Капиллярный электрофорез

Капиллярный электрофорез, известный также как капиллярный зональный электрофорез (англ. CZE), используется для разделения ионов по заряду. В случае обычного электрофореза заряженные молекулы перемещаются в проводящей жидкости под действием электрического поля. В 1960-х годах была предложена методика капиллярного электрофореза для разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом.

Оборудование

Для проведения капиллярного электрофореза требуется относительно простое оборудование. Схема эксперимента представлена на рисунке 1. Основные компоненты системы — флакон для нанесения образца, стартовый флакон, конечный флакон, капилляр, электроды, мощный источник питания, детектор и устройство обработки данных. Флакон для нанесения образца, стартовый и конечный флаконы заполнены электролитом, например, водным буферным раствором. Для нанесения образца конец капилляра опускают во флакон с образцом и затем перемещают в стартовый флакон. Перемещение анализируемых веществ осуществляется под действием электрического поля, которые прилагают между стартовым и конечным флаконами. Все ионы передвигаются по капилляру в одном направлении под действием электроосмотического тока. Анализируемые вещества разделяются по электрофоретической мобильности и детектируются около конца капилляра.

Детектирование

Детектирование разделившихся молекул при капиллярном электрофорезе может осуществляться различными устройствами. Наиболее распространенные приборы детектируют изменение поглощения излучения в ультрафиолетовой области или в области видимого света. Обычно в таких системах в качестве ячейки используют участок капилляра. Длина пути проходящего света при капиллярном электрофорезе составляет порядка 50 микрометров, что намного меньше, чем в случае обычных ультрафиолетовых ячеек, в которых длина пути света порядка 1 сантиметра.

В соответствии с законом Бугера -Ламберта-Бера, чувствительность детектора пропорциональна длине пути, по которому свет проходит через ячейку. Для увеличения чувствительности удлиняют путь, по которому проходит свет, однако при увеличении размеров ячейки снижается разрешение. Капиллярная трубка может быть расширена в месте детектирования, такую разновидность называют пузырьковой ячейкой. В другом варианте увеличение пути проходящего света достигается за счёт добавления дополнительного капилляра (см. рисунок 2). Оба этих метода снижают эффективность разделения.

Детектирование путём флуоресценции может быть использовано при капиллярном электрофорезе образцов, имеющих естественную флуоресценцию, или химические модификации, которые вводят флуоресцентные метки. Такой способ детектирования обеспечивает высокую чувствительность, однако не может быть использован для определения нефлуоресцирующих образцов. Также используют детектирование флуоресценции, вызванную лазером, такие системы капиллярного электрофореза могут детектировать в пределах 10⁻¹⁸ — 10⁻²¹ моль.

Для того, чтобы отличить сходные образцы, системы разделения капиллярным электрофорезом могут быть напрямую связаны с масс-спектрометрами. В большинстве таких систем конец капилляра помещают в прибор для электроаэрозольной ионизации. Ионизированные частицы далее анализируют масс-спектрометрией.

Способы разделения

Молекулы разделяют капиллярным электрофорезом из-за отличий в подвижности в приложенном электрическом поле. Скорость движения (<math>u_p</math>) разделяемых молекул в приложенном поле относительно электрода с противоположным зарядом:

<math> u_p = \mu_p E</math>

где <math>\mu_p</math> это электрофоретическая подвижность и E — сила электрического поля. Электрофоретическая подвижность пропорциональна заряду иона. В случае, когда образец состоит из двух типов молекул, отличающихся зарядом, в результате электрофореза происходит разделение. Электрофоретическая подвижность вещества при данных значениях рН составляет:

<math>\mu_p = \frac{z}{6\pi \eta r}</math>

где <math>{z}</math> это удельный заряд молекулы и <math>r</math> это радиус Стокса молекулы:

<math> r=\frac{k_B T}{6 \pi \eta\ D}</math>

где <math>k_B</math> это постоянная Больцмана, и <math>T</math> температура, а D — коэффициент диффузии. Данные уравнения показывают, что электрофоретическая подвижность молекулы пропорциональна заряду и обратно пропорциональна её радиусу. Электрофоретическая подвижность может быть определена экспериментально по времени движения молекулы в электрическом поле заданной силы:

<math>\mu_p = \left ( \frac{L}{t_r} \right )\left ( \frac{L_t}{V} \right )</math>

где <math>L</math> это расстояние от точки старта до места детекции, <math>t_r</math> это время, затраченное анализируемой молекулой на достижение точки детекции, <math>V</math> напряжение электрического поля, и <math>L_t</math> это общая длина капилляра. Так как электрическое поле действует лишь на заряженные молекулы, незаряженные молекулы слабо разделяются капиллярным электрофорезом.

Скорость перемещения анализируемых молекул при капиллярном электрофорезе зависит от величины электроосмотическго потока в буфере. В общем случае электроосмотический поток направлен по направлению к отрицательно заряженному катоду. Отличающиеся электрофоретическими подвижностями, молекулы двигаются к противоположно заряженному электроду. Отрицательно заряженные частицы двигаются к положительно заряженному аноду, положительно заряженные—к катоду в направлении электроосмотического потока (см. рисунок 3).

Скорость электроосмотического потока <math>u_o</math> может быть представлена в виде:

<math> u_o= \mu_o E </math>

где <math>\mu_o</math> это электроосмотическая подвижность, равная:

<math>\mu_o= \frac{\epsilon \zeta}{\eta}</math>

где <math>\zeta</math> это потенциал стенки капилляра, а <math>\epsilon</math> относительная диэлектрическая проницаемость буферного раствора. Электроосмотическая подвижность может быть определена путём измерения времени задержки нейтрально заряженных молекул. Скорость движения (<math>u</math>) анализируемой молекулы в электрическом поле может быть представлено в виде:

<math> u_p + u_o = (\mu_p +\mu_o) E</math>

Ввиду того, что электроосмотический поток буферного раствора обычно больше, чем электрофоретический поток анализируемых веществ, все анализируемые молекулы перемещаются с буферным раствором к катоду. Отрицательно заряженные молекулы дольше задерживаются в капилляре, ввиду противоречий в их электрофоретических подвижностях. Порядок перемещения заряженных молекул представлен на рисунке 3: небольшие катионы перемещаются быстро, малые многократно заряженые анионы сильно задерживаются.

Эффективность и разрешение

Количество теоретических тарелок, или эффективность разделения в случае капиллярного электрофореза определяется уравнением:

<math> N=\frac{\mu V}{2 D_m}</math>

где <math>N</math> это количество теоретических тарелок, <math>\mu</math> это кажущаяся подвижность в среде разделения и <math>D_m</math> это коэффициент диффузии разделяемого вещества. В соответствии с этим уравнением эффективность разделения ограничивается только диффузией и является величиной, пропорциональной силе электрического поля. Эффективность разделения путём капиллярного электрофореза, как правило, значительно выше, чем эффективность других методов разделения, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии. В отличие от ВЭЖХ, в случае капиллярного электрофореза не происходит перенос масс между фазами. Профиль потока в случае систем электроосмотического потока является плоским, в отличие от ламинарного профиля хроматографических колонок, в которых разделение происходит под давлением (см. рисунок 5). В результате этого при электроосмотическом разделении не происходит расширения полос, как при хроматографии. Разделение капиллярным электрофорезом может иметь несколько сотен тысяч теоретических тарелок.

Разрешение (<math>R_s</math>) разделения капиллярного электрофореза может быть записано как :

<math>R_s = \frac{1}{4}\left ( \frac{\triangle \mu_p \sqrt{N} }{\mu_p +\mu_o} \right )</math>

В соответствии с данным уравнением, максимальное разрешение достигается при сходных значениях электрофоретических и электроосмотических подвижностей, но с противоположным знаком. Кроме того, высокое разрешение требует низкой скорости и, соответственно, требует большего времени на разделение.

Родственные методы

Разделение при помощи капиллярного электрофореза основано на различиях в электрофоретических подвижностях разделяемых молекул. Однако, некоторые классы молекул не могут быть разделены, так как являются незаряженными или незначительно отличаются по электрофоретической подвижности. Добавление поверхностно-активных веществ облегчает разделение незаряженных молекул. Заряженные полимеры, например, ДНК, могут быть разделены в капиллярах, заполненных гелем; гель сильнее замедляет более длинные молекулы, чем более короткие. Такой вариант капиллярного электрофореза называют капиллярным гель-электрофорезом. Некоторые системы капиллярного электрофореза могут быть использованы для микромасштабной хроматографии. Также системы капиллярного электрофореза могут быть использованы для изотахофореза, изоэлектрического фокусирования и аффинного электрофореза.

Литература

• Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem. 1984, 56, 111.
• Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem. 1984, 56, 113.
• Foley, J.P. Anal. Chem. 1990, 62, 1302.
• Carretero, A.S.; Cruces-Blanco, C.; Ramirez, S.C.; Pancorbo, A.C.; Gutierrez, A.F. J. Agric. Food. Chem. 2004, 52, 5791.
• Cavazza, A.; Corradini, C.; Lauria, A.; Nicoletti, I. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 3324.
• Rodrigues, M.R.A.; Caramao, E.B.; Arce, L.; Rios, A.; Valcarcel, M. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 4215.

Ссылки

• [www.shsu.edu/%7Echm_tgc/sounds/sound.html Анимация капиллярного электрофореза]
• [www.mtc-usa.com/ce.asp Капиллярный электрофорез для экспертов и начинающих]

Отрывок, характеризующий Капиллярный электрофорез

– Он! он и есть!
– Эка шельма, – сказал Денисов.
– Уйдет! – щуря глаза, сказал эсаул.
Человек, которого они называли Тихоном, подбежав к речке, бултыхнулся в нее так, что брызги полетели, и, скрывшись на мгновенье, весь черный от воды, выбрался на четвереньках и побежал дальше. Французы, бежавшие за ним, остановились.
– Ну ловок, – сказал эсаул.
– Экая бестия! – с тем же выражением досады проговорил Денисов. – И что он делал до сих пор?
– Это кто? – спросил Петя.
– Это наш пластун. Я его посылал языка взять.
– Ах, да, – сказал Петя с первого слова Денисова, кивая головой, как будто он все понял, хотя он решительно не понял ни одного слова.
Тихон Щербатый был один из самых нужных людей в партии. Он был мужик из Покровского под Гжатью. Когда, при начале своих действий, Денисов пришел в Покровское и, как всегда, призвав старосту, спросил о том, что им известно про французов, староста отвечал, как отвечали и все старосты, как бы защищаясь, что они ничего знать не знают, ведать не ведают. Но когда Денисов объяснил им, что его цель бить французов, и когда он спросил, не забредали ли к ним французы, то староста сказал, что мародеры бывали точно, но что у них в деревне только один Тишка Щербатый занимался этими делами. Денисов велел позвать к себе Тихона и, похвалив его за его деятельность, сказал при старосте несколько слов о той верности царю и отечеству и ненависти к французам, которую должны блюсти сыны отечества.
– Мы французам худого не делаем, – сказал Тихон, видимо оробев при этих словах Денисова. – Мы только так, значит, по охоте баловались с ребятами. Миродеров точно десятка два побили, а то мы худого не делали… – На другой день, когда Денисов, совершенно забыв про этого мужика, вышел из Покровского, ему доложили, что Тихон пристал к партии и просился, чтобы его при ней оставили. Денисов велел оставить его.
Тихон, сначала исправлявший черную работу раскладки костров, доставления воды, обдирания лошадей и т. п., скоро оказал большую охоту и способность к партизанской войне. Он по ночам уходил на добычу и всякий раз приносил с собой платье и оружие французское, а когда ему приказывали, то приводил и пленных. Денисов отставил Тихона от работ, стал брать его с собою в разъезды и зачислил в казаки.
Тихон не любил ездить верхом и всегда ходил пешком, никогда не отставая от кавалерии. Оружие его составляли мушкетон, который он носил больше для смеха, пика и топор, которым он владел, как волк владеет зубами, одинаково легко выбирая ими блох из шерсти и перекусывая толстые кости. Тихон одинаково верно, со всего размаха, раскалывал топором бревна и, взяв топор за обух, выстрагивал им тонкие колышки и вырезывал ложки. В партии Денисова Тихон занимал свое особенное, исключительное место. Когда надо было сделать что нибудь особенно трудное и гадкое – выворотить плечом в грязи повозку, за хвост вытащить из болота лошадь, ободрать ее, залезть в самую середину французов, пройти в день по пятьдесят верст, – все указывали, посмеиваясь, на Тихона.
– Что ему, черту, делается, меренина здоровенный, – говорили про него.
Один раз француз, которого брал Тихон, выстрелил в него из пистолета и попал ему в мякоть спины. Рана эта, от которой Тихон лечился только водкой, внутренне и наружно, была предметом самых веселых шуток во всем отряде и шуток, которым охотно поддавался Тихон.
– Что, брат, не будешь? Али скрючило? – смеялись ему казаки, и Тихон, нарочно скорчившись и делая рожи, притворяясь, что он сердится, самыми смешными ругательствами бранил французов. Случай этот имел на Тихона только то влияние, что после своей раны он редко приводил пленных.
Тихон был самый полезный и храбрый человек в партии. Никто больше его не открыл случаев нападения, никто больше его не побрал и не побил французов; и вследствие этого он был шут всех казаков, гусаров и сам охотно поддавался этому чину. Теперь Тихон был послан Денисовым, в ночь еще, в Шамшево для того, чтобы взять языка. Но, или потому, что он не удовлетворился одним французом, или потому, что он проспал ночь, он днем залез в кусты, в самую середину французов и, как видел с горы Денисов, был открыт ими.


Поговорив еще несколько времени с эсаулом о завтрашнем нападении, которое теперь, глядя на близость французов, Денисов, казалось, окончательно решил, он повернул лошадь и поехал назад.
– Ну, бг'ат, тепег'ь поедем обсушимся, – сказал он Пете.
Подъезжая к лесной караулке, Денисов остановился, вглядываясь в лес. По лесу, между деревьев, большими легкими шагами шел на длинных ногах, с длинными мотающимися руками, человек в куртке, лаптях и казанской шляпе, с ружьем через плечо и топором за поясом. Увидав Денисова, человек этот поспешно швырнул что то в куст и, сняв с отвисшими полями мокрую шляпу, подошел к начальнику. Это был Тихон. Изрытое оспой и морщинами лицо его с маленькими узкими глазами сияло самодовольным весельем. Он, высоко подняв голову и как будто удерживаясь от смеха, уставился на Денисова.
– Ну где пг'опадал? – сказал Денисов.
– Где пропадал? За французами ходил, – смело и поспешно отвечал Тихон хриплым, но певучим басом.
– Зачем же ты днем полез? Скотина! Ну что ж, не взял?..
– Взять то взял, – сказал Тихон.
– Где ж он?
– Да я его взял сперва наперво на зорьке еще, – продолжал Тихон, переставляя пошире плоские, вывернутые в лаптях ноги, – да и свел в лес. Вижу, не ладен. Думаю, дай схожу, другого поаккуратнее какого возьму.
– Ишь, шельма, так и есть, – сказал Денисов эсаулу. – Зачем же ты этого не пг'ивел?
– Да что ж его водить то, – сердито и поспешно перебил Тихон, – не гожающий. Разве я не знаю, каких вам надо?
– Эка бестия!.. Ну?..
– Пошел за другим, – продолжал Тихон, – подполоз я таким манером в лес, да и лег. – Тихон неожиданно и гибко лег на брюхо, представляя в лицах, как он это сделал. – Один и навернись, – продолжал он. – Я его таким манером и сграбь. – Тихон быстро, легко вскочил. – Пойдем, говорю, к полковнику. Как загалдит. А их тут четверо. Бросились на меня с шпажками. Я на них таким манером топором: что вы, мол, Христос с вами, – вскрикнул Тихон, размахнув руками и грозно хмурясь, выставляя грудь.
– То то мы с горы видели, как ты стречка задавал через лужи то, – сказал эсаул, суживая свои блестящие глаза.
Пете очень хотелось смеяться, но он видел, что все удерживались от смеха. Он быстро переводил глаза с лица Тихона на лицо эсаула и Денисова, не понимая того, что все это значило.
– Ты дуг'ака то не представляй, – сказал Денисов, сердито покашливая. – Зачем пег'вого не пг'ивел?
Тихон стал чесать одной рукой спину, другой голову, и вдруг вся рожа его растянулась в сияющую глупую улыбку, открывшую недостаток зуба (за что он и прозван Щербатый). Денисов улыбнулся, и Петя залился веселым смехом, к которому присоединился и сам Тихон.
– Да что, совсем несправный, – сказал Тихон. – Одежонка плохенькая на нем, куда же его водить то. Да и грубиян, ваше благородие. Как же, говорит, я сам анаральский сын, не пойду, говорит.
– Экая скотина! – сказал Денисов. – Мне расспросить надо…
– Да я его спрашивал, – сказал Тихон. – Он говорит: плохо зн аком. Наших, говорит, и много, да всё плохие; только, говорит, одна названия. Ахнете, говорит, хорошенько, всех заберете, – заключил Тихон, весело и решительно взглянув в глаза Денисова.
– Вот я те всыплю сотню гог'ячих, ты и будешь дуг'ака то ког'чить, – сказал Денисов строго.
– Да что же серчать то, – сказал Тихон, – что ж, я не видал французов ваших? Вот дай позатемняет, я табе каких хошь, хоть троих приведу.
– Ну, поедем, – сказал Денисов, и до самой караулки он ехал, сердито нахмурившись и молча.
Тихон зашел сзади, и Петя слышал, как смеялись с ним и над ним казаки о каких то сапогах, которые он бросил в куст.
Когда прошел тот овладевший им смех при словах и улыбке Тихона, и Петя понял на мгновенье, что Тихон этот убил человека, ему сделалось неловко. Он оглянулся на пленного барабанщика, и что то кольнуло его в сердце. Но эта неловкость продолжалась только одно мгновенье. Он почувствовал необходимость повыше поднять голову, подбодриться и расспросить эсаула с значительным видом о завтрашнем предприятии, с тем чтобы не быть недостойным того общества, в котором он находился.
Посланный офицер встретил Денисова на дороге с известием, что Долохов сам сейчас приедет и что с его стороны все благополучно.
Денисов вдруг повеселел и подозвал к себе Петю.
– Ну, г'асскажи ты мне пг'о себя, – сказал он.


Петя при выезде из Москвы, оставив своих родных, присоединился к своему полку и скоро после этого был взят ординарцем к генералу, командовавшему большим отрядом. Со времени своего производства в офицеры, и в особенности с поступления в действующую армию, где он участвовал в Вяземском сражении, Петя находился в постоянно счастливо возбужденном состоянии радости на то, что он большой, и в постоянно восторженной поспешности не пропустить какого нибудь случая настоящего геройства. Он был очень счастлив тем, что он видел и испытал в армии, но вместе с тем ему все казалось, что там, где его нет, там то теперь и совершается самое настоящее, геройское. И он торопился поспеть туда, где его не было.
Когда 21 го октября его генерал выразил желание послать кого нибудь в отряд Денисова, Петя так жалостно просил, чтобы послать его, что генерал не мог отказать. Но, отправляя его, генерал, поминая безумный поступок Пети в Вяземском сражении, где Петя, вместо того чтобы ехать дорогой туда, куда он был послан, поскакал в цепь под огонь французов и выстрелил там два раза из своего пистолета, – отправляя его, генерал именно запретил Пете участвовать в каких бы то ни было действиях Денисова. От этого то Петя покраснел и смешался, когда Денисов спросил, можно ли ему остаться. До выезда на опушку леса Петя считал, что ему надобно, строго исполняя свой долг, сейчас же вернуться. Но когда он увидал французов, увидал Тихона, узнал, что в ночь непременно атакуют, он, с быстротою переходов молодых людей от одного взгляда к другому, решил сам с собою, что генерал его, которого он до сих пор очень уважал, – дрянь, немец, что Денисов герой, и эсаул герой, и что Тихон герой, и что ему было бы стыдно уехать от них в трудную минуту.