Космиды

Космиды (Cosmides) — плазмиды, содержащие фрагмент ДНК фага лямбда включая cos-участок. Вместе с системами упаковки в фаговые частицы in vitro используются как векторные молекулы для клонирования генов и при построении геномных библиотек. Космиды были впервые сконструированы Коллинсом и Брюнингом в 1978 году. Их название происходит от сокращения двух терминов: cos-участок (сам термин в свою очередь происходит от англ. cohesive ends — липкие концы) и плазмида.

С помощью космид можно клонировать участки ДНК размером 32-47 т.п.н.. Плазмиды, если клонировать в них участки ДНК больше 4-5 т.п.н. становятся нестабильными из-за возрастающей склонности к рекомбинации. К тому же, космиды упаковываются в фаговые частицы, что позволяет доставить их в бактерию при помощи трансдукции.

Участок Cos

Cos-участок состоит из ~200 пар оснований и необходим для упаковки космиды в фаговую частицу. В нём содержится сайт cosN в котором фермент терминаза делает однодневной разрыв каждой из цепей ДНК на расстоянии 12 п.н друг от друга. Циклическая космида линеаризуется с образованием «липких концов» из 12 п.н.. (ДНК должна быть линейной, что бы попасть в головку фага.) Сайт cosB удерживает терминазу, пока она надрезает ДНК. Сайт cosQ на следующей космиде (так как репликация по типу катящегося кольца часто приводит к образованию конкатемеров) удерживается терминазой уже после того, как предыдущая космида была упакована. Это позволяет защитить линейные космиды от расщепления ДНКазами.

Строение космид

По сути своей космида — это ДНК фага лямбда, из который были удалены все гены, кроме cos-участка. Космида имеет размер около 5 т.п.н. и обязательно включает следующие элементы: cos-участок, необходимый для упаковки в вирионы фага лямбда, ориджин для репликации в клетке бактерий или эукариот, сайты распознавания эндонуклеазами рестрикции и маркёрный ген (например, ген резистентности к какому-либо антибиотику).

С помощью космид можно клонировать участки ДНК размером 32-47 т.п.н.. Для этого космиду и чужеродную ДНК обрабатывают одной и той же эндонуклеазой рестрикции, после чего полученные линейные фрагменты смешивают и проводят реакцию лигирования. Далее происходит упаковка ДНК в фаговые головки in vitro, она разрезается в cos-участках. Необходимые вирусные белки получают и лизата E.coli cI857 (red- gam- Sam и Dam (головка) и Eam (хвост)). Этот процесс сопровождается селекцией фрагментов по размеру, поскольку упаковываться может только ДНК длиной 78-105 % от генома фага лямбда. Таким образом в вирионы попадут преимущественно рекомбинантные космиды, содержащих клонированный участок ДНК. Продукты лигирования между двумя космидами будут слишком малы для упаковки, а между двумя фрагментами чужеродной ДНК — велики.

Полученные фаговые частицы с рекомбинантными космидами используют для инфицирования клеток кишечной палочки. В цитоплазме космиды циклизуются благодаря соединению липких концов и действию фермента лигазы, а далее реплицируются как обычные плазмиды, не проявляя никаких свойств фага лямбда. Селекция трансформированных клеток проводится по маркерным геном, присутствующим в векторной молекуле.

Модификации

Поскольку космиды дают возможность клонировать относительно большие участки ДНК, они являются удобными векторами для создания библиотек фрагментов геномов эукариот полученных путём частичного расщепления эндонуклеазами рестрикции. Однако продукты такого расщепления могут иметь разный размер, и возможны случаи, когда происходит лигирование двух относительно небольших фрагментов, которые не находились в геноме рядом, и создание соответствующего клона, который будет давать ложное представление о их положения в хромосомах. Эту проблему можно преодолеть путём фракционирования продуктов частичного расщепления по размеру. Однако даже такой метод не позволяет полностью избежать возникновения клонов космид, содержащих несколько лигированных фрагментов ДНК, поэтому были предложены другие методы, в частности дефосфорилирования фрагментов чужеродной ДНК, чтобы они не могли объединяться друг с другом. Также были созданы специальные космидные векторы pJB8 (Burke, Ish-Horowicz, 1981) и c2XB (Bates, Swift, 1983), при использовании которых вероятность образования ложных клонов сводится к минимуму.

Современные космиды серий pWE и sCos характеризуются наличием нескольких сайтов клонирования, окружённых фаговыми промоторами и уникальными участками распознавания эндонуклеазами рестрикции NotI, SacII и SfiI, позволяющих вырезать вставку одним фрагментом.

Источники

• Primrose S.B., Twyman R.M., Old R.W. Principles of Gene Manipulation. — 6th. — Wiley-Blackwell, 2002. — ISBN 0632059540.
• Griffiths A.J.F., Wessler S.R., et al. [bcs.whfreeman.com/iga8e/default.asp?s=&n=&i=&v=&o=&ns=0&uid=0&rau=0 An Introduction to Genetic Analysis]. — 8th. — W. H. Freeman, 2004. — ISBN 978-0716749394.
• Bruce A. Voyles (2002) The biology of viruses 2nd ed. ISBN 0-07-237031-9
• Stryer, Lubert (1995) Biochemistry 4th ed. ISBN 0-7167-2009-4
• [www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.section.43841 Eurekah Biosciences Collection: Viruses, @NCBI]

Отрывок, характеризующий Космиды

– Да кто? Кутузов? – спросил Ростов.
– Не Кутузов, а как бишь его, – ну, да всё одно, живых не много осталось. Вон туда ступайте, вон к той деревне, там всё начальство собралось, – сказал этот офицер, указывая на деревню Гостиерадек, и прошел мимо.
Ростов ехал шагом, не зная, зачем и к кому он теперь поедет. Государь ранен, сражение проиграно. Нельзя было не верить этому теперь. Ростов ехал по тому направлению, которое ему указали и по которому виднелись вдалеке башня и церковь. Куда ему было торопиться? Что ему было теперь говорить государю или Кутузову, ежели бы даже они и были живы и не ранены?
– Этой дорогой, ваше благородие, поезжайте, а тут прямо убьют, – закричал ему солдат. – Тут убьют!
– О! что говоришь! сказал другой. – Куда он поедет? Тут ближе.
Ростов задумался и поехал именно по тому направлению, где ему говорили, что убьют.
«Теперь всё равно: уж ежели государь ранен, неужели мне беречь себя?» думал он. Он въехал в то пространство, на котором более всего погибло людей, бегущих с Працена. Французы еще не занимали этого места, а русские, те, которые были живы или ранены, давно оставили его. На поле, как копны на хорошей пашне, лежало человек десять, пятнадцать убитых, раненых на каждой десятине места. Раненые сползались по два, по три вместе, и слышались неприятные, иногда притворные, как казалось Ростову, их крики и стоны. Ростов пустил лошадь рысью, чтобы не видать всех этих страдающих людей, и ему стало страшно. Он боялся не за свою жизнь, а за то мужество, которое ему нужно было и которое, он знал, не выдержит вида этих несчастных.
Французы, переставшие стрелять по этому, усеянному мертвыми и ранеными, полю, потому что уже никого на нем живого не было, увидав едущего по нем адъютанта, навели на него орудие и бросили несколько ядер. Чувство этих свистящих, страшных звуков и окружающие мертвецы слились для Ростова в одно впечатление ужаса и сожаления к себе. Ему вспомнилось последнее письмо матери. «Что бы она почувствовала, – подумал он, – коль бы она видела меня теперь здесь, на этом поле и с направленными на меня орудиями».
В деревне Гостиерадеке были хотя и спутанные, но в большем порядке русские войска, шедшие прочь с поля сражения. Сюда уже не доставали французские ядра, и звуки стрельбы казались далекими. Здесь все уже ясно видели и говорили, что сражение проиграно. К кому ни обращался Ростов, никто не мог сказать ему, ни где был государь, ни где был Кутузов. Одни говорили, что слух о ране государя справедлив, другие говорили, что нет, и объясняли этот ложный распространившийся слух тем, что, действительно, в карете государя проскакал назад с поля сражения бледный и испуганный обер гофмаршал граф Толстой, выехавший с другими в свите императора на поле сражения. Один офицер сказал Ростову, что за деревней, налево, он видел кого то из высшего начальства, и Ростов поехал туда, уже не надеясь найти кого нибудь, но для того только, чтобы перед самим собою очистить свою совесть. Проехав версты три и миновав последние русские войска, около огорода, окопанного канавой, Ростов увидал двух стоявших против канавы всадников. Один, с белым султаном на шляпе, показался почему то знакомым Ростову; другой, незнакомый всадник, на прекрасной рыжей лошади (лошадь эта показалась знакомою Ростову) подъехал к канаве, толкнул лошадь шпорами и, выпустив поводья, легко перепрыгнул через канаву огорода. Только земля осыпалась с насыпи от задних копыт лошади. Круто повернув лошадь, он опять назад перепрыгнул канаву и почтительно обратился к всаднику с белым султаном, очевидно, предлагая ему сделать то же. Всадник, которого фигура показалась знакома Ростову и почему то невольно приковала к себе его внимание, сделал отрицательный жест головой и рукой, и по этому жесту Ростов мгновенно узнал своего оплакиваемого, обожаемого государя.
«Но это не мог быть он, один посреди этого пустого поля», подумал Ростов. В это время Александр повернул голову, и Ростов увидал так живо врезавшиеся в его памяти любимые черты. Государь был бледен, щеки его впали и глаза ввалились; но тем больше прелести, кротости было в его чертах. Ростов был счастлив, убедившись в том, что слух о ране государя был несправедлив. Он был счастлив, что видел его. Он знал, что мог, даже должен был прямо обратиться к нему и передать то, что приказано было ему передать от Долгорукова.
Но как влюбленный юноша дрожит и млеет, не смея сказать того, о чем он мечтает ночи, и испуганно оглядывается, ища помощи или возможности отсрочки и бегства, когда наступила желанная минута, и он стоит наедине с ней, так и Ростов теперь, достигнув того, чего он желал больше всего на свете, не знал, как подступить к государю, и ему представлялись тысячи соображений, почему это было неудобно, неприлично и невозможно.
«Как! Я как будто рад случаю воспользоваться тем, что он один и в унынии. Ему неприятно и тяжело может показаться неизвестное лицо в эту минуту печали; потом, что я могу сказать ему теперь, когда при одном взгляде на него у меня замирает сердце и пересыхает во рту?» Ни одна из тех бесчисленных речей, которые он, обращая к государю, слагал в своем воображении, не приходила ему теперь в голову. Те речи большею частию держались совсем при других условиях, те говорились большею частию в минуту побед и торжеств и преимущественно на смертном одре от полученных ран, в то время как государь благодарил его за геройские поступки, и он, умирая, высказывал ему подтвержденную на деле любовь свою.
«Потом, что же я буду спрашивать государя об его приказаниях на правый фланг, когда уже теперь 4 й час вечера, и сражение проиграно? Нет, решительно я не должен подъезжать к нему. Не должен нарушать его задумчивость. Лучше умереть тысячу раз, чем получить от него дурной взгляд, дурное мнение», решил Ростов и с грустью и с отчаянием в сердце поехал прочь, беспрестанно оглядываясь на всё еще стоявшего в том же положении нерешительности государя.