощью фотодинамической обработки светом, оставшихся недифференцированными ИПСК после проведения их дифференцировки в соматические клетки. Эта простая технология предварительной очистки позволяет резко снизить риск образования опухолей типа тератомы при трансплантации клеток полученных из ИПСК .

Перспективы изучения индуцированных стволовых клеток для медицины

Ярким свидетельством значения индуцированных стволовых клеток для медицины будущего и всего человечества, стало присуждение Джону Гордону и Синъе Яманаке Нобелевской премии 2012 года по медицине. Бо́льшую часть от Нобелевской премии, а также от полученной им в 2013 году Премии за прорыв в области медицины в 3 млн долларов Синъя Яманака решил потратить на развитие своих исследований. В настоящее время индуцированные стволовые клетки используются главным образом для моделирования болезней, скрининга (селективного отбора) лекарств, проверки токсичности различных препаратов. Однако в ближайшие годы начнется их широкомасштабное использование для клеточной терапии и выращивания органов и их «запчастей» для трансплантации.

См. также

• Регенеративная медицина
• Клеточная трансплантология
• Выращивание органов
• Examples of in vitro transdifferentiation by lineage-instructive approach ‎ (англ.)
• Examples of in vitro transdifferentiation by initial epigenetic activation phase approach  (англ.)
• Examples of in vivo transdifferentiation by lineage-instructive approach  (англ.)
• Induced stem cells

Литература

• Медведев С. П. и др. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. — 2-е изд. — Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2014. — 376 с. — ISBN 978-5-7692-1384-7.
• Deepak Srivastava, Natalie DeWitt (2016). [www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(16)31152-7 In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation]. Cell, 166(6), 1386–1396 DOI:10.1016/j.cell.2016.08.055
• Turksen, K., Nagy, A., & Turksen. (2016). [link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-3055-5 Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells]. Springer Science+ Business Media New York. DOI:10.1007/978-1-4939-3055-5
• Li M. & Belmonte J.C.I. (2016). [www.nature.com/nprot/journal/v11/n9/full/nprot.2016.108.html Looking to the future following 10 years of induced pluripotent stem cell technologies]. Nature Protocols, 11(9), 1579–1585 DOI:10.1038/nprot.2016.108
• Jun Xu, Yuanyuan Du, Hongkui Deng (2015). [www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(15)00014-4 Direct Lineage Reprogramming: Strategies, Mechanisms, and Applications]. Cell Stem Cell, 16(2), 119—134, dx.doi.org/10.1016/j.stem.2015.01.013
• Kelaini, S., Cochrane, A., & Margariti, A. (2014). [www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3931695/ Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state]. Stem cells and cloning: advances and applications, 7, 19 — 29. DOI:10.2147/SCCAA.S38006
• Biswas, D., & Jiang, P. (2016). [www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4783958/ Chemically Induced Reprogramming of Somatic Cells to Pluripotent Stem Cells and Neural Cells]. International journal of molecular sciences, 17(2), 226. DOI:10.3390/ijms17020226 Полный текст в свободном доступе на сайте PMC: [www.pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=4783958 4783958]
• Dmitry Dzhagarov (2015). [www.academia.edu/16256549/%D0%90%D0%B2%D0%B0%D1%80%D0%B8%D0%B9%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%BF%D1%80%D0%B5%D0%B4%D0%BE%D1%85%D1%80%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%82%D0%B5%D0%BB%D1%8C_%D0%B4%D0%BB%D1%8F_%D0%98%D0%9F%D0%A1%D0%9A Аварийный предохранитель для ИПСК]. Academia.edu
• Mitsui, K., Ide, K., Takayama, A., Wada, T., Irie, R., & Kosai, K. I. (2015). [www.nature.com/articles/mtm201526 Conditionally replicating adenovirus prevents pluripotent stem cell-derived teratoma by specifically eliminating undifferentiated cells]. Molecular therapy. Methods & clinical development, 2, Article number: 15026 ​DOI:10.1038/mtm.2015.26
• Paull, D., Sevilla, A., Zhou, H., Hahn, A. K., Kim, H., Napolitano, C., … & Noggle, S. A. (2015). [www.nature.com/nmeth/journal/v12/n9/full/nmeth.3507.html Automated, high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells]. Nature methods, 12(9), 885—892. DOI:10.1038/nmeth.3507
• Koji Tanabe, Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka (2014). Induction of pluripotency by defined factors. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 90(3), 83-96 dx.doi.org/10.2183/pjab.90.83
• Tan, Y., Ooi, S., & Wang, L. (2014).[www.ingentaconnect.com/content/ben/cscr/2014/00000009/00000001/art00007 Immunogenicity and Tumorigenicity of Pluripotent Stem Cells and their Derivatives: Genetic and Epigenetic Perspectives].Current stem cell research & therapy, 9(1), 63-72
• Xuemei Fu (2014). [www.nature.com/cmi/journal/v11/n1/full/cmi201360a.html The immunogenicity of cells derived from induced pluripotent stem cells]. Cellular & Molecular Immunology, 11, 14-16; DOI:10.1038/cmi.2013.60
• [www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Stem-Cell-Research/Stem-Cell-Engineering-Reprogramming.html Подробные протоколы] методов перепрограммирования и анализа полученных ИПСК
• Hongjun Song and Guo-li Ming (2014) [nsr.oxfordjournals.org/content/1/1/6.full Reprogram to pluripotency: a new logic and a chemical cocktail]. Natl Sci Rev (March 2014) 1 (1): 6-7. doi: 10.1093/nsr/nwt007
• Tabar, V., & Studer, L. (2014).[www.nature.com/nrg/journal/v15/n2/full/nrg3563.html Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress]. Nature Reviews Genetics, 15(2), 82-92. doi:10.1038/nrg3563
• de Lázaro, I; Yilmazer, A; Kostarelos, K. (July 2014). [www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168365914002156 Induced pluripotent stem (iPS) cells: A new source for cell-based therapeutics?]. Journal of Controlled Release, 185(10), 37-44 dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.04.011
• Shinya Yamanaka (2012) [www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(12)00237-8#MainText Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, and Future.] Cell Stem Cell, 10(6), 678—684, DOI:10.1016/j.stem.2012.05.005
• Haruhisa Inoue, Naoki Nagata, Hiromi Kurokawa, Shinya Yamanaka (2014). [emboj.embopress.org/content/33/5/409.abstract iPS cells: a game changer for future medicine]. EMBO J., 33:409-417 DOI:10.1002/embj.201387098
• Lensch, M. W., & Mummery, C. L. (2013) [www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221367111300012X From Stealing Fire to Cellular Reprogramming: A Scientific History Leading to the 2012 Nobel Prize]. Stem Cell Reports, 1(1), 5-17 DOI:10.1016/j.stemcr.2013.05.001
• * Camilla Luni, Stefano Giulitti, Elena Serena, Luca Ferrari, Alessandro Zambon, Onelia Gagliano, Giovanni G Giobbe, Federica Michielin, Sebastian Knöbel, Andreas Bosio & Nicola Elvassore (2016). [www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/full/nmeth.3832.html High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics]. Nat. Meth. DOI:10.1038/nmeth.3832 дёшево и практично; 50-кратное повышение эффективности; сверхмалые объёмы; дифференцировка в желаемые клетки на том же оборудовании .
• Спец. Выпуск 12 статей (October 2013) [www.sciencedirect.com/science/journal/16720229/11/5 Induced Pluripotent Stem Cells]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 11(5), 257—334
• Grace E. Asuelime and Yanhong Shi (2012) [jmcb.oxfordjournals.org/content/early/2012/04/12/jmcb.mjs005.short?rss=1 A case of cellular alchemy: lineage reprogramming and its potential in regenerative medicine] J Mol Cell Biol (2012) DOI:10.1093/jmcb/mjs005
• Ji Lin, Mei-rong Li, Dong-dong Ti, et al. & Wei-dong Han (2013) [www.sciencedirect.com/science/article/pii/S156816371200058X Microenvironment-evoked cell lineage conversion: Shifting the focus from internal reprogramming to external forcing] Ageing Research Reviews
• Takahashi K. (2014). Cellular reprogramming. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6:a018606 DOI:10.1101/cshperspect.a018606
• Чугунов А.(2012) [www.biomolecula.ru/content/1111 Нобелевская премия по физиологии и медицине (2012): индуцированные стволовые клетки.]
• Pennarossa, G., Zenobi, A., Gandolfi, C. E., Manzoni, E. F., Gandolfi, F., & Brevini, T. A. (2015). [www.researchgate.net/profile/Tiziana_Brevini/publication/284282005_Erase_and_Rewind_Epigenetic_Conversion_of_Cell_Fate/links/5660515b08aebae678aa05fa.pdf Erase and Rewind: Epigenetic Conversion of Cell Fate]. Stem Cell Reviews and Reports, 1-8.DOI:10.1007/s12015-015-9637-1
• M. Lorenzo, A. Fleischer, D. Bachiller (2012) [link.springer.com/article/10.1007/s12015-012-9412-5 Generation of Mouse and Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) from Primary Somatic Cells]. Stem Cell Reviews and Reports DOI:10.1007/s12015-012-9412-5 (подробное описание методик)
• Buganim, Y., Faddah, D. A., & Jaenisch, R. (2013) Mechanisms and models of somatic cell reprogramming. Nature Reviews Genetics, 14(6), 427—439. doi: 10.1038/nrg3473 researchgate.net [PDF]

Ссылки

• [www.escellnews.com/ ESC & iPSC News]
• [cellculturedish.com/2014/07/differentiation-tools-tips-success/ Efficient cell specific differentiation systems for iPSC]. Ask the Expert discussion.
• [www.facebook.com/pages/Induced-Stem-cells/468330466598344 ИСК на Facebook ] Все новости по теме «Индуцированные стволовые клетки»

</div>

Отрывок, характеризующий Индуцированные стволовые клетки

Был веселый, блестящий праздник; знатоки дела говорили, что редко собиралось в одном месте столько красавиц. Графиня Безухова в числе других русских дам, приехавших за государем из Петербурга в Вильну, была на этом бале, затемняя своей тяжелой, так называемой русской красотой утонченных польских дам. Она была замечена, и государь удостоил ее танца.
Борис Друбецкой, en garcon (холостяком), как он говорил, оставив свою жену в Москве, был также на этом бале и, хотя не генерал адъютант, был участником на большую сумму в подписке для бала. Борис теперь был богатый человек, далеко ушедший в почестях, уже не искавший покровительства, а на ровной ноге стоявший с высшими из своих сверстников.
В двенадцать часов ночи еще танцевали. Элен, не имевшая достойного кавалера, сама предложила мазурку Борису. Они сидели в третьей паре. Борис, хладнокровно поглядывая на блестящие обнаженные плечи Элен, выступавшие из темного газового с золотом платья, рассказывал про старых знакомых и вместе с тем, незаметно для самого себя и для других, ни на секунду не переставал наблюдать государя, находившегося в той же зале. Государь не танцевал; он стоял в дверях и останавливал то тех, то других теми ласковыми словами, которые он один только умел говорить.
При начале мазурки Борис видел, что генерал адъютант Балашев, одно из ближайших лиц к государю, подошел к нему и непридворно остановился близко от государя, говорившего с польской дамой. Поговорив с дамой, государь взглянул вопросительно и, видно, поняв, что Балашев поступил так только потому, что на то были важные причины, слегка кивнул даме и обратился к Балашеву. Только что Балашев начал говорить, как удивление выразилось на лице государя. Он взял под руку Балашева и пошел с ним через залу, бессознательно для себя расчищая с обеих сторон сажени на три широкую дорогу сторонившихся перед ним. Борис заметил взволнованное лицо Аракчеева, в то время как государь пошел с Балашевым. Аракчеев, исподлобья глядя на государя и посапывая красным носом, выдвинулся из толпы, как бы ожидая, что государь обратится к нему. (Борис понял, что Аракчеев завидует Балашеву и недоволен тем, что какая то, очевидно, важная, новость не через него передана государю.)
Но государь с Балашевым прошли, не замечая Аракчеева, через выходную дверь в освещенный сад. Аракчеев, придерживая шпагу и злобно оглядываясь вокруг себя, прошел шагах в двадцати за ними.
Пока Борис продолжал делать фигуры мазурки, его не переставала мучить мысль о том, какую новость привез Балашев и каким бы образом узнать ее прежде других.
В фигуре, где ему надо было выбирать дам, шепнув Элен, что он хочет взять графиню Потоцкую, которая, кажется, вышла на балкон, он, скользя ногами по паркету, выбежал в выходную дверь в сад и, заметив входящего с Балашевым на террасу государя, приостановился. Государь с Балашевым направлялись к двери. Борис, заторопившись, как будто не успев отодвинуться, почтительно прижался к притолоке и нагнул голову.
Государь с волнением лично оскорбленного человека договаривал следующие слова:
– Без объявления войны вступить в Россию. Я помирюсь только тогда, когда ни одного вооруженного неприятеля не останется на моей земле, – сказал он. Как показалось Борису, государю приятно было высказать эти слова: он был доволен формой выражения своей мысли, но был недоволен тем, что Борис услыхал их.
– Чтоб никто ничего не знал! – прибавил государь, нахмурившись. Борис понял, что это относилось к нему, и, закрыв глаза, слегка наклонил голову. Государь опять вошел в залу и еще около получаса пробыл на бале.
Борис первый узнал известие о переходе французскими войсками Немана и благодаря этому имел случай показать некоторым важным лицам, что многое, скрытое от других, бывает ему известно, и через то имел случай подняться выше во мнении этих особ.

Неожиданное известие о переходе французами Немана было особенно неожиданно после месяца несбывавшегося ожидания, и на бале! Государь, в первую минуту получения известия, под влиянием возмущения и оскорбления, нашел то, сделавшееся потом знаменитым, изречение, которое самому понравилось ему и выражало вполне его чувства. Возвратившись домой с бала, государь в два часа ночи послал за секретарем Шишковым и велел написать приказ войскам и рескрипт к фельдмаршалу князю Салтыкову, в котором он непременно требовал, чтобы были помещены слова о том, что он не помирится до тех пор, пока хотя один вооруженный француз останется на русской земле.
На другой день было написано следующее письмо к Наполеону.
«Monsieur mon frere. J'ai appris hier que malgre la loyaute avec laquelle j'ai maintenu mes engagements envers Votre Majeste, ses troupes ont franchis les frontieres de la Russie, et je recois a l'instant de Petersbourg une note par laquelle le comte Lauriston, pour cause de cette agression, annonce que Votre Majeste s'est consideree comme en etat de guerre avec moi des le moment ou le prince Kourakine a fait la demande de ses passeports. Les motifs sur lesquels le duc de Bassano fondait son refus de les lui delivrer, n'auraient jamais pu me faire supposer que cette demarche servirait jamais de pretexte a l'agression. En effet cet ambassadeur n'y a jamais ete autorise comme il l'a declare lui meme, et aussitot que j'en fus informe, je lui ai fait connaitre combien je le desapprouvais en lui donnant l'ordre de rester a son poste. Si Votre Majeste n'est pas intentionnee de verser le sang de nos peuples pour un malentendu de ce genre et qu'elle consente a retirer ses troupes du territoire russe, je regarderai ce qui s'est passe comme non avenu, et un accommodement entre nous sera possible. Dans le cas contraire, Votre Majeste, je me verrai force de repousser une attaque que rien n'a provoquee de ma part. Il depend encore de Votre Majeste d'eviter a l'humanite les calamites d'une nouvelle guerre.
Je suis, etc.
(signe) Alexandre».
[«Государь брат мой! Вчера дошло до меня, что, несмотря на прямодушие, с которым соблюдал я мои обязательства в отношении к Вашему Императорскому Величеству, войска Ваши перешли русские границы, и только лишь теперь получил из Петербурга ноту, которою граф Лористон извещает меня, по поводу сего вторжения, что Ваше Величество считаете себя в неприязненных отношениях со мною, с того времени как князь Куракин потребовал свои паспорта. Причины, на которых герцог Бассано основывал свой отказ выдать сии паспорты, никогда не могли бы заставить меня предполагать, чтобы поступок моего посла послужил поводом к нападению. И в действительности он не имел на то от меня повеления, как было объявлено им самим; и как только я узнал о сем, то немедленно выразил мое неудовольствие князю Куракину, повелев ему исполнять по прежнему порученные ему обязанности. Ежели Ваше Величество не расположены проливать кровь наших подданных из за подобного недоразумения и ежели Вы согласны вывести свои войска из русских владений, то я оставлю без внимания все происшедшее, и соглашение между нами будет возможно. В противном случае я буду принужден отражать нападение, которое ничем не было возбуждено с моей стороны. Ваше Величество, еще имеете возможность избавить человечество от бедствий новой войны.
(подписал) Александр». ]


13 го июня, в два часа ночи, государь, призвав к себе Балашева и прочтя ему свое письмо к Наполеону, приказал ему отвезти это письмо и лично передать французскому императору. Отправляя Балашева, государь вновь повторил ему слова о том, что он не помирится до тех пор, пока останется хотя один вооруженный неприятель на русской земле, и приказал непременно передать эти слова Наполеону. Государь не написал этих слов в письме, потому что он чувствовал с своим тактом, что слова эти неудобны для передачи в ту минуту, когда делается последняя попытка примирения; но он непременно приказал Балашеву передать их лично Наполеону.
Выехав в ночь с 13 го на 14 е июня, Балашев, сопутствуемый трубачом и двумя казаками, к рассвету приехал в деревню Рыконты, на французские аванпосты по сю сторону Немана. Он был остановлен французскими кавалерийскими часовыми.
Французский гусарский унтер офицер, в малиновом мундире и мохнатой шапке, крикнул на подъезжавшего Балашева, приказывая ему остановиться. Балашев не тотчас остановился, а продолжал шагом подвигаться по дороге.
Унтер офицер, нахмурившись и проворчав какое то ругательство, надвинулся грудью лошади на Балашева, взялся за саблю и грубо крикнул на русского генерала, спрашивая его: глух ли он, что не слышит того, что ему говорят. Балашев назвал себя. Унтер офицер послал солдата к офицеру.
Не обращая на Балашева внимания, унтер офицер стал говорить с товарищами о своем полковом деле и не глядел на русского генерала.
Необычайно странно было Балашеву, после близости к высшей власти и могуществу, после разговора три часа тому назад с государем и вообще привыкшему по своей службе к почестям, видеть тут, на русской земле, это враждебное и главное – непочтительное отношение к себе грубой силы.
Солнце только начинало подниматься из за туч; в воздухе было свежо и росисто. По дороге из деревни выгоняли стадо. В полях один за одним, как пузырьки в воде, вспырскивали с чувыканьем жаворонки.
Балашев оглядывался вокруг себя, ожидая приезда офицера из деревни. Русские казаки, и трубач, и французские гусары молча изредка глядели друг на друга.
Французский гусарский полковник, видимо, только что с постели, выехал из деревни на красивой сытой серой лошади, сопутствуемый двумя гусарами. На офицере, на солдатах и на их лошадях был вид довольства и щегольства.
Это было то первое время кампании, когда войска еще находились в исправности, почти равной смотровой, мирной деятельности, только с оттенком нарядной воинственности в одежде и с нравственным оттенком того веселья и предприимчивости, которые всегда сопутствуют началам кампаний.
Французский полковник с трудом удерживал зевоту, но был учтив и, видимо, понимал все значение Балашева. Он провел его мимо своих солдат за цепь и сообщил, что желание его быть представленну императору будет, вероятно, тотчас же исполнено, так как императорская квартира, сколько он знает, находится недалеко.
Они проехали деревню Рыконты, мимо французских гусарских коновязей, часовых и солдат, отдававших честь своему полковнику и с любопытством осматривавших русский мундир, и выехали на другую сторону села. По словам полковника, в двух километрах был начальник дивизии, который примет Балашева и проводит его по назначению.
Солнце уже поднялось и весело блестело на яркой зелени.
Только что они выехали за корчму на гору, как навстречу им из под горы показалась кучка всадников, впереди которой на вороной лошади с блестящею на солнце сбруей ехал высокий ростом человек в шляпе с перьями и черными, завитыми по плечи волосами, в красной мантии и с длинными ногами, выпяченными вперед, как ездят французы. Человек этот поехал галопом навстречу Балашеву, блестя и развеваясь на ярком июньском солнце своими перьями, каменьями и золотыми галунами.
Балашев уже был на расстоянии двух лошадей от скачущего ему навстречу с торжественно театральным лицом всадника в браслетах, перьях, ожерельях и золоте, когда Юльнер, французский полковник, почтительно прошептал: «Le roi de Naples». [Король Неаполитанский.] Действительно, это был Мюрат, называемый теперь неаполитанским королем. Хотя и было совершенно непонятно, почему он был неаполитанский король, но его называли так, и он сам был убежден в этом и потому имел более торжественный и важный вид, чем прежде. Он так был уверен в том, что он действительно неаполитанский король, что, когда накануне отъезда из Неаполя, во время его прогулки с женою по улицам Неаполя, несколько итальянцев прокричали ему: «Viva il re!», [Да здравствует король! (итал.) ] он с грустной улыбкой повернулся к супруге и сказал: «Les malheureux, ils ne savent pas que je les quitte demain! [Несчастные, они не знают, что я их завтра покидаю!]
Но несмотря на то, что он твердо верил в то, что он был неаполитанский король, и что он сожалел о горести своих покидаемых им подданных, в последнее время, после того как ему ведено было опять поступить на службу, и особенно после свидания с Наполеоном в Данциге, когда августейший шурин сказал ему: «Je vous ai fait Roi pour regner a maniere, mais pas a la votre», [Я вас сделал королем для того, чтобы царствовать не по своему, а по моему.] – он весело принялся за знакомое ему дело и, как разъевшийся, но не зажиревший, годный на службу конь, почуяв себя в упряжке, заиграл в оглоблях и, разрядившись как можно пестрее и дороже, веселый и довольный, скакал, сам не зная куда и зачем, по дорогам Польши.
Увидав русского генерала, он по королевски, торжественно, откинул назад голову с завитыми по плечи волосами и вопросительно поглядел на французского полковника. Полковник почтительно передал его величеству значение Балашева, фамилию которого он не мог выговорить.
– De Bal macheve! – сказал король (своей решительностью превозмогая трудность, представлявшуюся полковнику), – charme de faire votre connaissance, general, [очень приятно познакомиться с вами, генерал] – прибавил он с королевски милостивым жестом. Как только король начал говорить громко и быстро, все королевское достоинство мгновенно оставило его, и он, сам не замечая, перешел в свойственный ему тон добродушной фамильярности. Он положил свою руку на холку лошади Балашева.
– Eh, bien, general, tout est a la guerre, a ce qu'il parait, [Ну что ж, генерал, дело, кажется, идет к войне,] – сказал он, как будто сожалея об обстоятельстве, о котором он не мог судить.
– Sire, – отвечал Балашев. – l'Empereur mon maitre ne desire point la guerre, et comme Votre Majeste le voit, – говорил Балашев, во всех падежах употребляя Votre Majeste, [Государь император русский не желает ее, как ваше величество изволите видеть… ваше величество.] с неизбежной аффектацией учащения титула, обращаясь к лицу, для которого титул этот еще новость.
Лицо Мюрата сияло глупым довольством в то время, как он слушал monsieur de Balachoff. Но royaute oblige: [королевское звание имеет свои обязанности:] он чувствовал необходимость переговорить с посланником Александра о государственных делах, как король и союзник. Он слез с лошади и, взяв под руку Балашева и отойдя на несколько шагов от почтительно дожидавшейся свиты, стал ходить с ним взад и вперед, стараясь говорить значительно. Он упомянул о том, что император Наполеон оскорблен требованиями вывода войск из Пруссии, в особенности теперь, когда это требование сделалось всем известно и когда этим оскорблено достоинство Франции. Балашев сказал, что в требовании этом нет ничего оскорбительного, потому что… Мюрат перебил его:
– Так вы считаете зачинщиком не императора Александра? – сказал он неожиданно с добродушно глупой улыбкой.
Балашев сказал, почему он действительно полагал, что начинателем войны был Наполеон.
– Eh, mon cher general, – опять перебил его Мюрат, – je desire de tout mon c?ur que les Empereurs s'arrangent entre eux, et que la guerre commencee malgre moi se termine le plutot possible, [Ах, любезный генерал, я желаю от всей души, чтобы императоры покончили дело между собою и чтобы война, начатая против моей воли, окончилась как можно скорее.] – сказал он тоном разговора слуг, которые желают остаться добрыми приятелями, несмотря на ссору между господами. И он перешел к расспросам о великом князе, о его здоровье и о воспоминаниях весело и забавно проведенного с ним времени в Неаполе. Потом, как будто вдруг вспомнив о своем королевском достоинстве, Мюрат торжественно выпрямился, стал в ту же позу, в которой он стоял на коронации, и, помахивая правой рукой, сказал: – Je ne vous retiens plus, general; je souhaite le succes de vorte mission, [Я вас не задерживаю более, генерал; желаю успеха вашему посольству,] – и, развеваясь красной шитой мантией и перьями и блестя драгоценностями, он пошел к свите, почтительно ожидавшей его.
Балашев поехал дальше, по словам Мюрата предполагая весьма скоро быть представленным самому Наполеону. Но вместо скорой встречи с Наполеоном, часовые пехотного корпуса Даву опять так же задержали его у следующего селения, как и в передовой цепи, и вызванный адъютант командира корпуса проводил его в деревню к маршалу Даву.


Даву был Аракчеев императора Наполеона – Аракчеев не трус, но столь же исправный, жестокий и не умеющий выражать свою преданность иначе как жестокостью.
В механизме государственного организма нужны эти люди, как нужны волки в организме природы, и они всегда есть, всегда являются и держатся, как ни несообразно кажется их присутствие и близость к главе правительства. Только этой необходимостью можно объяснить то, как мог жестокий, лично выдиравший усы гренадерам и не могший по слабости нерв переносить опасность, необразованный, непридворный Аракчеев держаться в такой силе при рыцарски благородном и нежном характере Александра.
Балашев застал маршала Даву в сарае крестьянскои избы, сидящего на бочонке и занятого письменными работами (он поверял счеты). Адъютант стоял подле него. Возможно было найти лучшее помещение, но маршал Даву был один из тех людей, которые нарочно ставят себя в самые мрачные условия жизни, для того чтобы иметь право быть мрачными. Они для того же всегда поспешно и упорно заняты. «Где тут думать о счастливой стороне человеческой жизни, когда, вы видите, я на бочке сижу в грязном сарае и работаю», – говорило выражение его лица. Главное удовольствие и потребность этих людей состоит в том, чтобы, встретив оживление жизни, бросить этому оживлению в глаза спою мрачную, упорную деятельность. Это удовольствие доставил себе Даву, когда к нему ввели Балашева. Он еще более углубился в свою работу, когда вошел русский генерал, и, взглянув через очки на оживленное, под впечатлением прекрасного утра и беседы с Мюратом, лицо Балашева, не встал, не пошевелился даже, а еще больше нахмурился и злобно усмехнулся.
Заметив на лице Балашева произведенное этим приемом неприятное впечатление, Даву поднял голову и холодно спросил, что ему нужно.
Предполагая, что такой прием мог быть сделан ему только потому, что Даву не знает, что он генерал адъютант императора Александра и даже представитель его перед Наполеоном, Балашев поспешил сообщить свое звание и назначение. В противность ожидания его, Даву, выслушав Балашева, стал еще суровее и грубее.
– Где же ваш пакет? – сказал он. – Donnez le moi, ije l'enverrai a l'Empereur. [Дайте мне его, я пошлю императору.]
Балашев сказал, что он имеет приказание лично передать пакет самому императору.
– Приказания вашего императора исполняются в вашей армии, а здесь, – сказал Даву, – вы должны делать то, что вам говорят.
И как будто для того чтобы еще больше дать почувствовать русскому генералу его зависимость от грубой силы, Даву послал адъютанта за дежурным.
Балашев вынул пакет, заключавший письмо государя, и положил его на стол (стол, состоявший из двери, на которой торчали оторванные петли, положенной на два бочонка). Даву взял конверт и прочел надпись.
– Вы совершенно вправе оказывать или не оказывать мне уважение, – сказал Балашев. – Но позвольте вам заметить, что я имею честь носить звание генерал адъютанта его величества…
Даву взглянул на него молча, и некоторое волнение и смущение, выразившиеся на лице Балашева, видимо, доставили ему удовольствие.
– Вам будет оказано должное, – сказал он и, положив конверт в карман, вышел из сарая.
Через минуту вошел адъютант маршала господин де Кастре и провел Балашева в приготовленное для него помещение.
Балашев обедал в этот день с маршалом в том же сарае, на той же доске на бочках.
На другой день Даву выехал рано утром и, пригласив к себе Балашева, внушительно сказал ему, что он просит его оставаться здесь, подвигаться вместе с багажами, ежели они будут иметь на то приказания, и не разговаривать ни с кем, кроме как с господином де Кастро.
После четырехдневного уединения, скуки, сознания подвластности и ничтожества, особенно ощутительного после той среды могущества, в которой он так недавно находился, после нескольких переходов вместе с багажами маршала, с французскими войсками, занимавшими всю местность, Балашев привезен был в Вильну, занятую теперь французами, в ту же заставу, на которой он выехал четыре дня тому назад.
На другой день императорский камергер, monsieur de Turenne, приехал к Балашеву и передал ему желание императора Наполеона удостоить его аудиенции.
Четыре дня тому назад у того дома, к которому подвезли Балашева, стояли Преображенского полка часовые, теперь же стояли два французских гренадера в раскрытых на груди синих мундирах и в мохнатых шапках, конвой гусаров и улан и блестящая свита адъютантов, пажей и генералов, ожидавших выхода Наполеона вокруг стоявшей у крыльца верховой лошади и его мамелюка Рустава. Наполеон принимал Балашева в том самом доме в Вильве, из которого отправлял его Александр.


Несмотря на привычку Балашева к придворной торжественности, роскошь и пышность двора императора Наполеона поразили его.
Граф Тюрен ввел его в большую приемную, где дожидалось много генералов, камергеров и польских магнатов, из которых многих Балашев видал при дворе русского императора. Дюрок сказал, что император Наполеон примет русского генерала перед своей прогулкой.
После нескольких минут ожидания дежурный камергер вышел в большую приемную и, учтиво поклонившись Балашеву, пригласил его идти за собой.
Балашев вошел в маленькую приемную, из которой была одна дверь в кабинет, в тот самый кабинет, из которого отправлял его русский император. Балашев простоял один минуты две, ожидая. За дверью послышались поспешные шаги. Быстро отворились обе половинки двери, камергер, отворивший, почтительно остановился, ожидая, все затихло, и из кабинета зазвучали другие, твердые, решительные шаги: это был Наполеон. Он только что окончил свой туалет для верховой езды. Он был в синем мундире, раскрытом над белым жилетом, спускавшимся на круглый живот, в белых лосинах, обтягивающих жирные ляжки коротких ног, и в ботфортах. Короткие волоса его, очевидно, только что были причесаны, но одна прядь волос спускалась книзу над серединой широкого лба. Белая пухлая шея его резко выступала из за черного воротника мундира; от него пахло одеколоном. На моложавом полном лице его с выступающим подбородком было выражение милостивого и величественного императорского приветствия.
Он вышел, быстро подрагивая на каждом шагу и откинув несколько назад голову. Вся его потолстевшая, короткая фигура с широкими толстыми плечами и невольно выставленным вперед животом и грудью имела тот представительный, осанистый вид, который имеют в холе живущие сорокалетние люди. Кроме того, видно было, что он в этот день находился в самом хорошем расположении духа.
Он кивнул головою, отвечая на низкий и почтительный поклон Балашева, и, подойдя к нему, тотчас же стал говорить как человек, дорожащий всякой минутой своего времени и не снисходящий до того, чтобы приготавливать свои речи, а уверенный в том, что он всегда скажет хорошо и что нужно сказать.
– Здравствуйте, генерал! – сказал он. – Я получил письмо императора Александра, которое вы доставили, и очень рад вас видеть. – Он взглянул в лицо Балашева своими большими глазами и тотчас же стал смотреть вперед мимо него.
Очевидно было, что его не интересовала нисколько личность Балашева. Видно было, что только то, что происходило в его душе, имело интерес для него. Все, что было вне его, не имело для него значения, потому что все в мире, как ему казалось, зависело только от его воли.
– Я не желаю и не желал войны, – сказал он, – но меня вынудили к ней. Я и теперь (он сказал это слово с ударением) готов принять все объяснения, которые вы можете дать мне. – И он ясно и коротко стал излагать причины своего неудовольствия против русского правительства.
Судя по умеренно спокойному и дружелюбному тону, с которым говорил французский император, Балашев был твердо убежден, что он желает мира и намерен вступить в переговоры.
– Sire! L'Empereur, mon maitre, [Ваше величество! Император, государь мой,] – начал Балашев давно приготовленную речь, когда Наполеон, окончив свою речь, вопросительно взглянул на русского посла; но взгляд устремленных на него глаз императора смутил его. «Вы смущены – оправьтесь», – как будто сказал Наполеон, с чуть заметной улыбкой оглядывая мундир и шпагу Балашева. Балашев оправился и начал говорить. Он сказал, что император Александр не считает достаточной причиной для войны требование паспортов Куракиным, что Куракин поступил так по своему произволу и без согласия на то государя, что император Александр не желает войны и что с Англией нет никаких сношений.
– Еще нет, – вставил Наполеон и, как будто боясь отдаться своему чувству, нахмурился и слегка кивнул головой, давая этим чувствовать Балашеву, что он может продолжать.
Высказав все, что ему было приказано, Балашев сказал, что император Александр желает мира, но не приступит к переговорам иначе, как с тем условием, чтобы… Тут Балашев замялся: он вспомнил те слова, которые император Александр не написал в письме, но которые непременно приказал вставить в рескрипт Салтыкову и которые приказал Балашеву передать Наполеону. Балашев помнил про эти слова: «пока ни один вооруженный неприятель не останется на земле русской», но какое то сложное чувство удержало его. Он не мог сказать этих слов, хотя и хотел это сделать. Он замялся и сказал: с условием, чтобы французские войска отступили за Неман.
Наполеон заметил смущение Балашева при высказывании последних слов; лицо его дрогнуло, левая икра ноги начала мерно дрожать. Не сходя с места, он голосом, более высоким и поспешным, чем прежде, начал говорить. Во время последующей речи Балашев, не раз опуская глаза, невольно наблюдал дрожанье икры в левой ноге Наполеона, которое тем более усиливалось, чем более он возвышал голос.
– Я желаю мира не менее императора Александра, – начал он. – Не я ли осьмнадцать месяцев делаю все, чтобы получить его? Я осьмнадцать месяцев жду объяснений. Но для того, чтобы начать переговоры, чего же требуют от меня? – сказал он, нахмурившись и делая энергически вопросительный жест своей маленькой белой и пухлой рукой.
– Отступления войск за Неман, государь, – сказал Балашев.
– За Неман? – повторил Наполеон. – Так теперь вы хотите, чтобы отступили за Неман – только за Неман? – повторил Наполеон, прямо взглянув на Балашева.
Балашев почтительно наклонил голову.
Вместо требования четыре месяца тому назад отступить из Номерании, теперь требовали отступить только за Неман. Наполеон быстро повернулся и стал ходить по комнате.
– Вы говорите, что от меня требуют отступления за Неман для начатия переговоров; но от меня требовали точно так же два месяца тому назад отступления за Одер и Вислу, и, несмотря на то, вы согласны вести переговоры.
Он молча прошел от одного угла комнаты до другого и опять остановился против Балашева. Лицо его как будто окаменело в своем строгом выражении, и левая нога дрожала еще быстрее, чем прежде. Это дрожанье левой икры Наполеон знал за собой. La vibration de mon mollet gauche est un grand signe chez moi, [Дрожание моей левой икры есть великий признак,] – говорил он впоследствии.
– Такие предложения, как то, чтобы очистить Одер и Вислу, можно делать принцу Баденскому, а не мне, – совершенно неожиданно для себя почти вскрикнул Наполеон. – Ежели бы вы мне дали Петербуг и Москву, я бы не принял этих условий. Вы говорите, я начал войну? А кто прежде приехал к армии? – император Александр, а не я. И вы предлагаете мне переговоры тогда, как я издержал миллионы, тогда как вы в союзе с Англией и когда ваше положение дурно – вы предлагаете мне переговоры! А какая цель вашего союза с Англией? Что она дала вам? – говорил он поспешно, очевидно, уже направляя свою речь не для того, чтобы высказать выгоды заключения мира и обсудить его возможность, а только для того, чтобы доказать и свою правоту, и свою силу, и чтобы доказать неправоту и ошибки Александра.
Вступление его речи было сделано, очевидно, с целью выказать выгоду своего положения и показать, что, несмотря на то, он принимает открытие переговоров. Но он уже начал говорить, и чем больше он говорил, тем менее он был в состоянии управлять своей речью.
Вся цель его речи теперь уже, очевидно, была в том, чтобы только возвысить себя и оскорбить Александра, то есть именно сделать то самое, чего он менее всего хотел при начале свидания.
– Говорят, вы заключили мир с турками?
Балашев утвердительно наклонил голову.
– Мир заключен… – начал он. Но Наполеон не дал ему говорить. Ему, видно, нужно было говорить самому, одному, и он продолжал говорить с тем красноречием и невоздержанием раздраженности, к которому так склонны балованные люди.
– Да, я знаю, вы заключили мир с турками, не получив Молдавии и Валахии. А я бы дал вашему государю эти провинции так же, как я дал ему Финляндию. Да, – продолжал он, – я обещал и дал бы императору Александру Молдавию и Валахию, а теперь он не будет иметь этих прекрасных провинций. Он бы мог, однако, присоединить их к своей империи, и в одно царствование он бы расширил Россию от Ботнического залива до устьев Дуная. Катерина Великая не могла бы сделать более, – говорил Наполеон, все более и более разгораясь, ходя по комнате и повторяя Балашеву почти те же слова, которые ои говорил самому Александру в Тильзите. – Tout cela il l'aurait du a mon amitie… Ah! quel beau regne, quel beau regne! – повторил он несколько раз, остановился, достал золотую табакерку из кармана и жадно потянул из нее носом.
– Quel beau regne aurait pu etre celui de l'Empereur Alexandre! [Всем этим он был бы обязан моей дружбе… О, какое прекрасное царствование, какое прекрасное царствование! О, какое прекрасное царствование могло бы быть царствование императора Александра!]
Он с сожалением взглянул на Балашева, и только что Балашев хотел заметить что то, как он опять поспешно перебил его.
– Чего он мог желать и искать такого, чего бы он не нашел в моей дружбе?.. – сказал Наполеон, с недоумением пожимая плечами. – Нет, он нашел лучшим окружить себя моими врагами, и кем же? – продолжал он. – Он призвал к себе Штейнов, Армфельдов, Винцингероде, Бенигсенов, Штейн – прогнанный из своего отечества изменник, Армфельд – развратник и интриган, Винцингероде – беглый подданный Франции, Бенигсен несколько более военный, чем другие, но все таки неспособный, который ничего не умел сделать в 1807 году и который бы должен возбуждать в императоре Александре ужасные воспоминания… Положим, ежели бы они были способны, можно бы их употреблять, – продолжал Наполеон, едва успевая словом поспевать за беспрестанно возникающими соображениями, показывающими ему его правоту или силу (что в его понятии было одно и то же), – но и того нет: они не годятся ни для войны, ни для мира. Барклай, говорят, дельнее их всех; но я этого не скажу, судя по его первым движениям. А они что делают? Что делают все эти придворные! Пфуль предлагает, Армфельд спорит, Бенигсен рассматривает, а Барклай, призванный действовать, не знает, на что решиться, и время проходит. Один Багратион – военный человек. Он глуп, но у него есть опытность, глазомер и решительность… И что за роль играет ваш молодой государь в этой безобразной толпе. Они его компрометируют и на него сваливают ответственность всего совершающегося. Un souverain ne doit etre a l'armee que quand il est general, [Государь должен находиться при армии только тогда, когда он полководец,] – сказал он, очевидно, посылая эти слова прямо как вызов в лицо государя. Наполеон знал, как желал император Александр быть полководцем.
– Уже неделя, как началась кампания, и вы не сумели защитить Вильну. Вы разрезаны надвое и прогнаны из польских провинций. Ваша армия ропщет…
– Напротив, ваше величество, – сказал Балашев, едва успевавший запоминать то, что говорилось ему, и с трудом следивший за этим фейерверком слов, – войска горят желанием…
– Я все знаю, – перебил его Наполеон, – я все знаю, и знаю число ваших батальонов так же верно, как и моих. У вас нет двухсот тысяч войска, а у меня втрое столько. Даю вам честное слово, – сказал Наполеон, забывая, что это его честное слово никак не могло иметь значения, – даю вам ma parole d'honneur que j'ai cinq cent trente mille hommes de ce cote de la Vistule. [честное слово, что у меня пятьсот тридцать тысяч человек по сю сторону Вислы.] Турки вам не помощь: они никуда не годятся и доказали это, замирившись с вами. Шведы – их предопределение быть управляемыми сумасшедшими королями. Их король был безумный; они переменили его и взяли другого – Бернадота, который тотчас сошел с ума, потому что сумасшедший только, будучи шведом, может заключать союзы с Россией. – Наполеон злобно усмехнулся и опять поднес к носу табакерку.
На каждую из фраз Наполеона Балашев хотел и имел что возразить; беспрестанно он делал движение человека, желавшего сказать что то, но Наполеон перебивал его. Например, о безумии шведов Балашев хотел сказать, что Швеция есть остров, когда Россия за нее; но Наполеон сердито вскрикнул, чтобы заглушить его голос. Наполеон находился в том состоянии раздражения, в котором нужно говорить, говорить и говорить, только для того, чтобы самому себе доказать свою справедливость. Балашеву становилось тяжело: он, как посол, боялся уронить достоинство свое и чувствовал необходимость возражать; но, как человек, он сжимался нравственно перед забытьем беспричинного гнева, в котором, очевидно, находился Наполеон. Он знал, что все слова, сказанные теперь Наполеоном, не имеют значения, что он сам, когда опомнится, устыдится их. Балашев стоял, опустив глаза, глядя на движущиеся толстые ноги Наполеона, и старался избегать его взгляда.
– Да что мне эти ваши союзники? – говорил Наполеон. – У меня союзники – это поляки: их восемьдесят тысяч, они дерутся, как львы. И их будет двести тысяч.
И, вероятно, еще более возмутившись тем, что, сказав это, он сказал очевидную неправду и что Балашев в той же покорной своей судьбе позе молча стоял перед ним, он круто повернулся назад, подошел к самому лицу Балашева и, делая энергические и быстрые жесты своими белыми руками, закричал почти:
– Знайте, что ежели вы поколеблете Пруссию против меня, знайте, что я сотру ее с карты Европы, – сказал он с бледным, искаженным злобой лицом, энергическим жестом одной маленькой руки ударяя по другой. – Да, я заброшу вас за Двину, за Днепр и восстановлю против вас ту преграду, которую Европа была преступна и слепа, что позволила разрушить. Да, вот что с вами будет, вот что вы выиграли, удалившись от меня, – сказал он и молча прошел несколько раз по комнате, вздрагивая своими толстыми плечами. Он положил в жилетный карман табакерку, опять вынул ее, несколько раз приставлял ее к носу и остановился против Балашева. Он помолчал, поглядел насмешливо прямо в глаза Балашеву и сказал тихим голосом: – Et cependant quel beau regne aurait pu avoir votre maitre! [A между тем какое прекрасное царствование мог бы иметь ваш государь!]
Балашев, чувствуя необходимость возражать, сказал, что со стороны России дела не представляются в таком мрачном виде. Наполеон молчал, продолжая насмешливо глядеть на него и, очевидно, его не слушая. Балашев сказал, что в России ожидают от войны всего хорошего. Наполеон снисходительно кивнул головой, как бы говоря: «Знаю, так говорить ваша обязанность, но вы сами в это не верите, вы убеждены мною».
В конце речи Балашева Наполеон вынул опять табакерку, понюхал из нее и, как сигнал, стукнул два раза ногой по полу. Дверь отворилась; почтительно изгибающийся камергер подал императору шляпу и перчатки, другой подал носовои платок. Наполеон, ne глядя на них, обратился к Балашеву.
– Уверьте от моего имени императора Александра, – сказал оц, взяв шляпу, – что я ему предан по прежнему: я анаю его совершенно и весьма высоко ценю высокие его качества. Je ne vous retiens plus, general, vous recevrez ma lettre a l'Empereur. [Не удерживаю вас более, генерал, вы получите мое письмо к государю.] – И Наполеон пошел быстро к двери. Из приемной все бросилось вперед и вниз по лестнице.


После всего того, что сказал ему Наполеон, после этих взрывов гнева и после последних сухо сказанных слов:
«Je ne vous retiens plus, general, vous recevrez ma lettre», Балашев был уверен, что Наполеон уже не только не пожелает его видеть, но постарается не видать его – оскорбленного посла и, главное, свидетеля его непристойной горячности. Но, к удивлению своему, Балашев через Дюрока получил в этот день приглашение к столу императора.
На обеде были Бессьер, Коленкур и Бертье. Наполеон встретил Балашева с веселым и ласковым видом. Не только не было в нем выражения застенчивости или упрека себе за утреннюю вспышку, но он, напротив, старался ободрить Балашева. Видно было, что уже давно для Наполеона в его убеждении не существовало возможности ошибок и что в его понятии все то, что он делал, было хорошо не потому, что оно сходилось с представлением того, что хорошо и дурно, но потому, что он делал это.
Император был очень весел после своей верховой прогулки по Вильне, в которой толпы народа с восторгом встречали и провожали его. Во всех окнах улиц, по которым он проезжал, были выставлены ковры, знамена, вензеля его, и польские дамы, приветствуя его, махали ему платками.
За обедом, посадив подле себя Балашева, он обращался с ним не только ласково, но обращался так, как будто он и Балашева считал в числе своих придворных, в числе тех людей, которые сочувствовали его планам и должны были радоваться его успехам. Между прочим разговором он заговорил о Москве и стал спрашивать Балашева о русской столице, не только как спрашивает любознательный путешественник о новом месте, которое он намеревается посетить, но как бы с убеждением, что Балашев, как русский, должен быть польщен этой любознательностью.
– Сколько жителей в Москве, сколько домов? Правда ли, что Moscou называют Moscou la sainte? [святая?] Сколько церквей в Moscou? – спрашивал он.
И на ответ, что церквей более двухсот, он сказал:
– К чему такая бездна церквей?
– Русские очень набожны, – отвечал Балашев.
– Впрочем, большое количество монастырей и церквей есть всегда признак отсталости народа, – сказал Наполеон, оглядываясь на Коленкура за оценкой этого суждения.
Балашев почтительно позволил себе не согласиться с мнением французского императора.
– У каждой страны свои нравы, – сказал он.
– Но уже нигде в Европе нет ничего подобного, – сказал Наполеон.
– Прошу извинения у вашего величества, – сказал Балашев, – кроме России, есть еще Испания, где также много церквей и монастырей.
Этот ответ Балашева, намекавший на недавнее поражение французов в Испании, был высоко оценен впоследствии, по рассказам Балашева, при дворе императора Александра и очень мало был оценен теперь, за обедом Наполеона, и прошел незаметно.
По равнодушным и недоумевающим лицам господ маршалов видно было, что они недоумевали, в чем тут состояла острота, на которую намекала интонация Балашева. «Ежели и была она, то мы не поняли ее или она вовсе не остроумна», – говорили выражения лиц маршалов. Так мало был оценен этот ответ, что Наполеон даже решительно не заметил его и наивно спросил Балашева о том, на какие города идет отсюда прямая дорога к Москве. Балашев, бывший все время обеда настороже, отвечал, что comme tout chemin mene a Rome, tout chemin mene a Moscou, [как всякая дорога, по пословице, ведет в Рим, так и все дороги ведут в Москву,] что есть много дорог, и что в числе этих разных путей есть дорога на Полтаву, которую избрал Карл XII, сказал Балашев, невольно вспыхнув от удовольствия в удаче этого ответа. Не успел Балашев досказать последних слов: «Poltawa», как уже Коленкур заговорил о неудобствах дороги из Петербурга в Москву и о своих петербургских воспоминаниях.
После обеда перешли пить кофе в кабинет Наполеона, четыре дня тому назад бывший кабинетом императора Александра. Наполеон сел, потрогивая кофе в севрской чашке, и указал на стул подло себя Балашеву.
Есть в человеке известное послеобеденное расположение духа, которое сильнее всяких разумных причин заставляет человека быть довольным собой и считать всех своими друзьями. Наполеон находился в этом расположении. Ему казалось, что он окружен людьми, обожающими его. Он был убежден, что и Балашев после его обеда был его другом и обожателем. Наполеон обратился к нему с приятной и слегка насмешливой улыбкой.
– Это та же комната, как мне говорили, в которой жил император Александр. Странно, не правда ли, генерал? – сказал он, очевидно, не сомневаясь в том, что это обращение не могло не быть приятно его собеседнику, так как оно доказывало превосходство его, Наполеона, над Александром.
Балашев ничего не мог отвечать на это и молча наклонил голову.
– Да, в этой комнате, четыре дня тому назад, совещались Винцингероде и Штейн, – с той же насмешливой, уверенной улыбкой продолжал Наполеон. – Чего я не могу понять, – сказал он, – это того, что император Александр приблизил к себе всех личных моих неприятелей. Я этого не… понимаю. Он не подумал о том, что я могу сделать то же? – с вопросом обратился он к Балашеву, и, очевидно, это воспоминание втолкнуло его опять в тот след утреннего гнева, который еще был свеж в нем.
– И пусть он знает, что я это сделаю, – сказал Наполеон, вставая и отталкивая рукой свою чашку. – Я выгоню из Германии всех его родных, Виртембергских, Баденских, Веймарских… да, я выгоню их. Пусть он готовит для них убежище в России!
Балашев наклонил голову, видом своим показывая, что он желал бы откланяться и слушает только потому, что он не может не слушать того, что ему говорят. Наполеон не замечал этого выражения; он обращался к Балашеву не как к послу своего врага, а как к человеку, который теперь вполне предан ему и должен радоваться унижению своего бывшего господина.
– И зачем император Александр принял начальство над войсками? К чему это? Война мое ремесло, а его дело царствовать, а не командовать войсками. Зачем он взял на себя такую ответственность?
Наполеон опять взял табакерку, молча прошелся несколько раз по комнате и вдруг неожиданно подошел к Балашеву и с легкой улыбкой так уверенно, быстро, просто, как будто он делал какое нибудь не только важное, но и приятное для Балашева дело, поднял руку к лицу сорокалетнего русского генерала и, взяв его за ухо, слегка дернул, улыбнувшись одними губами.
– Avoir l'oreille tiree par l'Empereur [Быть выдранным за ухо императором] считалось величайшей честью и милостью при французском дворе.
– Eh bien, vous ne dites rien, admirateur et courtisan de l'Empereur Alexandre? [Ну у, что ж вы ничего не говорите, обожатель и придворный императора Александра?] – сказал он, как будто смешно было быть в его присутствии чьим нибудь courtisan и admirateur [придворным и обожателем], кроме его, Наполеона.
– Готовы ли лошади для генерала? – прибавил он, слегка наклоняя голову в ответ на поклон Балашева.
– Дайте ему моих, ему далеко ехать…
Письмо, привезенное Балашевым, было последнее письмо Наполеона к Александру. Все подробности разговора были переданы русскому императору, и война началась.


После своего свидания в Москве с Пьером князь Андреи уехал в Петербург по делам, как он сказал своим родным, но, в сущности, для того, чтобы встретить там князя Анатоля Курагина, которого он считал необходимым встретить. Курагина, о котором он осведомился, приехав в Петербург, уже там не было. Пьер дал знать своему шурину, что князь Андрей едет за ним. Анатоль Курагин тотчас получил назначение от военного министра и уехал в Молдавскую армию. В это же время в Петербурге князь Андрей встретил Кутузова, своего прежнего, всегда расположенного к нему, генерала, и Кутузов предложил ему ехать с ним вместе в Молдавскую армию, куда старый генерал назначался главнокомандующим. Князь Андрей, получив назначение состоять при штабе главной квартиры, уехал в Турцию.
Князь Андрей считал неудобным писать к Курагину и вызывать его. Не подав нового повода к дуэли, князь Андрей считал вызов с своей стороны компрометирующим графиню Ростову, и потому он искал личной встречи с Курагиным, в которой он намерен был найти новый повод к дуэли. Но в Турецкой армии ему также не удалось встретить Курагина, который вскоре после приезда князя Андрея в Турецкую армию вернулся в Россию. В новой стране и в новых условиях жизни князю Андрею стало жить легче. После измены своей невесты, которая тем сильнее поразила его, чем старательнее он скрывал ото всех произведенное на него действие, для него были тяжелы те условия жизни, в которых он был счастлив, и еще тяжелее были свобода и независимость, которыми он так дорожил прежде. Он не только не думал тех прежних мыслей, которые в первый раз пришли ему, глядя на небо на Аустерлицком поле, которые он любил развивать с Пьером и которые наполняли его уединение в Богучарове, а потом в Швейцарии и Риме; но он даже боялся вспоминать об этих мыслях, раскрывавших бесконечные и светлые горизонты. Его интересовали теперь только самые ближайшие, не связанные с прежними, практические интересы, за которые он ухватывался с тем большей жадностью, чем закрытое были от него прежние. Как будто тот бесконечный удаляющийся свод неба, стоявший прежде над ним, вдруг превратился в низкий, определенный, давивший его свод, в котором все было ясно, но ничего не было вечного и таинственного.
Из представлявшихся ему деятельностей военная служба была самая простая и знакомая ему. Состоя в должности дежурного генерала при штабе Кутузова, он упорно и усердно занимался делами, удивляя Кутузова своей охотой к работе и аккуратностью. Не найдя Курагина в Турции, князь Андрей не считал необходимым скакать за ним опять в Россию; но при всем том он знал, что, сколько бы ни прошло времени, он не мог, встретив Курагина, несмотря на все презрение, которое он имел к нему, несмотря на все доказательства, которые он делал себе, что ему не стоит унижаться до столкновения с ним, он знал, что, встретив его, он не мог не вызвать его, как не мог голодный человек не броситься на пищу. И это сознание того, что оскорбление еще не вымещено, что злоба не излита, а лежит на сердце, отравляло то искусственное спокойствие, которое в виде озабоченно хлопотливой и несколько честолюбивой и тщеславной деятельности устроил себе князь Андрей в Турции.
В 12 м году, когда до Букарешта (где два месяца жил Кутузов, проводя дни и ночи у своей валашки) дошла весть о войне с Наполеоном, князь Андрей попросил у Кутузова перевода в Западную армию. Кутузов, которому уже надоел Болконский своей деятельностью, служившей ему упреком в праздности, Кутузов весьма охотно отпустил его и дал ему поручение к Барклаю де Толли.
Прежде чем ехать в армию, находившуюся в мае в Дрисском лагере, князь Андрей заехал в Лысые Горы, которые были на самой его дороге, находясь в трех верстах от Смоленского большака. Последние три года и жизни князя Андрея было так много переворотов, так много он передумал, перечувствовал, перевидел (он объехал и запад и восток), что его странно и неожиданно поразило при въезде в Лысые Горы все точно то же, до малейших подробностей, – точно то же течение жизни. Он, как в заколдованный, заснувший замок, въехал в аллею и в каменные ворота лысогорского дома. Та же степенность, та же чистота, та же тишина были в этом доме, те же мебели, те же стены, те же звуки, тот же запах и те же робкие лица, только несколько постаревшие. Княжна Марья была все та же робкая, некрасивая, стареющаяся девушка, в страхе и вечных нравственных страданиях, без пользы и радости проживающая лучшие годы своей жизни. Bourienne была та же радостно пользующаяся каждой минутой своей жизни и исполненная самых для себя радостных надежд, довольная собой, кокетливая девушка. Она только стала увереннее, как показалось князю Андрею. Привезенный им из Швейцарии воспитатель Десаль был одет в сюртук русского покроя, коверкая язык, говорил по русски со слугами, но был все тот же ограниченно умный, образованный, добродетельный и педантический воспитатель. Старый князь переменился физически только тем, что с боку рта у него стал заметен недостаток одного зуба; нравственно он был все такой же, как и прежде, только с еще большим озлоблением и недоверием к действительности того, что происходило в мире. Один только Николушка вырос, переменился, разрумянился, оброс курчавыми темными волосами и, сам не зная того, смеясь и веселясь, поднимал верхнюю губку хорошенького ротика точно так же, как ее поднимала покойница маленькая княгиня. Он один не слушался закона неизменности в этом заколдованном, спящем замке. Но хотя по внешности все оставалось по старому, внутренние отношения всех этих лиц изменились, с тех пор как князь Андрей не видал их. Члены семейства были разделены на два лагеря, чуждые и враждебные между собой, которые сходились теперь только при нем, – для него изменяя свой обычный образ жизни. К одному принадлежали старый князь, m lle Bourienne и архитектор, к другому – княжна Марья, Десаль, Николушка и все няньки и мамки.
Во время его пребывания в Лысых Горах все домашние обедали вместе, но всем было неловко, и князь Андрей чувствовал, что он гость, для которого делают исключение, что он стесняет всех своим присутствием. Во время обеда первого дня князь Андрей, невольно чувствуя это, был молчалив, и старый князь, заметив неестественность его состояния, тоже угрюмо замолчал и сейчас после обеда ушел к себе. Когда ввечеру князь Андрей пришел к нему и, стараясь расшевелить его, стал рассказывать ему о кампании молодого графа Каменского, старый князь неожиданно начал с ним разговор о княжне Марье, осуждая ее за ее суеверие, за ее нелюбовь к m lle Bourienne, которая, по его словам, была одна истинно предана ему.
Старый князь говорил, что ежели он болен, то только от княжны Марьи; что она нарочно мучает и раздражает его; что она баловством и глупыми речами портит маленького князя Николая. Старый князь знал очень хорошо, что он мучает свою дочь, что жизнь ее очень тяжела, но знал тоже, что он не может не мучить ее и что она заслуживает этого. «Почему же князь Андрей, который видит это, мне ничего не говорит про сестру? – думал старый князь. – Что же он думает, что я злодей или старый дурак, без причины отдалился от дочери и приблизил к себе француженку? Он не понимает, и потому надо объяснить ему, надо, чтоб он выслушал», – думал старый князь. И он стал объяснять причины, по которым он не мог переносить бестолкового характера дочери.
– Ежели вы спрашиваете меня, – сказал князь Андрей, не глядя на отца (он в первый раз в жизни осуждал своего отца), – я не хотел говорить; но ежели вы меня спрашиваете, то я скажу вам откровенно свое мнение насчет всего этого. Ежели есть недоразумения и разлад между вами и Машей, то я никак не могу винить ее – я знаю, как она вас любит и уважает. Ежели уж вы спрашиваете меня, – продолжал князь Андрей, раздражаясь, потому что он всегда был готов на раздражение в последнее время, – то я одно могу сказать: ежели есть недоразумения, то причиной их ничтожная женщина, которая бы не должна была быть подругой сестры.
Старик сначала остановившимися глазами смотрел на сына и ненатурально открыл улыбкой новый недостаток зуба, к которому князь Андрей не мог привыкнуть.
– Какая же подруга, голубчик? А? Уж переговорил! А?
– Батюшка, я не хотел быть судьей, – сказал князь Андрей желчным и жестким тоном, – но вы вызвали меня, и я сказал и всегда скажу, что княжна Марья ни виновата, а виноваты… виновата эта француженка…
– А присудил!.. присудил!.. – сказал старик тихим голосом и, как показалось князю Андрею, с смущением, но потом вдруг он вскочил и закричал: – Вон, вон! Чтоб духу твоего тут не было!..

Князь Андрей хотел тотчас же уехать, но княжна Марья упросила остаться еще день. В этот день князь Андрей не виделся с отцом, который не выходил и никого не пускал к себе, кроме m lle Bourienne и Тихона, и спрашивал несколько раз о том, уехал ли его сын. На другой день, перед отъездом, князь Андрей пошел на половину сына. Здоровый, по матери кудрявый мальчик сел ему на колени. Князь Андрей начал сказывать ему сказку о Синей Бороде, но, не досказав, задумался. Он думал не об этом хорошеньком мальчике сыне в то время, как он его держал на коленях, а думал о себе. Он с ужасом искал и не находил в себе ни раскаяния в том, что он раздражил отца, ни сожаления о том, что он (в ссоре в первый раз в жизни) уезжает от него. Главнее всего ему было то, что он искал и не находил той прежней нежности к сыну, которую он надеялся возбудить в себе, приласкав мальчика и посадив его к себе на колени.
– Ну, рассказывай же, – говорил сын. Князь Андрей, не отвечая ему, снял его с колон и пошел из комнаты.
Как только князь Андрей оставил свои ежедневные занятия, в особенности как только он вступил в прежние условия жизни, в которых он был еще тогда, когда он был счастлив, тоска жизни охватила его с прежней силой, и он спешил поскорее уйти от этих воспоминаний и найти поскорее какое нибудь дело.
– Ты решительно едешь, Andre? – сказала ему сестра.
– Слава богу, что могу ехать, – сказал князь Андрей, – очень жалею, что ты не можешь.
– Зачем ты это говоришь! – сказала княжна Марья. – Зачем ты это говоришь теперь, когда ты едешь на эту страшную войну и он так стар! M lle Bourienne говорила, что он спрашивал про тебя… – Как только она начала говорить об этом, губы ее задрожали и слезы закапали. Князь Андрей отвернулся от нее и стал ходить по комнате.
– Ах, боже мой! Боже мой! – сказал он. – И как подумаешь, что и кто – какое ничтожество может быть причиной несчастья людей! – сказал он со злобою, испугавшею княжну Марью.
Она поняла, что, говоря про людей, которых он называл ничтожеством, он разумел не только m lle Bourienne, делавшую его несчастие, но и того человека, который погубил его счастие.
– Andre, об одном я прошу, я умоляю тебя, – сказала она, дотрогиваясь до его локтя и сияющими сквозь слезы глазами глядя на него. – Я понимаю тебя (княжна Марья опустила глаза). Не думай, что горе сделали люди. Люди – орудие его. – Она взглянула немного повыше головы князя Андрея тем уверенным, привычным взглядом, с которым смотрят на знакомое место портрета. – Горе послано им, а не людьми. Люди – его орудия, они не виноваты. Ежели тебе кажется, что кто нибудь виноват перед тобой, забудь это и прости. Мы не имеем права наказывать. И ты поймешь счастье прощать.
– Ежели бы я был женщина, я бы это делал, Marie. Это добродетель женщины. Но мужчина не должен и не может забывать и прощать, – сказал он, и, хотя он до этой минуты не думал о Курагине, вся невымещенная злоба вдруг поднялась в его сердце. «Ежели княжна Марья уже уговаривает меня простить, то, значит, давно мне надо было наказать», – подумал он. И, не отвечая более княжне Марье, он стал думать теперь о той радостной, злобной минуте, когда он встретит Курагина, который (он знал) находится в армии.
Княжна Марья умоляла брата подождать еще день, говорила о том, что она знает, как будет несчастлив отец, ежели Андрей уедет, не помирившись с ним; но князь Андрей отвечал, что он, вероятно, скоро приедет опять из армии, что непременно напишет отцу и что теперь чем дольше оставаться, тем больше растравится этот раздор.
– Adieu, Andre! Rappelez vous que les malheurs viennent de Dieu, et que les hommes ne sont jamais coupables, [Прощай, Андрей! Помни, что несчастия происходят от бога и что люди никогда не бывают виноваты.] – были последние слова, которые он слышал от сестры, когда прощался с нею.
«Так это должно быть! – думал князь Андрей, выезжая из аллеи лысогорского дома. – Она, жалкое невинное существо, остается на съедение выжившему из ума старику. Старик чувствует, что виноват, но не может изменить себя. Мальчик мой растет и радуется жизни, в которой он будет таким же, как и все, обманутым или обманывающим. Я еду в армию, зачем? – сам не знаю, и желаю встретить того человека, которого презираю, для того чтобы дать ему случай убить меня и посмеяться надо мной!И прежде были все те же условия жизни, но прежде они все вязались между собой, а теперь все рассыпалось. Одни бессмысленные явления, без всякой связи, одно за другим представлялись князю Андрею.


Князь Андрей приехал в главную квартиру армии в конце июня. Войска первой армии, той, при которой находился государь, были расположены в укрепленном лагере у Дриссы; войска второй армии отступали, стремясь соединиться с первой армией, от которой – как говорили – они были отрезаны большими силами французов. Все были недовольны общим ходом военных дел в русской армии; но об опасности нашествия в русские губернии никто и не думал, никто и не предполагал, чтобы война могла быть перенесена далее западных польских губерний.
Князь Андрей нашел Барклая де Толли, к которому он был назначен, на берегу Дриссы. Так как не было ни одного большого села или местечка в окрестностях лагеря, то все огромное количество генералов и придворных, бывших при армии, располагалось в окружности десяти верст по лучшим домам деревень, по сю и по ту сторону реки. Барклай де Толли стоял в четырех верстах от государя. Он сухо и холодно принял Болконского и сказал своим немецким выговором, что он доложит о нем государю для определения ему назначения, а покамест просит его состоять при его штабе. Анатоля Курагина, которого князь Андрей надеялся найти в армии, не было здесь: он был в Петербурге, и это известие было приятно Болконскому. Интерес центра производящейся огромной войны занял князя Андрея, и он рад был на некоторое время освободиться от раздражения, которое производила в нем мысль о Курагине. В продолжение первых четырех дней, во время которых он не был никуда требуем, князь Андрей объездил весь укрепленный лагерь и с помощью своих знаний и разговоров с сведущими людьми старался составить себе о нем определенное понятие. Но вопрос о том, выгоден или невыгоден этот лагерь, остался нерешенным для князя Андрея. Он уже успел вывести из своего военного опыта то убеждение, что в военном деле ничего не значат самые глубокомысленно обдуманные планы (как он видел это в Аустерлицком походе), что все зависит от того, как отвечают на неожиданные и не могущие быть предвиденными действия неприятеля, что все зависит от того, как и кем ведется все дело. Для того чтобы уяснить себе этот последний вопрос, князь Андрей, пользуясь своим положением и знакомствами, старался вникнуть в характер управления армией, лиц и партий, участвовавших в оном, и вывел для себя следующее понятие о положении дел.
Когда еще государь был в Вильне, армия была разделена натрое: 1 я армия находилась под начальством Барклая де Толли, 2 я под начальством Багратиона, 3 я под начальством Тормасова. Государь находился при первой армии, но не в качестве главнокомандующего. В приказе не было сказано, что государь будет командовать, сказано только, что государь будет при армии. Кроме того, при государе лично не было штаба главнокомандующего, а был штаб императорской главной квартиры. При нем был начальник императорского штаба генерал квартирмейстер князь Волконский, генералы, флигель адъютанты, дипломатические чиновники и большое количество иностранцев, но не было штаба армии. Кроме того, без должности при государе находились: Аракчеев – бывший военный министр, граф Бенигсен – по чину старший из генералов, великий князь цесаревич Константин Павлович, граф Румянцев – канцлер, Штейн – бывший прусский министр, Армфельд – шведский генерал, Пфуль – главный составитель плана кампании, генерал адъютант Паулучи – сардинский выходец, Вольцоген и многие другие. Хотя эти лица и находились без военных должностей при армии, но по своему положению имели влияние, и часто корпусный начальник и даже главнокомандующий не знал, в качестве чего спрашивает или советует то или другое Бенигсен, или великий князь, или Аракчеев, или князь Волконский, и не знал, от его ли лица или от государя истекает такое то приказание в форме совета и нужно или не нужно исполнять его. Но это была внешняя обстановка, существенный же смысл присутствия государя и всех этих лиц, с придворной точки (а в присутствии государя все делаются придворными), всем был ясен. Он был следующий: государь не принимал на себя звания главнокомандующего, но распоряжался всеми армиями; люди, окружавшие его, были его помощники. Аракчеев был верный исполнитель блюститель порядка и телохранитель государя; Бенигсен был помещик Виленской губернии, который как будто делал les honneurs [был занят делом приема государя] края, а в сущности был хороший генерал, полезный для совета и для того, чтобы иметь его всегда наготове на смену Барклая. Великий князь был тут потому, что это было ему угодно. Бывший министр Штейн был тут потому, что он был полезен для совета, и потому, что император Александр высоко ценил его личные качества. Армфельд был злой ненавистник Наполеона и генерал, уверенный в себе, что имело всегда влияние на Александра. Паулучи был тут потому, что он был смел и решителен в речах, Генерал адъютанты были тут потому, что они везде были, где государь, и, наконец, – главное – Пфуль был тут потому, что он, составив план войны против Наполеона и заставив Александра поверить в целесообразность этого плана, руководил всем делом войны. При Пфуле был Вольцоген, передававший мысли Пфуля в более доступной форме, чем сам Пфуль, резкий, самоуверенный до презрения ко всему, кабинетный теоретик.
Кроме этих поименованных лиц, русских и иностранных (в особенности иностранцев, которые с смелостью, свойственной людям в деятельности среди чужой среды, каждый день предлагали новые неожиданные мысли), было еще много лиц второстепенных, находившихся при армии потому, что тут были их принципалы.
В числе всех мыслей и голосов в этом огромном, беспокойном, блестящем и гордом мире князь Андрей видел следующие, более резкие, подразделения направлений и партий.
Первая партия была: Пфуль и его последователи, теоретики войны, верящие в то, что есть наука войны и что в этой науке есть свои неизменные законы, законы облического движения, обхода и т. п. Пфуль и последователи его требовали отступления в глубь страны, отступления по точным законам, предписанным мнимой теорией войны, и во всяком отступлении от этой теории видели только варварство, необразованность или злонамеренность. К этой партии принадлежали немецкие принцы, Вольцоген, Винцингероде и другие, преимущественно немцы.
Вторая партия была противуположная первой. Как и всегда бывает, при одной крайности были представители другой крайности. Люди этой партии были те, которые еще с Вильны требовали наступления в Польшу и свободы от всяких вперед составленных планов. Кроме того, что представители этой партии были представители смелых действий, они вместе с тем и были представителями национальности, вследствие чего становились еще одностороннее в споре. Эти были русские: Багратион, начинавший возвышаться Ермолов и другие. В это время была распространена известная шутка Ермолова, будто бы просившего государя об одной милости – производства его в немцы. Люди этой партии говорили, вспоминая Суворова, что надо не думать, не накалывать иголками карту, а драться, бить неприятеля, не впускать его в Россию и не давать унывать войску.
К третьей партии, к которой более всего имел доверия государь, принадлежали придворные делатели сделок между обоими направлениями. Люди этой партии, большей частью не военные и к которой принадлежал Аракчеев, думали и говорили, что говорят обыкновенно люди, не имеющие убеждений, но желающие казаться за таковых. Они говорили, что, без сомнения, война, особенно с таким гением, как Бонапарте (его опять называли Бонапарте), требует глубокомысленнейших соображений, глубокого знания науки, и в этом деле Пфуль гениален; но вместе с тем нельзя не признать того, что теоретики часто односторонни, и потому не надо вполне доверять им, надо прислушиваться и к тому, что говорят противники Пфуля, и к тому, что говорят люди практические, опытные в военном деле, и изо всего взять среднее. Люди этой партии настояли на том, чтобы, удержав Дрисский лагерь по плану Пфуля, изменить движения других армий. Хотя этим образом действий не достигалась ни та, ни другая цель, но людям этой партии казалось так лучше.
Четвертое направление было направление, которого самым видным представителем был великий князь, наследник цесаревич, не могший забыть своего аустерлицкого разочарования, где он, как на смотр, выехал перед гвардиею в каске и колете, рассчитывая молодецки раздавить французов, и, попав неожиданно в первую линию, насилу ушел в общем смятении. Люди этой партии имели в своих суждениях и качество и недостаток искренности. Они боялись Наполеона, видели в нем силу, в себе слабость и прямо высказывали это. Они говорили: «Ничего, кроме горя, срама и погибели, из всего этого не выйдет! Вот мы оставили Вильну, оставили Витебск, оставим и Дриссу. Одно, что нам остается умного сделать, это заключить мир, и как можно скорее, пока не выгнали нас из Петербурга!»
Воззрение это, сильно распространенное в высших сферах армии, находило себе поддержку и в Петербурге, и в канцлере Румянцеве, по другим государственным причинам стоявшем тоже за мир.
Пятые были приверженцы Барклая де Толли, не столько как человека, сколько как военного министра и главнокомандующего. Они говорили: «Какой он ни есть (всегда так начинали), но он честный, дельный человек, и лучше его нет. Дайте ему настоящую власть, потому что война не может идти успешно без единства начальствования, и он покажет то, что он может сделать, как он показал себя в Финляндии. Ежели армия наша устроена и сильна и отступила до Дриссы, не понесши никаких поражений, то мы обязаны этим только Барклаю. Ежели теперь заменят Барклая Бенигсеном, то все погибнет, потому что Бенигсен уже показал свою неспособность в 1807 году», – говорили люди этой партии.
Шестые, бенигсенисты, говорили, напротив, что все таки не было никого дельнее и опытнее Бенигсена, и, как ни вертись, все таки придешь к нему. И люди этой партии доказывали, что все наше отступление до Дриссы было постыднейшее поражение и беспрерывный ряд ошибок. «Чем больше наделают ошибок, – говорили они, – тем лучше: по крайней мере, скорее поймут, что так не может идти. А нужен не какой нибудь Барклай, а человек, как Бенигсен, который показал уже себя в 1807 м году, которому отдал справедливость сам Наполеон, и такой человек, за которым бы охотно признавали власть, – и таковой есть только один Бенигсен».
Седьмые – были лица, которые всегда есть, в особенности при молодых государях, и которых особенно много было при императоре Александре, – лица генералов и флигель адъютантов, страстно преданные государю не как императору, но как человека обожающие его искренно и бескорыстно, как его обожал Ростов в 1805 м году, и видящие в нем не только все добродетели, но и все качества человеческие. Эти лица хотя и восхищались скромностью государя, отказывавшегося от командования войсками, но осуждали эту излишнюю скромность и желали только одного и настаивали на том, чтобы обожаемый государь, оставив излишнее недоверие к себе, объявил открыто, что он становится во главе войска, составил бы при себе штаб квартиру главнокомандующего и, советуясь, где нужно, с опытными теоретиками и практиками, сам бы вел свои войска, которых одно это довело бы до высшего состояния воодушевления.
Восьмая, самая большая группа людей, которая по своему огромному количеству относилась к другим, как 99 к 1 му, состояла из людей, не желавших ни мира, ни войны, ни наступательных движений, ни оборонительного лагеря ни при Дриссе, ни где бы то ни было, ни Барклая, ни государя, ни Пфуля, ни Бенигсена, но желающих только одного, и самого существенного: наибольших для себя выгод и удовольствий. В той мутной воде перекрещивающихся и перепутывающихся интриг, которые кишели при главной квартире государя, в весьма многом можно было успеть в таком, что немыслимо бы было в другое время. Один, не желая только потерять своего выгодного положения, нынче соглашался с Пфулем, завтра с противником его, послезавтра утверждал, что не имеет никакого мнения об известном предмете, только для того, чтобы избежать ответственности и угодить государю. Другой, желающий приобрести выгоды, обращал на себя внимание государя, громко крича то самое, на что намекнул государь накануне, спорил и кричал в совете, ударяя себя в грудь и вызывая несоглашающихся на дуэль и тем показывая, что он готов быть жертвою общей пользы. Третий просто выпрашивал себе, между двух советов и в отсутствие врагов, единовременное пособие за свою верную службу, зная, что теперь некогда будет отказать ему. Четвертый нечаянно все попадался на глаза государю, отягченный работой. Пятый, для того чтобы достигнуть давно желанной цели – обеда у государя, ожесточенно доказывал правоту или неправоту вновь выступившего мнения и для этого приводил более или менее сильные и справедливые доказательства.
Все люди этой партии ловили рубли, кресты, чины и в этом ловлении следили только за направлением флюгера царской милости, и только что замечали, что флюгер обратился в одну сторону, как все это трутневое население армии начинало дуть в ту же сторону, так что государю тем труднее было повернуть его в другую. Среди неопределенности положения, при угрожающей, серьезной опасности, придававшей всему особенно тревожный характер, среди этого вихря интриг, самолюбий, столкновений различных воззрений и чувств, при разноплеменности всех этих лиц, эта восьмая, самая большая партия людей, нанятых личными интересами, придавала большую запутанность и смутность общему делу. Какой бы ни поднимался вопрос, а уж рой этих трутней, не оттрубив еще над прежней темой, перелетал на новую и своим жужжанием заглушал и затемнял искренние, спорящие голоса.
Из всех этих партий, в то самое время, как князь Андрей приехал к армии, собралась еще одна, девятая партия, начинавшая поднимать свой голос. Это была партия людей старых, разумных, государственно опытных и умевших, не разделяя ни одного из противоречащих мнений, отвлеченно посмотреть на все, что делалось при штабе главной квартиры, и обдумать средства к выходу из этой неопределенности, нерешительности, запутанности и слабости.
Люди этой партии говорили и думали, что все дурное происходит преимущественно от присутствия государя с военным двором при армии; что в армию перенесена та неопределенная, условная и колеблющаяся шаткость отношений, которая удобна при дворе, но вредна в армии; что государю нужно царствовать, а не управлять войском; что единственный выход из этого положения есть отъезд государя с его двором из армии; что одно присутствие государя парализует пятьдесят тысяч войска, нужных для обеспечения его личной безопасности; что самый плохой, но независимый главнокомандующий будет лучше самого лучшего, но связанного присутствием и властью государя.
В то самое время как князь Андрей жил без дела при Дриссе, Шишков, государственный секретарь, бывший одним из главных представителей этой партии, написал государю письмо, которое согласились подписать Балашев и Аракчеев. В письме этом, пользуясь данным ему от государя позволением рассуждать об общем ходе дел, он почтительно и под предлогом необходимости для государя воодушевить к войне народ в столице, предлагал государю оставить войско.
Одушевление государем народа и воззвание к нему для защиты отечества – то самое (насколько оно произведено было личным присутствием государя в Москве) одушевление народа, которое было главной причиной торжества России, было представлено государю и принято им как предлог для оставления армии.

Х
Письмо это еще не было подано государю, когда Барклай за обедом передал Болконскому, что государю лично угодно видеть князя Андрея, для того чтобы расспросить его о Турции, и что князь Андрей имеет явиться в квартиру Бенигсена в шесть часов вечера.
В этот же день в квартире государя было получено известие о новом движении Наполеона, могущем быть опасным для армии, – известие, впоследствии оказавшееся несправедливым. И в это же утро полковник Мишо, объезжая с государем дрисские укрепления, доказывал государю, что укрепленный лагерь этот, устроенный Пфулем и считавшийся до сих пор chef d'?uvr'ом тактики, долженствующим погубить Наполеона, – что лагерь этот есть бессмыслица и погибель русской армии.
Князь Андрей приехал в квартиру генерала Бенигсена, занимавшего небольшой помещичий дом на самом берегу реки. Ни Бенигсена, ни государя не было там, но Чернышев, флигель адъютант государя, принял Болконского и объявил ему, что государь поехал с генералом Бенигсеном и с маркизом Паулучи другой раз в нынешний день для объезда укреплений Дрисского лагеря, в удобности которого начинали сильно сомневаться.
Чернышев сидел с книгой французского романа у окна первой комнаты. Комната эта, вероятно, была прежде залой; в ней еще стоял орган, на который навалены были какие то ковры, и в одном углу стояла складная кровать адъютанта Бенигсена. Этот адъютант был тут. Он, видно, замученный пирушкой или делом, сидел на свернутой постеле и дремал. Из залы вели две двери: одна прямо в бывшую гостиную, другая направо в кабинет. Из первой двери слышались голоса разговаривающих по немецки и изредка по французски. Там, в бывшей гостиной, были собраны, по желанию государя, не военный совет (государь любил неопределенность), но некоторые лица, которых мнение о предстоящих затруднениях он желал знать. Это не был военный совет, но как бы совет избранных для уяснения некоторых вопросов лично для государя. На этот полусовет были приглашены: шведский генерал Армфельд, генерал адъютант Вольцоген, Винцингероде, которого Наполеон называл беглым французским подданным, Мишо, Толь, вовсе не военный человек – граф Штейн и, наконец, сам Пфуль, который, как слышал князь Андрей, был la cheville ouvriere [основою] всего дела. Князь Андрей имел случай хорошо рассмотреть его, так как Пфуль вскоре после него приехал и прошел в гостиную, остановившись на минуту поговорить с Чернышевым.
Пфуль с первого взгляда, в своем русском генеральском дурно сшитом мундире, который нескладно, как на наряженном, сидел на нем, показался князю Андрею как будто знакомым, хотя он никогда не видал его. В нем был и Вейротер, и Мак, и Шмидт, и много других немецких теоретиков генералов, которых князю Андрею удалось видеть в 1805 м году; но он был типичнее всех их. Такого немца теоретика, соединявшего в себе все, что было в тех немцах, еще никогда не видал князь Андрей.
Пфуль был невысок ростом, очень худ, но ширококост, грубого, здорового сложения, с широким тазом и костлявыми лопатками. Лицо у него было очень морщинисто, с глубоко вставленными глазами. Волоса его спереди у висков, очевидно, торопливо были приглажены щеткой, сзади наивно торчали кисточками. Он, беспокойно и сердито оглядываясь, вошел в комнату, как будто он всего боялся в большой комнате, куда он вошел. Он, неловким движением придерживая шпагу, обратился к Чернышеву, спрашивая по немецки, где государь. Ему, видно, как можно скорее хотелось пройти комнаты, окончить поклоны и приветствия и сесть за дело перед картой, где он чувствовал себя на месте. Он поспешно кивал головой на слова Чернышева и иронически улыбался, слушая его слова о том, что государь осматривает укрепления, которые он, сам Пфуль, заложил по своей теории. Он что то басисто и круто, как говорят самоуверенные немцы, проворчал про себя: Dummkopf… или: zu Grunde die ganze Geschichte… или: s'wird was gescheites d'raus werden… [глупости… к черту все дело… (нем.) ] Князь Андрей не расслышал и хотел пройти, но Чернышев познакомил князя Андрея с Пфулем, заметив, что князь Андрей приехал из Турции, где так счастливо кончена война. Пфуль чуть взглянул не столько на князя Андрея, сколько через него, и проговорил смеясь: «Da muss ein schoner taktischcr Krieg gewesen sein». [«То то, должно быть, правильно тактическая была война.» (нем.) ] – И, засмеявшись презрительно, прошел в комнату, из которой слышались голоса.
Видно, Пфуль, уже всегда готовый на ироническое раздражение, нынче был особенно возбужден тем, что осмелились без него осматривать его лагерь и судить о нем. Князь Андрей по одному короткому этому свиданию с Пфулем благодаря своим аустерлицким воспоминаниям составил себе ясную характеристику этого человека. Пфуль был один из тех безнадежно, неизменно, до мученичества самоуверенных людей, которыми только бывают немцы, и именно потому, что только немцы бывают самоуверенными на основании отвлеченной идеи – науки, то есть мнимого знания совершенной истины. Француз бывает самоуверен потому, что он почитает себя лично, как умом, так и телом, непреодолимо обворожительным как для мужчин, так и для женщин. Англичанин самоуверен на том основании, что он есть гражданин благоустроеннейшего в мире государства, и потому, как англичанин, знает всегда, что ему делать нужно, и знает, что все, что он делает как англичанин, несомненно хорошо. Итальянец самоуверен потому, что он взволнован и забывает легко и себя и других. Русский самоуверен именно потому, что он ничего не знает и знать не хочет, потому что не верит, чтобы можно было вполне знать что нибудь. Немец самоуверен хуже всех, и тверже всех, и противнее всех, потому что он воображает, что знает истину, науку, которую он сам выдумал, но которая для него есть абсолютная истина. Таков, очевидно, был Пфуль. У него была наука – теория облического движения, выведенная им из истории войн Фридриха Великого, и все, что встречалось ему в новейшей истории войн Фридриха Великого, и все, что встречалось ему в новейшей военной истории, казалось ему бессмыслицей, варварством, безобразным столкновением, в котором с обеих сторон было сделано столько ошибок, что войны эти не могли быть названы войнами: они не подходили под теорию и не могли служить предметом науки.
В 1806 м году Пфуль был одним из составителей плана войны, кончившейся Иеной и Ауерштетом; но в исходе этой войны он не видел ни малейшего доказательства неправильности своей теории. Напротив, сделанные отступления от его теории, по его понятиям, были единственной причиной всей неудачи, и он с свойственной ему радостной иронией говорил: «Ich sagte ja, daji die ganze Geschichte zum Teufel gehen wird». [Ведь я же говорил, что все дело пойдет к черту (нем.) ] Пфуль был один из тех теоретиков, которые так любят свою теорию, что забывают цель теории – приложение ее к практике; он в любви к теории ненавидел всякую практику и знать ее не хотел. Он даже радовался неуспеху, потому что неуспех, происходивший от отступления в практике от теории, доказывал ему только справедливость его теории.
Он сказал несколько слов с князем Андреем и Чернышевым о настоящей войне с выражением человека, который знает вперед, что все будет скверно и что даже не недоволен этим. Торчавшие на затылке непричесанные кисточки волос и торопливо прилизанные височки особенно красноречиво подтверждали это.
Он прошел в другую комнату, и оттуда тотчас же послышались басистые и ворчливые звуки его голоса.


Не успел князь Андрей проводить глазами Пфуля, как в комнату поспешно вошел граф Бенигсен и, кивнув головой Болконскому, не останавливаясь, прошел в кабинет, отдавая какие то приказания своему адъютанту. Государь ехал за ним, и Бенигсен поспешил вперед, чтобы приготовить кое что и успеть встретить государя. Чернышев и князь Андрей вышли на крыльцо. Государь с усталым видом слезал с лошади. Маркиз Паулучи что то говорил государю. Государь, склонив голову налево, с недовольным видом слушал Паулучи, говорившего с особенным жаром. Государь тронулся вперед, видимо, желая окончить разговор, но раскрасневшийся, взволнованный итальянец, забывая приличия, шел за ним, продолжая говорить:
– Quant a celui qui a conseille ce camp, le camp de Drissa, [Что же касается того, кто присоветовал Дрисский лагерь,] – говорил Паулучи, в то время как государь, входя на ступеньки и заметив князя Андрея, вглядывался в незнакомое ему лицо.
– Quant a celui. Sire, – продолжал Паулучи с отчаянностью, как будто не в силах удержаться, – qui a conseille le camp de Drissa, je ne vois pas d'autre alternative que la maison jaune ou le gibet. [Что же касается, государь, до того человека, который присоветовал лагерь при Дрисее, то для него, по моему мнению, есть только два места: желтый дом или виселица.] – Не дослушав и как будто не слыхав слов итальянца, государь, узнав Болконского, милостиво обратился к нему:
– Очень рад тебя видеть, пройди туда, где они собрались, и подожди меня. – Государь прошел в кабинет. За ним прошел князь Петр Михайлович Волконский, барон Штейн, и за ними затворились двери. Князь Андрей, пользуясь разрешением государя, прошел с Паулучи, которого он знал еще в Турции, в гостиную, где собрался совет.
Князь Петр Михайлович Волконский занимал должность как бы начальника штаба государя. Волконский вышел из кабинета и, принеся в гостиную карты и разложив их на столе, передал вопросы, на которые он желал слышать мнение собранных господ. Дело было в том, что в ночь было получено известие (впоследствии оказавшееся ложным) о движении французов в обход Дрисского лагеря.
Первый начал говорить генерал Армфельд, неожиданно, во избежание представившегося затруднения, предложив совершенно новую, ничем (кроме как желанием показать, что он тоже может иметь мнение) не объяснимую позицию в стороне от Петербургской и Московской дорог, на которой, по его мнению, армия должна была, соединившись, ожидать неприятеля. Видно было, что этот план давно был составлен Армфельдом и что он теперь изложил его не столько с целью отвечать на предлагаемые вопросы, на которые план этот не отвечал, сколько с целью воспользоваться случаем высказать его. Это было одно из миллионов предположений, которые так же основательно, как и другие, можно было делать, не имея понятия о том, какой характер примет война. Некоторые оспаривали его мнение, некоторые защищали его. Молодой полковник Толь горячее других оспаривал мнение шведского генерала и во время спора достал из бокового кармана исписанную тетрадь, которую он попросил позволения прочесть. В пространно составленной записке Толь предлагал другой – совершенно противный и плану Армфельда и плану Пфуля – план кампании. Паулучи, возражая Толю, предложил план движения вперед и атаки, которая одна, по его словам, могла вывести нас из неизвестности и западни, как он называл Дрисский лагерь, в которой мы находились. Пфуль во время этих споров и его переводчик Вольцоген (его мост в придворном отношении) молчали. Пфуль только презрительно фыркал и отворачивался, показывая, что он никогда не унизится до возражения против того вздора, который он теперь слышит. Но когда князь Волконский, руководивший прениями, вызвал его на изложение своего мнения, он только сказал:
– Что же меня спрашивать? Генерал Армфельд предложил прекрасную позицию с открытым тылом. Или атаку von diesem italienischen Herrn, sehr schon! [этого итальянского господина, очень хорошо! (нем.) ] Или отступление. Auch gut. [Тоже хорошо (нем.) ] Что ж меня спрашивать? – сказал он. – Ведь вы сами знаете все лучше меня. – Но когда Волконский, нахмурившись, сказал, что он спрашивает его мнение от имени государя, то Пфуль встал и, вдруг одушевившись, начал говорить:
– Все испортили, все спутали, все хотели знать лучше меня, а теперь пришли ко мне: как поправить? Нечего поправлять. Надо исполнять все в точности по основаниям, изложенным мною, – говорил он, стуча костлявыми пальцами по столу. – В чем затруднение? Вздор, Kinder spiel. [детские игрушки (нем.) ] – Он подошел к карте и стал быстро говорить, тыкая сухим пальцем по карте и доказывая, что никакая случайность не может изменить целесообразности Дрисского лагеря, что все предвидено и что ежели неприятель действительно пойдет в обход, то неприятель должен быть неминуемо уничтожен.
Паулучи, не знавший по немецки, стал спрашивать его по французски. Вольцоген подошел на помощь своему принципалу, плохо говорившему по французски, и стал переводить его слова, едва поспевая за Пфулем, который быстро доказывал, что все, все, не только то, что случилось, но все, что только могло случиться, все было предвидено в его плане, и что ежели теперь были затруднения, то вся вина была только в том, что не в точности все исполнено. Он беспрестанно иронически смеялся, доказывал и, наконец, презрительно бросил доказывать, как бросает математик поверять различными способами раз доказанную верность задачи. Вольцоген заменил его, продолжая излагать по французски его мысли и изредка говоря Пфулю: «Nicht wahr, Exellenz?» [Не правда ли, ваше превосходительство? (нем.) ] Пфуль, как в бою разгоряченный человек бьет по своим, сердито кричал на Вольцогена:
– Nun ja, was soll denn da noch expliziert werden? [Ну да, что еще тут толковать? (нем.) ] – Паулучи и Мишо в два голоса нападали на Вольцогена по французски. Армфельд по немецки обращался к Пфулю. Толь по русски объяснял князю Волконскому. Князь Андрей молча слушал и наблюдал.
Из всех этих лиц более всех возбуждал участие в князе Андрее озлобленный, решительный и бестолково самоуверенный Пфуль. Он один из всех здесь присутствовавших лиц, очевидно, ничего не желал для себя, ни к кому не питал вражды, а желал только одного – приведения в действие плана, составленного по теории, выведенной им годами трудов. Он был смешон, был неприятен своей ироничностью, но вместе с тем он внушал невольное уважение своей беспредельной преданностью идее. Кроме того, во всех речах всех говоривших была, за исключением Пфуля, одна общая черта, которой не было на военном совете в 1805 м году, – это был теперь хотя и скрываемый, но панический страх перед гением Наполеона, страх, который высказывался в каждом возражении. Предполагали для Наполеона всё возможным, ждали его со всех сторон и его страшным именем разрушали предположения один другого. Один Пфуль, казалось, и его, Наполеона, считал таким же варваром, как и всех оппонентов своей теории. Но, кроме чувства уважения, Пфуль внушал князю Андрею и чувство жалости. По тому тону, с которым с ним обращались придворные, по тому, что позволил себе сказать Паулучи императору, но главное по некоторой отчаянности выражении самого Пфуля, видно было, что другие знали и он сам чувствовал, что падение его близко. И, несмотря на свою самоуверенность и немецкую ворчливую ироничность, он был жалок с своими приглаженными волосами на височках и торчавшими на затылке кисточками. Он, видимо, хотя и скрывал это под видом раздражения и презрения, он был в отчаянии оттого, что единственный теперь случай проверить на огромном опыте и доказать всему миру верность своей теории ускользал от него.
Прения продолжались долго, и чем дольше они продолжались, тем больше разгорались споры, доходившие до криков и личностей, и тем менее было возможно вывести какое нибудь общее заключение из всего сказанного. Князь Андрей, слушая этот разноязычный говор и эти предположения, планы и опровержения и крики, только удивлялся тому, что они все говорили. Те, давно и часто приходившие ему во время его военной деятельности, мысли, что нет и не может быть никакой военной науки и поэтому не может быть никакого так называемого военного гения, теперь получили для него совершенную очевидность истины. «Какая же могла быть теория и наука в деле, которого условия и обстоятельства неизвестны и не могут быть определены, в котором сила деятелей войны еще менее может быть определена? Никто не мог и не может знать, в каком будет положении наша и неприятельская армия через день, и никто не может знать, какая сила этого или того отряда. Иногда, когда нет труса впереди, который закричит: „Мы отрезаны! – и побежит, а есть веселый, смелый человек впереди, который крикнет: «Ура! – отряд в пять тысяч стоит тридцати тысяч, как под Шепграбеном, а иногда пятьдесят тысяч бегут перед восемью, как под Аустерлицем. Какая же может быть наука в таком деле, в котором, как во всяком практическом деле, ничто не может быть определено и все зависит от бесчисленных условий, значение которых определяется в одну минуту, про которую никто не знает, когда она наступит. Армфельд говорит, что наша армия отрезана, а Паулучи говорит, что мы поставили французскую армию между двух огней; Мишо говорит, что негодность Дрисского лагеря состоит в том, что река позади, а Пфуль говорит, что в этом его сила. Толь предлагает один план, Армфельд предлагает другой; и все хороши, и все дурны, и выгоды всякого положения могут быть очевидны только в тот момент, когда совершится событие. И отчего все говорят: гений военный? Разве гений тот человек, который вовремя успеет велеть подвезти сухари и идти тому направо, тому налево? Оттого только, что военные люди облечены блеском и властью и массы подлецов льстят власти, придавая ей несвойственные качества гения, их называют гениями. Напротив, лучшие генералы, которых я знал, – глупые или рассеянные люди. Лучший Багратион, – сам Наполеон признал это. А сам Бонапарте! Я помню самодовольное и ограниченное его лицо на Аустерлицком поле. Не только гения и каких нибудь качеств особенных не нужно хорошему полководцу, но, напротив, ему нужно отсутствие самых лучших высших, человеческих качеств – любви, поэзии, нежности, философского пытливого сомнения. Он должен быть ограничен, твердо уверен в том, что то, что он делает, очень важно (иначе у него недостанет терпения), и тогда только он будет храбрый полководец. Избави бог, коли он человек, полюбит кого нибудь, пожалеет, подумает о том, что справедливо и что нет. Понятно, что исстари еще для них подделали теорию гениев, потому что они – власть. Заслуга в успехе военного дела зависит не от них, а от того человека, который в рядах закричит: пропали, или закричит: ура! И только в этих рядах можно служить с уверенностью, что ты полезен!“
Так думал князь Андрей, слушая толки, и очнулся только тогда, когда Паулучи позвал его и все уже расходились.
На другой день на смотру государь спросил у князя Андрея, где он желает служить, и князь Андрей навеки потерял себя в придворном мире, не попросив остаться при особе государя, а попросив позволения служить в армии.


Ростов перед открытием кампании получил письмо от родителей, в котором, кратко извещая его о болезни Наташи и о разрыве с князем Андреем (разрыв этот объясняли ему отказом Наташи), они опять просили его выйти в отставку и приехать домой. Николай, получив это письмо, и не попытался проситься в отпуск или отставку, а написал родителям, что очень жалеет о болезни и разрыве Наташи с ее женихом и что он сделает все возможное для того, чтобы исполнить их желание. Соне он писал отдельно.
«Обожаемый друг души моей, – писал он. – Ничто, кроме чести, не могло бы удержать меня от возвращения в деревню. Но теперь, перед открытием кампании, я бы счел себя бесчестным не только перед всеми товарищами, но и перед самим собою, ежели бы я предпочел свое счастие своему долгу и любви к отечеству. Но это последняя разлука. Верь, что тотчас после войны, ежели я буду жив и все любим тобою, я брошу все и прилечу к тебе, чтобы прижать тебя уже навсегда к моей пламенной груди».
Действительно, только открытие кампании задержало Ростова и помешало ему приехать – как он обещал – и жениться на Соне. Отрадненская осень с охотой и зима со святками и с любовью Сони открыли ему перспективу тихих дворянских радостей и спокойствия, которых он не знал прежде и которые теперь манили его к себе. «Славная жена, дети, добрая стая гончих, лихие десять – двенадцать свор борзых, хозяйство, соседи, служба по выборам! – думал он. Но теперь была кампания, и надо было оставаться в полку. А так как это надо было, то Николай Ростов, по своему характеру, был доволен и той жизнью, которую он вел в полку, и сумел сделать себе эту жизнь приятною.
Приехав из отпуска, радостно встреченный товарищами, Николай был посылал за ремонтом и из Малороссии привел отличных лошадей, которые радовали его и заслужили ему похвалы от начальства. В отсутствие его он был произведен в ротмистры, и когда полк был поставлен на военное положение с увеличенным комплектом, он опять получил свой прежний эскадрон.
Началась кампания, полк был двинут в Польшу, выдавалось двойное жалованье, прибыли новые офицеры, новые люди, лошади; и, главное, распространилось то возбужденно веселое настроение, которое сопутствует началу войны; и Ростов, сознавая свое выгодное положение в полку, весь предался удовольствиям и интересам военной службы, хотя и знал, что рано или поздно придется их покинуть.
Войска отступали от Вильны по разным сложным государственным, политическим и тактическим причинам. Каждый шаг отступления сопровождался сложной игрой интересов, умозаключений и страстей в главном штабе. Для гусар же Павлоградского полка весь этот отступательный поход, в лучшую пору лета, с достаточным продовольствием, был самым простым и веселым делом. Унывать, беспокоиться и интриговать могли в главной квартире, а в глубокой армии и не спрашивали себя, куда, зачем идут. Если жалели, что отступают, то только потому, что надо было выходить из обжитой квартиры, от хорошенькой панны. Ежели и приходило кому нибудь в голову, что дела плохи, то, как следует хорошему военному человеку, тот, кому это приходило в голову, старался быть весел и не думать об общем ходе дел, а думать о своем ближайшем деле. Сначала весело стояли подле Вильны, заводя знакомства с польскими помещиками и ожидая и отбывая смотры государя и других высших командиров. Потом пришел приказ отступить к Свенцянам и истреблять провиант, который нельзя было увезти. Свенцяны памятны были гусарам только потому, что это был пьяный лагерь, как прозвала вся армия стоянку у Свенцян, и потому, что в Свенцянах много было жалоб на войска за то, что они, воспользовавшись приказанием отбирать провиант, в числе провианта забирали и лошадей, и экипажи, и ковры у польских панов. Ростов помнил Свенцяны потому, что он в первый день вступления в это местечко сменил вахмистра и не мог справиться с перепившимися всеми людьми эскадрона, которые без его ведома увезли пять бочек старого пива. От Свенцян отступали дальше и дальше до Дриссы, и опять отступили от Дриссы, уже приближаясь к русским границам.
13 го июля павлоградцам в первый раз пришлось быть в серьезном деле.
12 го июля в ночь, накануне дела, была сильная буря с дождем и грозой. Лето 1812 года вообще было замечательно бурями.
Павлоградские два эскадрона стояли биваками, среди выбитого дотла скотом и лошадьми, уже выколосившегося ржаного поля. Дождь лил ливмя, и Ростов с покровительствуемым им молодым офицером Ильиным сидел под огороженным на скорую руку шалашиком. Офицер их полка, с длинными усами, продолжавшимися от щек, ездивший в штаб и застигнутый дождем, зашел к Ростову.
– Я, граф, из штаба. Слышали подвиг Раевского? – И офицер рассказал подробности Салтановского сражения, слышанные им в штабе.
Ростов, пожимаясь шеей, за которую затекала вода, курил трубку и слушал невнимательно, изредка поглядывая на молодого офицера Ильина, который жался около него. Офицер этот, шестнадцатилетний мальчик, недавно поступивший в полк, был теперь в отношении к Николаю тем, чем был Николай в отношении к Денисову семь лет тому назад. Ильин старался во всем подражать Ростову и, как женщина, был влюблен в него.
Офицер с двойными усами, Здржинский, рассказывал напыщенно о том, как Салтановская плотина была Фермопилами русских, как на этой плотине был совершен генералом Раевским поступок, достойный древности. Здржинский рассказывал поступок Раевского, который вывел на плотину своих двух сыновей под страшный огонь и с ними рядом пошел в атаку. Ростов слушал рассказ и не только ничего не говорил в подтверждение восторга Здржинского, но, напротив, имел вид человека, который стыдился того, что ему рассказывают, хотя и не намерен возражать. Ростов после Аустерлицкой и 1807 года кампаний знал по своему собственному опыту, что, рассказывая военные происшествия, всегда врут, как и сам он врал, рассказывая; во вторых, он имел настолько опытности, что знал, как все происходит на войне совсем не так, как мы можем воображать и рассказывать. И потому ему не нравился рассказ Здржинского, не нравился и сам Здржинский, который, с своими усами от щек, по своей привычке низко нагибался над лицом того, кому он рассказывал, и теснил его в тесном шалаше. Ростов молча смотрел на него. «Во первых, на плотине, которую атаковали, должна была быть, верно, такая путаница и теснота, что ежели Раевский и вывел своих сыновей, то это ни на кого не могло подействовать, кроме как человек на десять, которые были около самого его, – думал Ростов, – остальные и не могли видеть, как и с кем шел Раевский по плотине. Но и те, которые видели это, не могли очень воодушевиться, потому что что им было за дело до нежных родительских чувств Раевского, когда тут дело шло о собственной шкуре? Потом оттого, что возьмут или не возьмут Салтановскую плотину, не зависела судьба отечества, как нам описывают это про Фермопилы. И стало быть, зачем же было приносить такую жертву? И потом, зачем тут, на войне, мешать своих детей? Я бы не только Петю брата не повел бы, даже и Ильина, даже этого чужого мне, но доброго мальчика, постарался бы поставить куда нибудь под защиту», – продолжал думать Ростов, слушая Здржинского. Но он не сказал своих мыслей: он и на это уже имел опыт. Он знал, что этот рассказ содействовал к прославлению нашего оружия, и потому надо было делать вид, что не сомневаешься в нем. Так он и делал.
– Однако мочи нет, – сказал Ильин, замечавший, что Ростову не нравится разговор Здржинского. – И чулки, и рубашка, и под меня подтекло. Пойду искать приюта. Кажется, дождик полегче. – Ильин вышел, и Здржинский уехал.
Через пять минут Ильин, шлепая по грязи, прибежал к шалашу.
– Ура! Ростов, идем скорее. Нашел! Вот тут шагов двести корчма, уж туда забрались наши. Хоть посушимся, и Марья Генриховна там.
Марья Генриховна была жена полкового доктора, молодая, хорошенькая немка, на которой доктор женился в Польше. Доктор, или оттого, что не имел средств, или оттого, что не хотел первое время женитьбы разлучаться с молодой женой, возил ее везде за собой при гусарском полку, и ревность доктора сделалась обычным предметом шуток между гусарскими офицерами.
Ростов накинул плащ, кликнул за собой Лаврушку с вещами и пошел с Ильиным, где раскатываясь по грязи, где прямо шлепая под утихавшим дождем, в темноте вечера, изредка нарушаемой далекими молниями.
– Ростов, ты где?
– Здесь. Какова молния! – переговаривались они.


В покинутой корчме, перед которою стояла кибиточка доктора, уже было человек пять офицеров. Марья Генриховна, полная белокурая немочка в кофточке и ночном чепчике, сидела в переднем углу на широкой лавке. Муж ее, доктор, спал позади ее. Ростов с Ильиным, встреченные веселыми восклицаниями и хохотом, вошли в комнату.
– И! да у вас какое веселье, – смеясь, сказал Ростов.
– А вы что зеваете?
– Хороши! Так и течет с них! Гостиную нашу не замочите.
– Марьи Генриховны платье не запачкать, – отвечали голоса.
Ростов с Ильиным поспешили найти уголок, где бы они, не нарушая скромности Марьи Генриховны, могли бы переменить мокрое платье. Они пошли было за перегородку, чтобы переодеться; но в маленьком чуланчике, наполняя его весь, с одной свечкой на пустом ящике, сидели три офицера, играя в карты, и ни за что не хотели уступить свое место. Марья Генриховна уступила на время свою юбку, чтобы употребить ее вместо занавески, и за этой занавеской Ростов и Ильин с помощью Лаврушки, принесшего вьюки, сняли мокрое и надели сухое платье.
В разломанной печке разложили огонь. Достали доску и, утвердив ее на двух седлах, покрыли попоной, достали самоварчик, погребец и полбутылки рому, и, попросив Марью Генриховну быть хозяйкой, все столпились около нее. Кто предлагал ей чистый носовой платок, чтобы обтирать прелестные ручки, кто под ножки подкладывал ей венгерку, чтобы не было сыро, кто плащом занавешивал окно, чтобы не дуло, кто обмахивал мух с лица ее мужа, чтобы он не проснулся.
– Оставьте его, – говорила Марья Генриховна, робко и счастливо улыбаясь, – он и так спит хорошо после бессонной ночи.
– Нельзя, Марья Генриховна, – отвечал офицер, – надо доктору прислужиться. Все, может быть, и он меня пожалеет, когда ногу или руку резать станет.
Стаканов было только три; вода была такая грязная, что нельзя было решить, когда крепок или некрепок чай, и в самоваре воды было только на шесть стаканов, но тем приятнее было по очереди и старшинству получить свой стакан из пухлых с короткими, не совсем чистыми, ногтями ручек Марьи Генриховны. Все офицеры, казалось, действительно были в этот вечер влюблены в Марью Генриховну. Даже те офицеры, которые играли за перегородкой в карты, скоро бросили игру и перешли к самовару, подчиняясь общему настроению ухаживанья за Марьей Генриховной. Марья Генриховна, видя себя окруженной такой блестящей и учтивой молодежью, сияла счастьем, как ни старалась она скрывать этого и как ни очевидно робела при каждом сонном движении спавшего за ней мужа.
Ложка была только одна, сахару было больше всего, но размешивать его не успевали, и потому было решено, что она будет поочередно мешать сахар каждому. Ростов, получив свой стакан и подлив в него рому, попросил Марью Генриховну размешать.
– Да ведь вы без сахара? – сказала она, все улыбаясь, как будто все, что ни говорила она, и все, что ни говорили другие, было очень смешно и имело еще другое значение.
– Да мне не сахар, мне только, чтоб вы помешали своей ручкой.
Марья Генриховна согласилась и стала искать ложку, которую уже захватил кто то.
– Вы пальчиком, Марья Генриховна, – сказал Ростов, – еще приятнее будет.
– Горячо! – сказала Марья Генриховна, краснея от удовольствия.
Ильин взял ведро с водой и, капнув туда рому, пришел к Марье Генриховне, прося помешать пальчиком.
– Это моя чашка, – говорил он. – Только вложите пальчик, все выпью.
Когда самовар весь выпили, Ростов взял карты и предложил играть в короли с Марьей Генриховной. Кинули жребий, кому составлять партию Марьи Генриховны. Правилами игры, по предложению Ростова, было то, чтобы тот, кто будет королем, имел право поцеловать ручку Марьи Генриховны, а чтобы тот, кто останется прохвостом, шел бы ставить новый самовар для доктора, когда он проснется.
– Ну, а ежели Марья Генриховна будет королем? – спросил Ильин.
– Она и так королева! И приказания ее – закон.
Только что началась игра, как из за Марьи Генриховны вдруг поднялась вспутанная голова доктора. Он давно уже не спал и прислушивался к тому, что говорилось, и, видимо, не находил ничего веселого, смешного или забавного во всем, что говорилось и делалось. Лицо его было грустно и уныло. Он не поздоровался с офицерами, почесался и попросил позволения выйти, так как ему загораживали дорогу. Как только он вышел, все офицеры разразились громким хохотом, а Марья Генриховна до слез покраснела и тем сделалась еще привлекательнее на глаза всех офицеров. Вернувшись со двора, доктор сказал жене (которая перестала уже так счастливо улыбаться и, испуганно ожидая приговора, смотрела на него), что дождь прошел и что надо идти ночевать в кибитку, а то все растащат.
– Да я вестового пошлю… двух! – сказал Ростов. – Полноте, доктор.
– Я сам стану на часы! – сказал Ильин.
– Нет, господа, вы выспались, а я две ночи не спал, – сказал доктор и мрачно сел подле жены, ожидая окончания игры.
Глядя на мрачное лицо доктора, косившегося на свою жену, офицерам стало еще веселей, и многие не могла удерживаться от смеха, которому они поспешно старались приискивать благовидные предлоги. Когда доктор ушел, уведя свою жену, и поместился с нею в кибиточку, офицеры улеглись в корчме, укрывшись мокрыми шинелями; но долго не спали, то переговариваясь, вспоминая испуг доктора и веселье докторши, то выбегая на крыльцо и сообщая о том, что делалось в кибиточке. Несколько раз Ростов, завертываясь с головой, хотел заснуть; но опять чье нибудь замечание развлекало его, опять начинался разговор, и опять раздавался беспричинный, веселый, детский хохот.


В третьем часу еще никто не заснул, как явился вахмистр с приказом выступать к местечку Островне.
Все с тем же говором и хохотом офицеры поспешно стали собираться; опять поставили самовар на грязной воде. Но Ростов, не дождавшись чаю, пошел к эскадрону. Уже светало; дождик перестал, тучи расходились. Было сыро и холодно, особенно в непросохшем платье. Выходя из корчмы, Ростов и Ильин оба в сумерках рассвета заглянули в глянцевитую от дождя кожаную докторскую кибиточку, из под фартука которой торчали ноги доктора и в середине которой виднелся на подушке чепчик докторши и слышалось сонное дыхание.
– Право, она очень мила! – сказал Ростов Ильину, выходившему с ним.
– Прелесть какая женщина! – с шестнадцатилетней серьезностью отвечал Ильин.
Через полчаса выстроенный эскадрон стоял на дороге. Послышалась команда: «Садись! – солдаты перекрестились и стали садиться. Ростов, выехав вперед, скомандовал: «Марш! – и, вытянувшись в четыре человека, гусары, звуча шлепаньем копыт по мокрой дороге, бренчаньем сабель и тихим говором, тронулись по большой, обсаженной березами дороге, вслед за шедшей впереди пехотой и батареей.
Разорванные сине лиловые тучи, краснея на восходе, быстро гнались ветром. Становилось все светлее и светлее. Ясно виднелась та курчавая травка, которая заседает всегда по проселочным дорогам, еще мокрая от вчерашнего дождя; висячие ветви берез, тоже мокрые, качались от ветра и роняли вбок от себя светлые капли. Яснее и яснее обозначались лица солдат. Ростов ехал с Ильиным, не отстававшим от него, стороной дороги, между двойным рядом берез.
Ростов в кампании позволял себе вольность ездить не на фронтовой лошади, а на казацкой. И знаток и охотник, он недавно достал себе лихую донскую, крупную и добрую игреневую лошадь, на которой никто не обскакивал его. Ехать на этой лошади было для Ростова наслаждение. Он думал о лошади, об утре, о докторше и ни разу не подумал о предстоящей опасности.
Прежде Ростов, идя в дело, боялся; теперь он не испытывал ни малейшего чувства страха. Не оттого он не боялся, что он привык к огню (к опасности нельзя привыкнуть), но оттого, что он выучился управлять своей душой перед опасностью. Он привык, идя в дело, думать обо всем, исключая того, что, казалось, было бы интереснее всего другого, – о предстоящей опасности. Сколько он ни старался, ни упрекал себя в трусости первое время своей службы, он не мог этого достигнуть; но с годами теперь это сделалось само собою. Он ехал теперь рядом с Ильиным между березами, изредка отрывая листья с веток, которые попадались под руку, иногда дотрогиваясь ногой до паха лошади, иногда отдавая, не поворачиваясь, докуренную трубку ехавшему сзади гусару, с таким спокойным и беззаботным видом, как будто он ехал кататься. Ему жалко было смотреть на взволнованное лицо Ильина, много и беспокойно говорившего; он по опыту знал то мучительное состояние ожидания страха и смерти, в котором находился корнет, и знал, что ничто, кроме времени, не поможет ему.
Только что солнце показалось на чистой полосе из под тучи, как ветер стих, как будто он не смел портить этого прелестного после грозы летнего утра; капли еще падали, но уже отвесно, – и все затихло. Солнце вышло совсем, показалось на горизонте и исчезло в узкой и длинной туче, стоявшей над ним. Через несколько минут солнце еще светлее показалось на верхнем крае тучи, разрывая ее края. Все засветилось и заблестело. И вместе с этим светом, как будто отвечая ему, раздались впереди выстрелы орудий.
Не успел еще Ростов обдумать и определить, как далеки эти выстрелы, как от Витебска прискакал адъютант графа Остермана Толстого с приказанием идти на рысях по дороге.
Эскадрон объехал пехоту и батарею, также торопившуюся идти скорее, спустился под гору и, пройдя через какую то пустую, без жителей, деревню, опять поднялся на гору. Лошади стали взмыливаться, люди раскраснелись.
– Стой, равняйся! – послышалась впереди команда дивизионера.
– Левое плечо вперед, шагом марш! – скомандовали впереди.
И гусары по линии войск прошли на левый фланг позиции и стали позади наших улан, стоявших в первой линии. Справа стояла наша пехота густой колонной – это были резервы; повыше ее на горе видны были на чистом чистом воздухе, в утреннем, косом и ярком, освещении, на самом горизонте, наши пушки. Впереди за лощиной видны были неприятельские колонны и пушки. В лощине слышна была наша цепь, уже вступившая в дело и весело перещелкивающаяся с неприятелем.
Ростову, как от звуков самой веселой музыки, стало весело на душе от этих звуков, давно уже не слышанных. Трап та та тап! – хлопали то вдруг, то быстро один за другим несколько выстрелов. Опять замолкло все, и опять как будто трескались хлопушки, по которым ходил кто то.
Гусары простояли около часу на одном месте. Началась и канонада. Граф Остерман с свитой проехал сзади эскадрона, остановившись, поговорил с командиром полка и отъехал к пушкам на гору.
Вслед за отъездом Остермана у улан послышалась команда:
– В колонну, к атаке стройся! – Пехота впереди их вздвоила взводы, чтобы пропустить кавалерию. Уланы тронулись, колеблясь флюгерами пик, и на рысях пошли под гору на французскую кавалерию, показавшуюся под горой влево.
Как только уланы сошли под гору, гусарам ведено было подвинуться в гору, в прикрытие к батарее. В то время как гусары становились на место улан, из цепи пролетели, визжа и свистя, далекие, непопадавшие пули.
Давно не слышанный этот звук еще радостнее и возбудительное подействовал на Ростова, чем прежние звуки стрельбы. Он, выпрямившись, разглядывал поле сражения, открывавшееся с горы, и всей душой участвовал в движении улан. Уланы близко налетели на французских драгун, что то спуталось там в дыму, и через пять минут уланы понеслись назад не к тому месту, где они стояли, но левее. Между оранжевыми уланами на рыжих лошадях и позади их, большой кучей, видны были синие французские драгуны на серых лошадях.


Ростов своим зорким охотничьим глазом один из первых увидал этих синих французских драгун, преследующих наших улан. Ближе, ближе подвигались расстроенными толпами уланы, и французские драгуны, преследующие их. Уже можно было видеть, как эти, казавшиеся под горой маленькими, люди сталкивались, нагоняли друг друга и махали руками или саблями.
Ростов, как на травлю, смотрел на то, что делалось перед ним. Он чутьем чувствовал, что ежели ударить теперь с гусарами на французских драгун, они не устоят; но ежели ударить, то надо было сейчас, сию минуту, иначе будет уже поздно. Он оглянулся вокруг себя. Ротмистр, стоя подле него, точно так же не спускал глаз с кавалерии внизу.
– Андрей Севастьяныч, – сказал Ростов, – ведь мы их сомнем…
– Лихая бы штука, – сказал ротмистр, – а в самом деле…
Ростов, не дослушав его, толкнул лошадь, выскакал вперед эскадрона, и не успел он еще скомандовать движение, как весь эскадрон, испытывавший то же, что и он, тронулся за ним. Ростов сам не знал, как и почему он это сделал. Все это он сделал, как он делал на охоте, не думая, не соображая. Он видел, что драгуны близко, что они скачут, расстроены; он знал, что они не выдержат, он знал, что была только одна минута, которая не воротится, ежели он упустит ее. Пули так возбудительно визжали и свистели вокруг него, лошадь так горячо просилась вперед, что он не мог выдержать. Он тронул лошадь, скомандовал и в то же мгновение, услыхав за собой звук топота своего развернутого эскадрона, на полных рысях, стал спускаться к драгунам под гору. Едва они сошли под гору, как невольно их аллюр рыси перешел в галоп, становившийся все быстрее и быстрее по мере того, как они приближались к своим уланам и скакавшим за ними французским драгунам. Драгуны были близко. Передние, увидав гусар, стали поворачивать назад, задние приостанавливаться. С чувством, с которым он несся наперерез волку, Ростов, выпустив во весь мах своего донца, скакал наперерез расстроенным рядам французских драгун. Один улан остановился, один пеший припал к земле, чтобы его не раздавили, одна лошадь без седока замешалась с гусарами. Почти все французские драгуны скакали назад. Ростов, выбрав себе одного из них на серой лошади, пустился за ним. По дороге он налетел на куст; добрая лошадь перенесла его через него, и, едва справясь на седле, Николай увидал, что он через несколько мгновений догонит того неприятеля, которого он выбрал своей целью. Француз этот, вероятно, офицер – по его мундиру, согнувшись, скакал на своей серой лошади, саблей подгоняя ее. Через мгновенье лошадь Ростова ударила грудью в зад лошади офицера, чуть не сбила ее с ног, и в то же мгновенье Ростов, сам не зная зачем, поднял саблю и ударил ею по французу.
В то же мгновение, как он сделал это, все оживление Ростова вдруг исчезло. Офицер упал не столько от удара саблей, который только слегка разрезал ему руку выше локтя, сколько от толчка лошади и от страха. Ростов, сдержав лошадь, отыскивал глазами своего врага, чтобы увидать, кого он победил. Драгунский французский офицер одной ногой прыгал на земле, другой зацепился в стремени. Он, испуганно щурясь, как будто ожидая всякую секунду нового удара, сморщившись, с выражением ужаса взглянул снизу вверх на Ростова. Лицо его, бледное и забрызганное грязью, белокурое, молодое, с дырочкой на подбородке и светлыми голубыми глазами, было самое не для поля сражения, не вражеское лицо, а самое простое комнатное лицо. Еще прежде, чем Ростов решил, что он с ним будет делать, офицер закричал: «Je me rends!» [Сдаюсь!] Он, торопясь, хотел и не мог выпутать из стремени ногу и, не спуская испуганных голубых глаз, смотрел на Ростова. Подскочившие гусары выпростали ему ногу и посадили его на седло. Гусары с разных сторон возились с драгунами: один был ранен, но, с лицом в крови, не давал своей лошади; другой, обняв гусара, сидел на крупе его лошади; третий взлеаал, поддерживаемый гусаром, на его лошадь. Впереди бежала, стреляя, французская пехота. Гусары торопливо поскакали назад с своими пленными. Ростов скакал назад с другими, испытывая какое то неприятное чувство, сжимавшее ему сердце. Что то неясное, запутанное, чего он никак не мог объяснить себе, открылось ему взятием в плен этого офицера и тем ударом, который он нанес ему.
Граф Остерман Толстой встретил возвращавшихся гусар, подозвал Ростова, благодарил его и сказал, что он представит государю о его молодецком поступке и будет просить для него Георгиевский крест. Когда Ростова потребовали к графу Остерману, он, вспомнив о том, что атака его была начата без приказанья, был вполне убежден, что начальник требует его для того, чтобы наказать его за самовольный поступок. Поэтому лестные слова Остермана и обещание награды должны бы были тем радостнее поразить Ростова; но все то же неприятное, неясное чувство нравственно тошнило ему. «Да что бишь меня мучает? – спросил он себя, отъезжая от генерала. – Ильин? Нет, он цел. Осрамился я чем нибудь? Нет. Все не то! – Что то другое мучило его, как раскаяние. – Да, да, этот французский офицер с дырочкой. И я хорошо помню, как рука моя остановилась, когда я поднял ее».
Ростов увидал отвозимых пленных и поскакал за ними, чтобы посмотреть своего француза с дырочкой на подбородке. Он в своем странном мундире сидел на заводной гусарской лошади и беспокойно оглядывался вокруг себя. Рана его на руке была почти не рана. Он притворно улыбнулся Ростову и помахал ему рукой, в виде приветствия. Ростову все так же было неловко и чего то совестно.
Весь этот и следующий день друзья и товарищи Ростова замечали, что он не скучен, не сердит, но молчалив, задумчив и сосредоточен. Он неохотно пил, старался оставаться один и о чем то все думал.
Ростов все думал об этом своем блестящем подвиге, который, к удивлению его, приобрел ему Георгиевский крест и даже сделал ему репутацию храбреца, – и никак не мог понять чего то. «Так и они еще больше нашего боятся! – думал он. – Так только то и есть всего, то, что называется геройством? И разве я это делал для отечества? И в чем он виноват с своей дырочкой и голубыми глазами? А как он испугался! Он думал, что я убью его. За что ж мне убивать его? У меня рука дрогнула. А мне дали Георгиевский крест. Ничего, ничего не понимаю!»
Но пока Николай перерабатывал в себе эти вопросы и все таки не дал себе ясного отчета в том, что так смутило его, колесо счастья по службе, как это часто бывает, повернулось в его пользу. Его выдвинули вперед после Островненского дела, дали ему батальон гусаров и, когда нужно было употребить храброго офицера, давали ему поручения.


Получив известие о болезни Наташи, графиня, еще не совсем здоровая и слабая, с Петей и со всем домом приехала в Москву, и все семейство Ростовых перебралось от Марьи Дмитриевны в свой дом и совсем поселилось в Москве.
Болезнь Наташи была так серьезна, что, к счастию ее и к счастию родных, мысль о всем том, что было причиной ее болезни, ее поступок и разрыв с женихом перешли на второй план. Она была так больна, что нельзя было думать о том, насколько она была виновата во всем случившемся, тогда как она не ела, не спала, заметно худела, кашляла и была, как давали чувствовать доктора, в опасности. Надо было думать только о том, чтобы помочь ей. Доктора ездили к Наташе и отдельно и консилиумами, говорили много по французски, по немецки и по латыни, осуждали один другого, прописывали самые разнообразные лекарства от всех им известных болезней; но ни одному из них не приходила в голову та простая мысль, что им не может быть известна та болезнь, которой страдала Наташа, как не может быть известна ни одна болезнь, которой одержим живой человек: ибо каждый живой человек имеет свои особенности и всегда имеет особенную и свою новую, сложную, неизвестную медицине болезнь, не болезнь легких, печени, кожи, сердца, нервов и т. д., записанных в медицине, но болезнь, состоящую из одного из бесчисленных соединений в страданиях этих органов. Эта простая мысль не могла приходить докторам (так же, как не может прийти колдуну мысль, что он не может колдовать) потому, что их дело жизни состояло в том, чтобы лечить, потому, что за то они получали деньги, и потому, что на это дело они потратили лучшие годы своей жизни. Но главное – мысль эта не могла прийти докторам потому, что они видели, что они несомненно полезны, и были действительно полезны для всех домашних Ростовых. Они были полезны не потому, что заставляли проглатывать больную большей частью вредные вещества (вред этот был мало чувствителен, потому что вредные вещества давались в малом количестве), но они полезны, необходимы, неизбежны были (причина – почему всегда есть и будут мнимые излечители, ворожеи, гомеопаты и аллопаты) потому, что они удовлетворяли нравственной потребности больной и людей, любящих больную. Они удовлетворяли той вечной человеческой потребности надежды на облегчение, потребности сочувствия и деятельности, которые испытывает человек во время страдания. Они удовлетворяли той вечной, человеческой – заметной в ребенке в самой первобытной форме – потребности потереть то место, которое ушиблено. Ребенок убьется и тотчас же бежит в руки матери, няньки для того, чтобы ему поцеловали и потерли больное место, и ему делается легче, когда больное место потрут или поцелуют. Ребенок не верит, чтобы у сильнейших и мудрейших его не было средств помочь его боли. И надежда на облегчение и выражение сочувствия в то время, как мать трет его шишку, утешают его. Доктора для Наташи были полезны тем, что они целовали и терли бобо, уверяя, что сейчас пройдет, ежели кучер съездит в арбатскую аптеку и возьмет на рубль семь гривен порошков и пилюль в хорошенькой коробочке и ежели порошки эти непременно через два часа, никак не больше и не меньше, будет в отварной воде принимать больная.
Что же бы делали Соня, граф и графиня, как бы они смотрели на слабую, тающую Наташу, ничего не предпринимая, ежели бы не было этих пилюль по часам, питья тепленького, куриной котлетки и всех подробностей жизни, предписанных доктором, соблюдать которые составляло занятие и утешение для окружающих? Чем строже и сложнее были эти правила, тем утешительнее было для окружающих дело. Как бы переносил граф болезнь своей любимой дочери, ежели бы он не знал, что ему стоила тысячи рублей болезнь Наташи и что он не пожалеет еще тысяч, чтобы сделать ей пользу: ежели бы он не знал, что, ежели она не поправится, он не пожалеет еще тысяч и повезет ее за границу и там сделает консилиумы; ежели бы он не имел возможности рассказывать подробности о том, как Метивье и Феллер не поняли, а Фриз понял, и Мудров еще лучше определил болезнь? Что бы делала графиня, ежели бы она не могла иногда ссориться с больной Наташей за то, что она не вполне соблюдает предписаний доктора?
– Эдак никогда не выздоровеешь, – говорила она, за досадой забывая свое горе, – ежели ты не будешь слушаться доктора и не вовремя принимать лекарство! Ведь нельзя шутить этим, когда у тебя может сделаться пневмония, – говорила графиня, и в произношении этого непонятного не для нее одной слова, она уже находила большое утешение. Что бы делала Соня, ежели бы у ней не было радостного сознания того, что она не раздевалась три ночи первое время для того, чтобы быть наготове исполнять в точности все предписания доктора, и что она теперь не спит ночи, для того чтобы не пропустить часы, в которые надо давать маловредные пилюли из золотой коробочки? Даже самой Наташе, которая хотя и говорила, что никакие лекарства не вылечат ее и что все это глупости, – и ей было радостно видеть, что для нее делали так много пожертвований, что ей надо было в известные часы принимать лекарства, и даже ей радостно было то, что она, пренебрегая исполнением предписанного, могла показывать, что она не верит в лечение и не дорожит своей жизнью.
Доктор ездил каждый день, щупал пульс, смотрел язык и, не обращая внимания на ее убитое лицо, шутил с ней. Но зато, когда он выходил в другую комнату, графиня поспешно выходила за ним, и он, принимая серьезный вид и покачивая задумчиво головой, говорил, что, хотя и есть опасность, он надеется на действие этого последнего лекарства, и что надо ждать и посмотреть; что болезнь больше нравственная, но…
Графиня, стараясь скрыть этот поступок от себя и от доктора, всовывала ему в руку золотой и всякий раз с успокоенным сердцем возвращалась к больной.
Признаки болезни Наташи состояли в том, что она мало ела, мало спала, кашляла и никогда не оживлялась. Доктора говорили, что больную нельзя оставлять без медицинской помощи, и поэтому в душном воздухе держали ее в городе. И лето 1812 года Ростовы не уезжали в деревню.
Несмотря на большое количество проглоченных пилюль, капель и порошков из баночек и коробочек, из которых madame Schoss, охотница до этих вещиц, собрала большую коллекцию, несмотря на отсутствие привычной деревенской жизни, молодость брала свое: горе Наташи начало покрываться слоем впечатлений прожитой жизни, оно перестало такой мучительной болью лежать ей на сердце, начинало становиться прошедшим, и Наташа стала физически оправляться.


Наташа была спокойнее, но не веселее. Она не только избегала всех внешних условий радости: балов, катанья, концертов, театра; но она ни разу не смеялась так, чтобы из за смеха ее не слышны были слезы. Она не могла петь. Как только начинала она смеяться или пробовала одна сама с собой петь, слезы душили ее: слезы раскаяния, слезы воспоминаний о том невозвратном, чистом времени; слезы досады, что так, задаром, погубила она свою молодую жизнь, которая могла бы быть так счастлива. Смех и пение особенно казались ей кощунством над ее горем. О кокетстве она и не думала ни раза; ей не приходилось даже воздерживаться. Она говорила и чувствовала, что в это время все мужчины были для нее совершенно то же, что шут Настасья Ивановна. Внутренний страж твердо воспрещал ей всякую радость. Да и не было в ней всех прежних интересов жизни из того девичьего, беззаботного, полного надежд склада жизни. Чаще и болезненнее всего вспоминала она осенние месяцы, охоту, дядюшку и святки, проведенные с Nicolas в Отрадном. Что бы она дала, чтобы возвратить хоть один день из того времени! Но уж это навсегда было кончено. Предчувствие не обманывало ее тогда, что то состояние свободы и открытости для всех радостей никогда уже не возвратится больше. Но жить надо было.
Ей отрадно было думать, что она не лучше, как она прежде думала, а хуже и гораздо хуже всех, всех, кто только есть на свете. Но этого мало было. Она знала это и спрашивала себя: «Что ж дальше?А дальше ничего не было. Не было никакой радости в жизни, а жизнь проходила. Наташа, видимо, старалась только никому не быть в тягость и никому не мешать, но для себя ей ничего не нужно было. Она удалялась от всех домашних, и только с братом Петей ей было легко. С ним она любила бывать больше, чем с другими; и иногда, когда была с ним с глазу на глаз, смеялась. Она почти не выезжала из дому и из приезжавших к ним рада была только одному Пьеру. Нельзя было нежнее, осторожнее и вместе с тем серьезнее обращаться, чем обращался с нею граф Безухов. Наташа Осссознательно чувствовала эту нежность обращения и потому находила большое удовольствие в его обществе. Но она даже не была благодарна ему за его нежность; ничто хорошее со стороны Пьера не казалось ей усилием. Пьеру, казалось, так естественно быть добрым со всеми, что не было никакой заслуги в его доброте. Иногда Наташа замечала смущение и неловкость Пьера в ее присутствии, в особенности, когда он хотел сделать для нее что нибудь приятное или когда он боялся, чтобы что нибудь в разговоре не навело Наташу на тяжелые воспоминания. Она замечала это и приписывала это его общей доброте и застенчивости, которая, по ее понятиям, таковая же, как с нею, должна была быть и со всеми. После тех нечаянных слов о том, что, ежели бы он был свободен, он на коленях бы просил ее руки и любви, сказанных в минуту такого сильного волнения для нее, Пьер никогда не говорил ничего о своих чувствах к Наташе; и для нее было очевидно, что те слова, тогда так утешившие ее, были сказаны, как говорятся всякие бессмысленные слова для утешения плачущего ребенка. Не оттого, что Пьер был женатый человек, но оттого, что Наташа чувствовала между собою и им в высшей степени ту силу нравственных преград – отсутствие которой она чувствовала с Kyрагиным, – ей никогда в голову не приходило, чтобы из ее отношений с Пьером могла выйти не только любовь с ее или, еще менее, с его стороны, но даже и тот род нежной, признающей себя, поэтической дружбы между мужчиной и женщиной, которой она знала несколько примеров.
В конце Петровского поста Аграфена Ивановна Белова, отрадненская соседка Ростовых, приехала в Москву поклониться московским угодникам. Она предложила Наташе говеть, и Наташа с радостью ухватилась за эту мысль. Несмотря на запрещение доктора выходить рано утром, Наташа настояла на том, чтобы говеть, и говеть не так, как говели обыкновенно в доме Ростовых, то есть отслушать на дому три службы, а чтобы говеть так, как говела Аграфена Ивановна, то есть всю неделю, не пропуская ни одной вечерни, обедни или заутрени.
Графине понравилось это усердие Наташи; она в душе своей, после безуспешного медицинского лечения, надеялась, что молитва поможет ей больше лекарств, и хотя со страхом и скрывая от доктора, но согласилась на желание Наташи и поручила ее Беловой. Аграфена Ивановна в три часа ночи приходила будить Наташу и большей частью находила ее уже не спящею. Наташа боялась проспать время заутрени. Поспешно умываясь и с смирением одеваясь в самое дурное свое платье и старенькую мантилью, содрогаясь от свежести, Наташа выходила на пустынные улицы, прозрачно освещенные утренней зарей. По совету Аграфены Ивановны, Наташа говела не в своем приходе, а в церкви, в которой, по словам набожной Беловой, был священник весьма строгий и высокой жизни. В церкви всегда было мало народа; Наташа с Беловой становились на привычное место перед иконой божией матери, вделанной в зад левого клироса, и новое для Наташи чувство смирения перед великим, непостижимым, охватывало ее, когда она в этот непривычный час утра, глядя на черный лик божией матери, освещенный и свечами, горевшими перед ним, и светом утра, падавшим из окна, слушала звуки службы, за которыми она старалась следить, понимая их. Когда она понимала их, ее личное чувство с своими оттенками присоединялось к ее молитве; когда она не понимала, ей еще сладостнее было думать, что желание понимать все есть гордость, что понимать всего нельзя, что надо только верить и отдаваться богу, который в эти минуты – она чувствовала – управлял ее душою. Она крестилась, кланялась и, когда не понимала, то только, ужасаясь перед своею мерзостью, просила бога простить ее за все, за все, и помиловать. Молитвы, которым она больше всего отдавалась, были молитвы раскаяния. Возвращаясь домой в ранний час утра, когда встречались только каменщики, шедшие на работу, дворники, выметавшие улицу, и в домах еще все спали, Наташа испытывала новое для нее чувство возможности исправления себя от своих пороков и возможности новой, чистой жизни и счастия.
В продолжение всей недели, в которую она вела эту жизнь, чувство это росло с каждым днем. И счастье приобщиться или сообщиться, как, радостно играя этим словом, говорила ей Аграфена Ивановна, представлялось ей столь великим, что ей казалось, что она не доживет до этого блаженного воскресенья.
Но счастливый день наступил, и когда Наташа в это памятное для нее воскресенье, в белом кисейном платье, вернулась от причастия, она в первый раз после многих месяцев почувствовала себя спокойной и не тяготящеюся жизнью, которая предстояла ей.
Приезжавший в этот день доктор осмотрел Наташу и велел продолжать те последние порошки, которые он прописал две недели тому назад.
– Непременно продолжать – утром и вечером, – сказал он, видимо, сам добросовестно довольный своим успехом. – Только, пожалуйста, аккуратнее. Будьте покойны, графиня, – сказал шутливо доктор, в мякоть руки ловко подхватывая золотой, – скоро опять запоет и зарезвится. Очень, очень ей в пользу последнее лекарство. Она очень посвежела.
Графиня посмотрела на ногти и поплевала, с веселым лицом возвращаясь в гостиную.


В начале июля в Москве распространялись все более и более тревожные слухи о ходе войны: говорили о воззвании государя к народу, о приезде самого государя из армии в Москву. И так как до 11 го июля манифест и воззвание не были получены, то о них и о положении России ходили преувеличенные слухи. Говорили, что государь уезжает потому, что армия в опасности, говорили, что Смоленск сдан, что у Наполеона миллион войска и что только чудо может спасти Россию.
11 го июля, в субботу, был получен манифест, но еще не напечатан; и Пьер, бывший у Ростовых, обещал на другой день, в воскресенье, приехать обедать и привезти манифест и воззвание, которые он достанет у графа Растопчина.
В это воскресенье Ростовы, по обыкновению, поехали к обедне в домовую церковь Разумовских. Был жаркий июльский день. Уже в десять часов, когда Ростовы выходили из кареты перед церковью, в жарком воздухе, в криках разносчиков, в ярких и светлых летних платьях толпы, в запыленных листьях дерев бульвара, в звуках музыки и белых панталонах прошедшего на развод батальона, в громе мостовой и ярком блеске жаркого солнца было то летнее томление, довольство и недовольство настоящим, которое особенно резко чувствуется в ясный жаркий день в городе. В церкви Разумовских была вся знать московская, все знакомые Ростовых (в этот год, как бы ожидая чего то, очень много богатых семей, обыкновенно разъезжающихся по деревням, остались в городе). Проходя позади ливрейного лакея, раздвигавшего толпу подле матери, Наташа услыхала голос молодого человека, слишком громким шепотом говорившего о ней:
– Это Ростова, та самая…
– Как похудела, а все таки хороша!
Она слышала, или ей показалось, что были упомянуты имена Курагина и Болконского. Впрочем, ей всегда это казалось. Ей всегда казалось, что все, глядя на нее, только и думают о том, что с ней случилось. Страдая и замирая в душе, как всегда в толпе, Наташа шла в своем лиловом шелковом с черными кружевами платье так, как умеют ходить женщины, – тем спокойнее и величавее, чем больнее и стыднее у ней было на душе. Она знала и не ошибалась, что она хороша, но это теперь не радовало ее, как прежде. Напротив, это мучило ее больше всего в последнее время и в особенности в этот яркий, жаркий летний день в городе. «Еще воскресенье, еще неделя, – говорила она себе, вспоминая, как она была тут в то воскресенье, – и все та же жизнь без жизни, и все те же условия, в которых так легко бывало жить прежде. Хороша, молода, и я знаю, что теперь добра, прежде я была дурная, а теперь я добра, я знаю, – думала она, – а так даром, ни для кого, проходят лучшие годы». Она стала подле матери и перекинулась с близко стоявшими знакомыми. Наташа по привычке рассмотрела туалеты дам, осудила tenue [манеру держаться] и неприличный способ креститься рукой на малом пространстве одной близко стоявшей дамы, опять с досадой подумала о том, что про нее судят, что и она судит, и вдруг, услыхав звуки службы, ужаснулась своей мерзости, ужаснулась тому, что прежняя чистота опять потеряна ею.
Благообразный, тихий старичок служил с той кроткой торжественностью, которая так величаво, успокоительно действует на души молящихся. Царские двери затворились, медленно задернулась завеса; таинственный тихий голос произнес что то оттуда. Непонятные для нее самой слезы стояли в груди Наташи, и радостное и томительное чувство волновало ее.
«Научи меня, что мне делать, как мне исправиться навсегда, навсегда, как мне быть с моей жизнью… – думала она.
Дьякон вышел на амвон, выправил, широко отставив большой палец, длинные волосы из под стихаря и, положив на груди крест, громко и торжественно стал читать слова молитвы:
– «Миром господу помолимся».
«Миром, – все вместе, без различия сословий, без вражды, а соединенные братской любовью – будем молиться», – думала Наташа.
– О свышнем мире и о спасении душ наших!
«О мире ангелов и душ всех бестелесных существ, которые живут над нами», – молилась Наташа.
Когда молились за воинство, она вспомнила брата и Денисова. Когда молились за плавающих и путешествующих, она вспомнила князя Андрея и молилась за него, и молилась за то, чтобы бог простил ей то зло, которое она ему сделала. Когда молились за любящих нас, она молилась о своих домашних, об отце, матери, Соне, в первый раз теперь понимая всю свою вину перед ними и чувствуя всю силу своей любви к ним. Когда молились о ненавидящих нас, она придумала себе врагов и ненавидящих для того, чтобы молиться за них. Она причисляла к врагам кредиторов и всех тех, которые имели дело с ее отцом, и всякий раз, при мысли о врагах и ненавидящих, она вспоминала Анатоля, сделавшего ей столько зла, и хотя он не был ненавидящий, она радостно молилась за него как за врага. Только на молитве она чувствовала себя в силах ясно и спокойно вспоминать и о князе Андрее, и об Анатоле, как об людях, к которым чувства ее уничтожались в сравнении с ее чувством страха и благоговения к богу. Когда молились за царскую фамилию и за Синод, она особенно низко кланялась и крестилась, говоря себе, что, ежели она не понимает, она не может сомневаться и все таки любит правительствующий Синод и молится за него.
Окончив ектенью, дьякон перекрестил вокруг груди орарь и произнес:
– «Сами себя и живот наш Христу богу предадим».
«Сами себя богу предадим, – повторила в своей душе Наташа. – Боже мой, предаю себя твоей воле, – думала она. – Ничего не хочу, не желаю; научи меня, что мне делать, куда употребить свою волю! Да возьми же меня, возьми меня! – с умиленным нетерпением в душе говорила Наташа, не крестясь, опустив свои тонкие руки и как будто ожидая, что вот вот невидимая сила возьмет ее и избавит от себя, от своих сожалений, желаний, укоров, надежд и пороков.
Графиня несколько раз во время службы оглядывалась на умиленное, с блестящими глазами, лицо своей дочери и молилась богу о том, чтобы он помог ей.
Неожиданно, в середине и не в порядке службы, который Наташа хорошо знала, дьячок вынес скамеечку, ту самую, на которой читались коленопреклоненные молитвы в троицын день, и поставил ее перед царскими дверьми. Священник вышел в своей лиловой бархатной скуфье, оправил волосы и с усилием стал на колена. Все сделали то же и с недоумением смотрели друг на друга. Это была молитва, только что полученная из Синода, молитва о спасении России от вражеского нашествия.
– «Господи боже сил, боже спасения нашего, – начал священник тем ясным, ненапыщенным и кротким голосом, которым читают только одни духовные славянские чтецы и который так неотразимо действует на русское сердце. – Господи боже сил, боже спасения нашего! Призри ныне в милости и щедротах на смиренные люди твоя, и человеколюбно услыши, и пощади, и помилуй нас. Се враг смущаяй землю твою и хотяй положити вселенную всю пусту, восста на ны; се людие беззаконии собрашася, еже погубити достояние твое, разорити честный Иерусалим твой, возлюбленную тебе Россию: осквернити храмы твои, раскопати алтари и поругатися святыне нашей. Доколе, господи, доколе грешницы восхвалятся? Доколе употребляти имать законопреступный власть?
Владыко господи! Услыши нас, молящихся тебе: укрепи силою твоею благочестивейшего, самодержавнейшего великого государя нашего императора Александра Павловича; помяни правду его и кротость, воздаждь ему по благости его, ею же хранит ны, твой возлюбленный Израиль. Благослови его советы, начинания и дела; утверди всемогущною твоею десницею царство его и подаждь ему победу на врага, яко же Моисею на Амалика, Гедеону на Мадиама и Давиду на Голиафа. Сохрани воинство его; положи лук медян мышцам, во имя твое ополчившихся, и препояши их силою на брань. Приими оружие и щит, и восстани в помощь нашу, да постыдятся и посрамятся мыслящий нам злая, да будут пред лицем верного ти воинства, яко прах пред лицем ветра, и ангел твой сильный да будет оскорбляяй и погоняяй их; да приидет им сеть, юже не сведают, и их ловитва, юже сокрыша, да обымет их; да падут под ногами рабов твоих и в попрание воем нашим да будут. Господи! не изнеможет у тебе спасати во многих и в малых; ты еси бог, да не превозможет противу тебе человек.
Боже отец наших! Помяни щедроты твоя и милости, яже от века суть: не отвержи нас от лица твоего, ниже возгнушайся недостоинством нашим, но помилуй нас по велицей милости твоей и по множеству щедрот твоих презри беззакония и грехи наша. Сердце чисто созижди в нас, и дух прав обнови во утробе нашей; всех нас укрепи верою в тя, утверди надеждою, одушеви истинною друг ко другу любовию, вооружи единодушием на праведное защищение одержания, еже дал еси нам и отцем нашим, да не вознесется жезл нечестивых на жребий освященных.
Господи боже наш, в него же веруем и на него же уповаем, не посрами нас от чаяния милости твоея и сотвори знамение во благо, яко да видят ненавидящий нас и православную веру нашу, и посрамятся и погибнут; и да уведят все страны, яко имя тебе господь, и мы людие твои. Яви нам, господи, ныне милость твою и спасение твое даждь нам; возвесели сердце рабов твоих о милости твоей; порази враги наши, и сокруши их под ноги верных твоих вскоре. Ты бо еси заступление, помощь и победа уповающим на тя, и тебе славу воссылаем, отцу и сыну и святому духу и ныне, и присно, и во веки веков. Аминь».
В том состоянии раскрытости душевной, в котором находилась Наташа, эта молитва сильно подействовала на нее. Она слушала каждое слово о победе Моисея на Амалика, и Гедеона на Мадиама, и Давида на Голиафа, и о разорении Иерусалима твоего и просила бога с той нежностью и размягченностью, которою было переполнено ее сердце; но не понимала хорошенько, о чем она просила бога в этой молитве. Она всей душой участвовала в прошении о духе правом, об укреплении сердца верою, надеждою и о воодушевлении их любовью. Но она не могла молиться о попрании под ноги врагов своих, когда она за несколько минут перед этим только желала иметь их больше, чтобы любить их, молиться за них. Но она тоже не могла сомневаться в правоте читаемой колено преклонной молитвы. Она ощущала в душе своей благоговейный и трепетный ужас перед наказанием, постигшим людей за их грехи, и в особенности за свои грехи, и просила бога о том, чтобы он простил их всех и ее и дал бы им всем и ей спокойствия и счастия в жизни. И ей казалось, что бог слышит ее молитву.


С того дня, как Пьер, уезжая от Ростовых и вспоминая благодарный взгляд Наташи, смотрел на комету, стоявшую на небе, и почувствовал, что для него открылось что то новое, – вечно мучивший его вопрос о тщете и безумности всего земного перестал представляться ему. Этот страшный вопрос: зачем? к чему? – который прежде представлялся ему в середине всякого занятия, теперь заменился для него не другим вопросом и не ответом на прежний вопрос, а представлением ее. Слышал ли он, и сам ли вел ничтожные разговоры, читал ли он, или узнавал про подлость и бессмысленность людскую, он не ужасался, как прежде; не спрашивал себя, из чего хлопочут люди, когда все так кратко и неизвестно, но вспоминал ее в том виде, в котором он видел ее в последний раз, и все сомнения его исчезали, не потому, что она отвечала на вопросы, которые представлялись ему, но потому, что представление о ней переносило его мгновенно в другую, светлую область душевной деятельности, в которой не могло быть правого или виноватого, в область красоты и любви, для которой стоило жить. Какая бы мерзость житейская ни представлялась ему, он говорил себе:
«Ну и пускай такой то обокрал государство и царя, а государство и царь воздают ему почести; а она вчера улыбнулась мне и просила приехать, и я люблю ее, и никто никогда не узнает этого», – думал он.
Пьер все так же ездил в общество, так же много пил и вел ту же праздную и рассеянную жизнь, потому что, кроме тех часов, которые он проводил у Ростовых, надо было проводить и остальное время, и привычки и знакомства, сделанные им в Москве, непреодолимо влекли его к той жизни, которая захватила его. Но в последнее время, когда с театра войны приходили все более и более тревожные слухи и когда здоровье Наташи стало поправляться и она перестала возбуждать в нем прежнее чувство бережливой жалости, им стало овладевать более и более непонятное для него беспокойство. Он чувствовал, что то положение, в котором он находился, не могло продолжаться долго, что наступает катастрофа, долженствующая изменить всю его жизнь, и с нетерпением отыскивал во всем признаки этой приближающейся катастрофы. Пьеру было открыто одним из братьев масонов следующее, выведенное из Апокалипсиса Иоанна Богослова, пророчество относительно Наполеона.
В Апокалипсисе, главе тринадцатой, стихе восемнадцатом сказано: «Зде мудрость есть; иже имать ум да почтет число зверино: число бо человеческо есть и число его шестьсот шестьдесят шесть».
И той же главы в стихе пятом: «И даны быта ему уста глаголюща велика и хульна; и дана бысть ему область творити месяц четыре – десять два».
Французские буквы, подобно еврейскому число изображению, по которому первыми десятью буквами означаются единицы, а прочими десятки, имеют следующее значение:
a b c d e f g h i k.. l..m..n..o..p..q..r..s..t.. u…v w.. x.. y.. z
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
Написав по этой азбуке цифрами слова L'empereur Napoleon [император Наполеон], выходит, что сумма этих чисел равна 666 ти и что поэтому Наполеон есть тот зверь, о котором предсказано в Апокалипсисе. Кроме того, написав по этой же азбуке слова quarante deux [сорок два], то есть предел, который был положен зверю глаголати велика и хульна, сумма этих чисел, изображающих quarante deux, опять равна 666 ти, из чего выходит, что предел власти Наполеона наступил в 1812 м году, в котором французскому императору минуло 42 года. Предсказание это очень поразило Пьера, и он часто задавал себе вопрос о том, что именно положит предел власти зверя, то есть Наполеона, и, на основании тех же изображений слов цифрами и вычислениями, старался найти ответ на занимавший его вопрос. Пьер написал в ответе на этот вопрос: L'empereur Alexandre? La nation Russe? [Император Александр? Русский народ?] Он счел буквы, но сумма цифр выходила гораздо больше или меньше 666 ти. Один раз, занимаясь этими вычислениями, он написал свое имя – Comte Pierre Besouhoff; сумма цифр тоже далеко не вышла. Он, изменив орфографию, поставив z вместо s, прибавил de, прибавил article le и все не получал желаемого результата. Тогда ему пришло в голову, что ежели бы ответ на искомый вопрос и заключался в его имени, то в ответе непременно была бы названа его национальность. Он написал Le Russe Besuhoff и, сочтя цифры, получил 671. Только 5 было лишних; 5 означает «е», то самое «е», которое было откинуто в article перед словом L'empereur. Откинув точно так же, хотя и неправильно, «е», Пьер получил искомый ответ; L'Russe Besuhof, равное 666 ти. Открытие это взволновало его. Как, какой связью был он соединен с тем великим событием, которое было предсказано в Апокалипсисе, он не знал; но он ни на минуту не усумнился в этой связи. Его любовь к Ростовой, антихрист, нашествие Наполеона, комета, 666, l'empereur Napoleon и l'Russe Besuhof – все это вместе должно было созреть, разразиться и вывести его из того заколдованного, ничтожного мира московских привычек, в которых, он чувствовал себя плененным, и привести его к великому подвигу и великому счастию.
Пьер накануне того воскресенья, в которое читали молитву, обещал Ростовым привезти им от графа Растопчина, с которым он был хорошо знаком, и воззвание к России, и последние известия из армии. Поутру, заехав к графу Растопчину, Пьер у него застал только что приехавшего курьера из армии.
Курьер был один из знакомых Пьеру московских бальных танцоров.
– Ради бога, не можете ли вы меня облегчить? – сказал курьер, – у меня полна сумка писем к родителям.
В числе этих писем было письмо от Николая Ростова к отцу. Пьер взял это письмо. Кроме того, граф Растопчин дал Пьеру воззвание государя к Москве, только что отпечатанное, последние приказы по армии и свою последнюю афишу. Просмотрев приказы по армии, Пьер нашел в одном из них между известиями о раненых, убитых и награжденных имя Николая Ростова, награжденного Георгием 4 й степени за оказанную храбрость в Островненском деле, и в том же приказе назначение князя Андрея Болконского командиром егерского полка. Хотя ему и не хотелось напоминать Ростовым о Болконском, но Пьер не мог воздержаться от желания порадовать их известием о награждении сына и, оставив у себя воззвание, афишу и другие приказы, с тем чтобы самому привезти их к обеду, послал печатный приказ и письмо к Ростовым.
Разговор с графом Растопчиным, его тон озабоченности и поспешности, встреча с курьером, беззаботно рассказывавшим о том, как дурно идут дела в армии, слухи о найденных в Москве шпионах, о бумаге, ходящей по Москве, в которой сказано, что Наполеон до осени обещает быть в обеих русских столицах, разговор об ожидаемом назавтра приезде государя – все это с новой силой возбуждало в Пьере то чувство волнения и ожидания, которое не оставляло его со времени появления кометы и в особенности с начала войны.
Пьеру давно уже приходила мысль поступить в военную службу, и он бы исполнил ее, ежели бы не мешала ему, во первых, принадлежность его к тому масонскому обществу, с которым он был связан клятвой и которое проповедывало вечный мир и уничтожение войны, и, во вторых, то, что ему, глядя на большое количество москвичей, надевших мундиры и проповедывающих патриотизм, было почему то совестно предпринять такой шаг. Главная же причина, по которой он не приводил в исполнение своего намерения поступить в военную службу, состояла в том неясном представлении, что он l'Russe Besuhof, имеющий значение звериного числа 666, что его участие в великом деле положения предела власти зверю, глаголящему велика и хульна, определено предвечно и что поэтому ему не должно предпринимать ничего и ждать того, что должно совершиться.


У Ростовых, как и всегда по воскресениям, обедал кое кто из близких знакомых.
Пьер приехал раньше, чтобы застать их одних.
Пьер за этот год так потолстел, что он был бы уродлив, ежели бы он не был так велик ростом, крупен членами и не был так силен, что, очевидно, легко носил свою толщину.
Он, пыхтя и что то бормоча про себя, вошел на лестницу. Кучер его уже не спрашивал, дожидаться ли. Он знал, что когда граф у Ростовых, то до двенадцатого часу. Лакеи Ростовых радостно бросились снимать с него плащ и принимать палку и шляпу. Пьер, по привычке клубной, и палку и шляпу оставлял в передней.
Первое лицо, которое он увидал у Ростовых, была Наташа. Еще прежде, чем он увидал ее, он, снимая плащ в передней, услыхал ее. Она пела солфеджи в зале. Он внал, что она не пела со времени своей болезни, и потому звук ее голоса удивил и обрадовал его. Он тихо отворил дверь и увидал Наташу в ее лиловом платье, в котором она была у обедни, прохаживающуюся по комнате и поющую. Она шла задом к нему, когда он отворил дверь, но когда она круто повернулась и увидала его толстое, удивленное лицо, она покраснела и быстро подошла к нему.
– Я хочу попробовать опять петь, – сказала она. – Все таки это занятие, – прибавила она, как будто извиняясь.
– И прекрасно.
– Как я рада, что вы приехали! Я нынче так счастлива! – сказала она с тем прежним оживлением, которого уже давно не видел в ней Пьер. – Вы знаете, Nicolas получил Георгиевский крест. Я так горда за него.
– Как же, я прислал приказ. Ну, я вам не хочу мешать, – прибавил он и хотел пройти в гостиную.
Наташа остановила его.
– Граф, что это, дурно, что я пою? – сказала она, покраснев, но, не спуская глаз, вопросительно глядя на Пьера.
– Нет… Отчего же? Напротив… Но отчего вы меня спрашиваете?
– Я сама не знаю, – быстро отвечала Наташа, – но я ничего бы не хотела сделать, что бы вам не нравилось. Я вам верю во всем. Вы не знаете, как вы для меля важны и как вы много для меня сделали!.. – Она говорила быстро и не замечая того, как Пьер покраснел при этих словах. – Я видела в том же приказе он, Болконский (быстро, шепотом проговорила она это слово), он в России и опять служит. Как вы думаете, – сказала она быстро, видимо, торопясь говорить, потому что она боялась за свои силы, – простит он меня когда нибудь? Не будет он иметь против меня злого чувства? Как вы думаете? Как вы думаете?
– Я думаю… – сказал Пьер. – Ему нечего прощать… Ежели бы я был на его месте… – По связи воспоминаний, Пьер мгновенно перенесся воображением к тому времени, когда он, утешая ее, сказал ей, что ежели бы он был не он, а лучший человек в мире и свободен, то он на коленях просил бы ее руки, и то же чувство жалости, нежности, любви охватило его, и те же слова были у него на устах. Но она не дала ему времени сказать их.
– Да вы – вы, – сказала она, с восторгом произнося это слово вы, – другое дело. Добрее, великодушнее, лучше вас я не знаю человека, и не может быть. Ежели бы вас не было тогда, да и теперь, я не знаю, что бы было со мною, потому что… – Слезы вдруг полились ей в глаза; она повернулась, подняла ноты к глазам, запела и пошла опять ходить по зале.
В это же время из гостиной выбежал Петя.
Петя был теперь красивый, румяный пятнадцатилетний мальчик с толстыми, красными губами, похожий на Наташу. Он готовился в университет, но в последнее время, с товарищем своим Оболенским, тайно решил, что пойдет в гусары.
Петя выскочил к своему тезке, чтобы переговорить о деле.
Он просил его узнать, примут ли его в гусары.
Пьер шел по гостиной, не слушая Петю.
Петя дернул его за руку, чтоб обратить на себя его вниманье.
– Ну что мое дело, Петр Кирилыч. Ради бога! Одна надежда на вас, – говорил Петя.
– Ах да, твое дело. В гусары то? Скажу, скажу. Нынче скажу все.
– Ну что, mon cher, ну что, достали манифест? – спросил старый граф. – А графинюшка была у обедни у Разумовских, молитву новую слышала. Очень хорошая, говорит.
– Достал, – отвечал Пьер. – Завтра государь будет… Необычайное дворянское собрание и, говорят, по десяти с тысячи набор. Да, поздравляю вас.
– Да, да, слава богу. Ну, а из армии что?
– Наши опять отступили. Под Смоленском уже, говорят, – отвечал Пьер.
– Боже мой, боже мой! – сказал граф. – Где же манифест?
– Воззвание! Ах, да! – Пьер стал в карманах искать бумаг и не мог найти их. Продолжая охлопывать карманы, он поцеловал руку у вошедшей графини и беспокойно оглядывался, очевидно, ожидая Наташу, которая не пела больше, но и не приходила в гостиную.
– Ей богу, не знаю, куда я его дел, – сказал он.
– Ну уж, вечно растеряет все, – сказала графиня. Наташа вошла с размягченным, взволнованным лицом и села, молча глядя на Пьера. Как только она вошла в комнату, лицо Пьера, до этого пасмурное, просияло, и он, продолжая отыскивать бумаги, несколько раз взглядывал на нее.
– Ей богу, я съезжу, я дома забыл. Непременно…
– Ну, к обеду опоздаете.
– Ах, и кучер уехал.
Но Соня, пошедшая в переднюю искать бумаги, нашла их в шляпе Пьера, куда он их старательно заложил за подкладку. Пьер было хотел читать.
– Нет, после обеда, – сказал старый граф, видимо, в этом чтении предвидевший большое удовольствие.
За обедом, за которым пили шампанское за здоровье нового Георгиевского кавалера, Шиншин рассказывал городские новости о болезни старой грузинской княгини, о том, что Метивье исчез из Москвы, и о том, что к Растопчину привели какого то немца и объявили ему, что это шампиньон (так рассказывал сам граф Растопчин), и как граф Растопчин велел шампиньона отпустить, сказав народу, что это не шампиньон, а просто старый гриб немец.
– Хватают, хватают, – сказал граф, – я графине и то говорю, чтобы поменьше говорила по французски. Теперь не время.
– А слышали? – сказал Шиншин. – Князь Голицын русского учителя взял, по русски учится – il commence a devenir dangereux de parler francais dans les rues. [становится опасным говорить по французски на улицах.]
– Ну что ж, граф Петр Кирилыч, как ополченье то собирать будут, и вам придется на коня? – сказал старый граф, обращаясь к Пьеру.
Пьер был молчалив и задумчив во все время этого обеда. Он, как бы не понимая, посмотрел на графа при этом обращении.
– Да, да, на войну, – сказал он, – нет! Какой я воин! А впрочем, все так странно, так странно! Да я и сам не понимаю. Я не знаю, я так далек от военных вкусов, но в теперешние времена никто за себя отвечать не может.
После обеда граф уселся покойно в кресло и с серьезным лицом попросил Соню, славившуюся мастерством чтения, читать.
– «Первопрестольной столице нашей Москве.
Неприятель вошел с великими силами в пределы России. Он идет разорять любезное наше отечество», – старательно читала Соня своим тоненьким голоском. Граф, закрыв глаза, слушал, порывисто вздыхая в некоторых местах.
Наташа сидела вытянувшись, испытующе и прямо глядя то на отца, то на Пьера.
Пьер чувствовал на себе ее взгляд и старался не оглядываться. Графиня неодобрительно и сердито покачивала головой против каждого торжественного выражения манифеста. Она во всех этих словах видела только то, что опасности, угрожающие ее сыну, еще не скоро прекратятся. Шиншин, сложив рот в насмешливую улыбку, очевидно приготовился насмехаться над тем, что первое представится для насмешки: над чтением Сони, над тем, что скажет граф, даже над самым воззванием, ежели не представится лучше предлога.
Прочтя об опасностях, угрожающих России, о надеждах, возлагаемых государем на Москву, и в особенности на знаменитое дворянство, Соня с дрожанием голоса, происходившим преимущественно от внимания, с которым ее слушали, прочла последние слова: «Мы не умедлим сами стать посреди народа своего в сей столице и в других государства нашего местах для совещания и руководствования всеми нашими ополчениями, как ныне преграждающими пути врагу, так и вновь устроенными на поражение оного, везде, где только появится. Да обратится погибель, в которую он мнит низринуть нас, на главу его, и освобожденная от рабства Европа да возвеличит имя России!»
– Вот это так! – вскрикнул граф, открывая мокрые глаза и несколько раз прерываясь от сопенья, как будто к носу ему подносили склянку с крепкой уксусной солью. – Только скажи государь, мы всем пожертвуем и ничего не пожалеем.
Шиншин еще не успел сказать приготовленную им шутку на патриотизм графа, как Наташа вскочила с своего места и подбежала к отцу.
– Что за прелесть, этот папа! – проговорила она, целуя его, и она опять взглянула на Пьера с тем бессознательным кокетством, которое вернулось к ней вместе с ее оживлением.
– Вот так патриотка! – сказал Шиншин.
– Совсем не патриотка, а просто… – обиженно отвечала Наташа. – Вам все смешно, а это совсем не шутка…
– Какие шутки! – повторил граф. – Только скажи он слово, мы все пойдем… Мы не немцы какие нибудь…
– А заметили вы, – сказал Пьер, – что сказало: «для совещания».
– Ну уж там для чего бы ни было…
В это время Петя, на которого никто не обращал внимания, подошел к отцу и, весь красный, ломающимся, то грубым, то тонким голосом, сказал:
– Ну теперь, папенька, я решительно скажу – и маменька тоже, как хотите, – я решительно скажу, что вы пустите меня в военную службу, потому что я не могу… вот и всё…
Графиня с ужасом подняла глаза к небу, всплеснула руками и сердито обратилась к мужу.
– Вот и договорился! – сказала она.
Но граф в ту же минуту оправился от волнения.
– Ну, ну, – сказал он. – Вот воин еще! Глупости то оставь: учиться надо.
– Это не глупости, папенька. Оболенский Федя моложе меня и тоже идет, а главное, все равно я не могу ничему учиться теперь, когда… – Петя остановился, покраснел до поту и проговорил таки: – когда отечество в опасности.
– Полно, полно, глупости…
– Да ведь вы сами сказали, что всем пожертвуем.
– Петя, я тебе говорю, замолчи, – крикнул граф, оглядываясь на жену, которая, побледнев, смотрела остановившимися глазами на меньшого сына.
– А я вам говорю. Вот и Петр Кириллович скажет…
– Я тебе говорю – вздор, еще молоко не обсохло, а в военную службу хочет! Ну, ну, я тебе говорю, – и граф, взяв с собой бумаги, вероятно, чтобы еще раз прочесть в кабинете перед отдыхом, пошел из комнаты.
– Петр Кириллович, что ж, пойдем покурить…
Пьер находился в смущении и нерешительности. Непривычно блестящие и оживленные глаза Наташи беспрестанно, больше чем ласково обращавшиеся на него, привели его в это состояние.
– Нет, я, кажется, домой поеду…
– Как домой, да вы вечер у нас хотели… И то редко стали бывать. А эта моя… – сказал добродушно граф, указывая на Наташу, – только при вас и весела…
– Да, я забыл… Мне непременно надо домой… Дела… – поспешно сказал Пьер.
– Ну так до свидания, – сказал граф, совсем уходя из комнаты.
– Отчего вы уезжаете? Отчего вы расстроены? Отчего?.. – спросила Пьера Наташа, вызывающе глядя ему в глаза.
«Оттого, что я тебя люблю! – хотел он сказать, но он не сказал этого, до слез покраснел и опустил глаза.
– Оттого, что мне лучше реже бывать у вас… Оттого… нет, просто у меня дела.
– Отчего? нет, скажите, – решительно начала было Наташа и вдруг замолчала. Они оба испуганно и смущенно смотрели друг на друга. Он попытался усмехнуться, но не мог: улыбка его выразила страдание, и он молча поцеловал ее руку и вышел.
Пьер решил сам с собою не бывать больше у Ростовых.


Петя, после полученного им решительного отказа, ушел в свою комнату и там, запершись от всех, горько плакал. Все сделали, как будто ничего не заметили, когда он к чаю пришел молчаливый и мрачный, с заплаканными глазами.
На другой день приехал государь. Несколько человек дворовых Ростовых отпросились пойти поглядеть царя. В это утро Петя долго одевался, причесывался и устроивал воротнички так, как у больших. Он хмурился перед зеркалом, делал жесты, пожимал плечами и, наконец, никому не сказавши, надел фуражку и вышел из дома с заднего крыльца, стараясь не быть замеченным. Петя решился идти прямо к тому месту, где был государь, и прямо объяснить какому нибудь камергеру (Пете казалось, что государя всегда окружают камергеры), что он, граф Ростов, несмотря на свою молодость, желает служить отечеству, что молодость не может быть препятствием для преданности и что он готов… Петя, в то время как он собирался, приготовил много прекрасных слов, которые он скажет камергеру.