Малые интерферирующие РНК

Ма́лые интерфери́рующие РНК или короткие интерферирующие РНК (англ. siRNA, small interfering RNA) — это класс двухцепочечных РНК, длиной 20-25 нуклеотидов. Взаимодействие малых интерферирующих РНК с матричной РНК (мРНК) целевого гена приводит к деградации последней (в процессе РНК-интерференции), предотвращая трансляцию мРНК на рибосомах в кодируемый ею белок. В конечном итоге результат действия малых интерферирующих РНК идентичен тому, как если бы просто снижалась экспрессия гена.

В клетке РНК-интерференция является важной частью механизмов противовирусной защиты и поддержания структуры хроматина. Молекулярные механизмы данных взаимодействий в настоящее время исследуются, в частности, была предложена гипотеза участия малых РНК в РНК-зависимом метилировании ДНК.

История

Малые интерферирующие РНК были открыты в 1999 году группой Дэвида Болкомба (англ. David Baulcombe) в Великобритании как компонент системы пост-транскрипционного сайленсинга генов у растений (англ. PTGS, en:post-transcriptional gene silencing). Группа опубликовала полученные данные в журнале Science.

В 2001 году группой Томаса Тущла (англ. Thomas Tuschl) было показано, что синтетические малые интерферирующие РНК могут индуцировать РНК-интерференцию в клетках млекопитающих. Соответствующие результаты были опубликованы в журнале Nature. Это открытие привело к росту интереса к использованию РНК-интерференции для биомедицинских исследований и разработки лекарственных препаратов.

Структура

Малые интерферирующие РНК представляют собой короткие (как правило, длиной 21 нуклеотид) двухцепочечные РНК с двумя неспаренными выступающими нуклеотидами на 3'-концах.

Каждая из двух цепей РНК имеет фосфатную группу на 5'-конце и гидроксильную группу на 3'-конце. Короткие интерферирующие РНК с такой структурой образуются в результате активности фермента Dicer, субстратами которого являются длинные двухцепочечные РНК или короткие РНК, содержащие шпильки. Малые интерферирующие РНК могут быть искусственно введены в клетки для нокдауна определённого гена. При этом экспрессия практически любого гена с известной последовательностью нуклеотидов может быть целенаправленно изменена. Данное свойство делает короткие интерферирующие РНК удобным инструментом для исследования функций генов и изучения мишеней лекарственных средств.

Индукция РНК-интерференции

Целенаправленное подавление экспрессии генов с помощью трансфекции экзогенной интерферирующей РНК в клетки связано с определёнными трудностями, поскольку нокдаун гена в этом случае имеет временный характер, особенно в быстро делящихся клетках. Один из способов преодоления этих трудностей состоит в том, чтобы ввести в клетку вектор, обеспечивающий экспрессию соответствующей малой интерферирующей РНК в течение более длительного периода времени. Такой вектор, как правило, содержит промотор U6 или H1, обеспечивающий транскрипцию РНК полимеразой III, которая транскрибирует малые ядерные РНК. За промотором следуют короткая последовательность нуклеотидов, кодирующая малую интерферирующую РНК (19—29 нуклеотидов) и последовательность комплементарная ей, которые разделённы между собой 4—11 нуклеотидами, которые во вторичной структуре малой интерферирующей РНК образуют петлю. В целом, соответствующий транскрипт напоминает по форме шпильку в результате комплементарного спаривания последовательностей в его начале и конце. Предполагается (хотя это не установлено достоверно), что такие шпильки затем превращаются в короткие интерферирующие РНК под действием фермента Dicer.

РНК-зависимая активация генов

Двухцепочечные РНК могут усиливать экспрессию генов по механизму, называемому РНК-зависимой активацией генов (англ. RNAa, small RNA-induced gene activation). Показано, что двухцепочечные РНК, комплементарные промоторам генов-мишеней, вызывают активацию соответствующих генов. РНК-зависимая активация при введении синтетических двухцепочечных РНК была показана для клеток человека. Не известно, имеется ли подобная система в клетках других организмов.

Исключение неспецифических эффектов

Поскольку РНК-интерференция пересекается со множеством других цепочек реакций, при экспериментальном введении малых интерферирующх РНК могут включаться неспецифические эффекты. Появление двухцепочечных РНК в клетках млекопитающих может быть следствием заражения вирусом и поэтому приводит к запуску иммунного ответа. Более того, так как структурно похожие микроРНК изменяют экспрессию генов путём неполного спаривания с мишенью мРНК, введение малых интерферирующих РНК может вызвать нежелательный побочный эффект.

Врождённый иммунитет

Введение значительного количества малых интерферирующих РНК может вызвать побочные эффекты из-за того, что включается врождённый иммунный ответ. Вероятно это происходит из-за активации протеинкиназы R, которая чувствительна к малым интерферирующим РНК, возможно также участие гена RIG I (англ. retinoic acid inducible gene I). Также описана индукции цитокинов через рецептор TLR 7 (англ. toll-like receptor 7). Один из перспективных методов снижения побочных эффектов состоит в преобразовании малых интерферирующих РНК в микроРНК. МикроРНК синтезируются в норме, поэтому сравнительно небольшая концентрация образующихся малых интерферирующих РНК можно приводить к сравнимому по силе эффекту нокдауна генов. Это должно свести к минимуму побочные эффекты.

Побочные эффекты

Сбой мишени --- это ещё одна трудность при использовании малых интерферирующих РНК как инструмента для достижения нокдауна генов. Гены с неполной комплементарностью блокируются малыми интерферирующими РНК (т. е. фактически малые интерферирующие РНК действуют как микроРНК), что приводит к трудностям в интерпретации результатов опытов и содержит риск токсичности. Однако, этого можно избежать, организуя соответствующие контрольные опыты, и создавая алгоритмы конструирования малых интерферирующих РНК, которые приводят к таким РНК, не дающим сбоев мишени. Затем можно проанализировать экспрессию генов по всему геному, например, при помощи метода микромассивов (англ. microarray technology), чтобы проверить отсутствие сбоев мишени и произвести дальнейшую настройку алгоритмов. В статье сотрудников лаборатории доктора Хворовой за 2006 год рассматриваются фрагменты длиной 6 или 7 пар оснований, начинающиеся с позиции 2, в малой интерферирующей РНК, соответствующей участку 3’UTR в генах, где происходит сбой мишени.

Возможные применения в терапии и препятствия к этому

Давая возможность выключить по существу любой ген по желанию, РНК-интерференция на основе малых интерферирующих РНК вызвала огромный интерес в фундаментальной и прикладной биологии. Число широкоохватных тестов на базе РНК-интерференции для выявления важных генов в биохимических путях постоянно растет. Поскольку развитие болезней также обусловлено активностью генов, ожидается, что в некоторых случаях выключение гена при помощи малой интерферирующей РНК может давать терапевтический эффект.

Однако применение РНК-интерференции на основе малых интерферирующих РНК к животным, и в особенности к людям, сталкивается со множеством трудностей. В экспериментах было показано, что эффективность малых интерферирующих РНК оказывается различной для разных типов клеток: одни клетки легко откликаются на воздействие малых интерферирующих РНК и демонстрируют снижение экспрессии генов, в других же подобного не наблюдается, несмотря на эффективную трансфекцию. Причины этого явления пока что плохо изучены.

Результаты первой фазы испытаний двух первых терапевтических препаратов, действующих по механизму РНК-интерференции (предназначены для лечения макулодистрофии), опубликованные в конце 2005 года, показывают, что препараты на основе малых интерферирующих РНК легко переносятся пациентами и имеют приемлемые факмакокинетические свойства.

Предварительные клинические испытания малых интерферирующих РНК, нацеленных на вирус Эбола, указывают на то, что они могут быть эффективны для постконтактной профилактики заболевания. Данный препарат позволил выжить всей группе подопытных приматов, получивших летальную дозу Заирского Эболавируса.

Отрывок, характеризующий Малые интерферирующие РНК

Билибин и наши расхохотались, глядя в глаза Ипполиту. Князь Андрей видел, что этот Ипполит, которого он (должно было признаться) почти ревновал к своей жене, был шутом в этом обществе.
– Нет, я должен вас угостить Курагиным, – сказал Билибин тихо Болконскому. – Он прелестен, когда рассуждает о политике, надо видеть эту важность.
Он подсел к Ипполиту и, собрав на лбу свои складки, завел с ним разговор о политике. Князь Андрей и другие обступили обоих.
– Le cabinet de Berlin ne peut pas exprimer un sentiment d'alliance, – начал Ипполит, значительно оглядывая всех, – sans exprimer… comme dans sa derieniere note… vous comprenez… vous comprenez… et puis si sa Majeste l'Empereur ne deroge pas au principe de notre alliance… [Берлинский кабинет не может выразить свое мнение о союзе, не выражая… как в своей последней ноте… вы понимаете… вы понимаете… впрочем, если его величество император не изменит сущности нашего союза…]
– Attendez, je n'ai pas fini… – сказал он князю Андрею, хватая его за руку. – Je suppose que l'intervention sera plus forte que la non intervention. Et… – Он помолчал. – On ne pourra pas imputer a la fin de non recevoir notre depeche du 28 novembre. Voila comment tout cela finira. [Подождите, я не кончил. Я думаю, что вмешательство будет прочнее чем невмешательство И… Невозможно считать дело оконченным непринятием нашей депеши от 28 ноября. Чем то всё это кончится.]
И он отпустил руку Болконского, показывая тем, что теперь он совсем кончил.
– Demosthenes, je te reconnais au caillou que tu as cache dans ta bouche d'or! [Демосфен, я узнаю тебя по камешку, который ты скрываешь в своих золотых устах!] – сказал Билибин, y которого шапка волос подвинулась на голове от удовольствия.
Все засмеялись. Ипполит смеялся громче всех. Он, видимо, страдал, задыхался, но не мог удержаться от дикого смеха, растягивающего его всегда неподвижное лицо.
– Ну вот что, господа, – сказал Билибин, – Болконский мой гость в доме и здесь в Брюнне, и я хочу его угостить, сколько могу, всеми радостями здешней жизни. Ежели бы мы были в Брюнне, это было бы легко; но здесь, dans ce vilain trou morave [в этой скверной моравской дыре], это труднее, и я прошу у всех вас помощи. Il faut lui faire les honneurs de Brunn. [Надо ему показать Брюнн.] Вы возьмите на себя театр, я – общество, вы, Ипполит, разумеется, – женщин.
– Надо ему показать Амели, прелесть! – сказал один из наших, целуя кончики пальцев.
– Вообще этого кровожадного солдата, – сказал Билибин, – надо обратить к более человеколюбивым взглядам.
– Едва ли я воспользуюсь вашим гостеприимством, господа, и теперь мне пора ехать, – взглядывая на часы, сказал Болконский.
– Куда?
– К императору.
– О! о! о!
– Ну, до свидания, Болконский! До свидания, князь; приезжайте же обедать раньше, – пocлшaлиcь голоса. – Мы беремся за вас.
– Старайтесь как можно более расхваливать порядок в доставлении провианта и маршрутов, когда будете говорить с императором, – сказал Билибин, провожая до передней Болконского.
– И желал бы хвалить, но не могу, сколько знаю, – улыбаясь отвечал Болконский.
– Ну, вообще как можно больше говорите. Его страсть – аудиенции; а говорить сам он не любит и не умеет, как увидите.


На выходе император Франц только пристально вгляделся в лицо князя Андрея, стоявшего в назначенном месте между австрийскими офицерами, и кивнул ему своей длинной головой. Но после выхода вчерашний флигель адъютант с учтивостью передал Болконскому желание императора дать ему аудиенцию.
Император Франц принял его, стоя посредине комнаты. Перед тем как начинать разговор, князя Андрея поразило то, что император как будто смешался, не зная, что сказать, и покраснел.
– Скажите, когда началось сражение? – спросил он поспешно.
Князь Андрей отвечал. После этого вопроса следовали другие, столь же простые вопросы: «здоров ли Кутузов? как давно выехал он из Кремса?» и т. п. Император говорил с таким выражением, как будто вся цель его состояла только в том, чтобы сделать известное количество вопросов. Ответы же на эти вопросы, как было слишком очевидно, не могли интересовать его.
– В котором часу началось сражение? – спросил император.
– Не могу донести вашему величеству, в котором часу началось сражение с фронта, но в Дюренштейне, где я находился, войско начало атаку в 6 часу вечера, – сказал Болконский, оживляясь и при этом случае предполагая, что ему удастся представить уже готовое в его голове правдивое описание всего того, что он знал и видел.
Но император улыбнулся и перебил его:
– Сколько миль?
– Откуда и докуда, ваше величество?
– От Дюренштейна до Кремса?
– Три с половиною мили, ваше величество.
– Французы оставили левый берег?
– Как доносили лазутчики, в ночь на плотах переправились последние.
– Достаточно ли фуража в Кремсе?
– Фураж не был доставлен в том количестве…
Император перебил его.
– В котором часу убит генерал Шмит?…
– В семь часов, кажется.
– В 7 часов. Очень печально! Очень печально!
Император сказал, что он благодарит, и поклонился. Князь Андрей вышел и тотчас же со всех сторон был окружен придворными. Со всех сторон глядели на него ласковые глаза и слышались ласковые слова. Вчерашний флигель адъютант делал ему упреки, зачем он не остановился во дворце, и предлагал ему свой дом. Военный министр подошел, поздравляя его с орденом Марии Терезии З й степени, которым жаловал его император. Камергер императрицы приглашал его к ее величеству. Эрцгерцогиня тоже желала его видеть. Он не знал, кому отвечать, и несколько секунд собирался с мыслями. Русский посланник взял его за плечо, отвел к окну и стал говорить с ним.
Вопреки словам Билибина, известие, привезенное им, было принято радостно. Назначено было благодарственное молебствие. Кутузов был награжден Марией Терезией большого креста, и вся армия получила награды. Болконский получал приглашения со всех сторон и всё утро должен был делать визиты главным сановникам Австрии. Окончив свои визиты в пятом часу вечера, мысленно сочиняя письмо отцу о сражении и о своей поездке в Брюнн, князь Андрей возвращался домой к Билибину. У крыльца дома, занимаемого Билибиным, стояла до половины уложенная вещами бричка, и Франц, слуга Билибина, с трудом таща чемодан, вышел из двери.
Прежде чем ехать к Билибину, князь Андрей поехал в книжную лавку запастись на поход книгами и засиделся в лавке.
– Что такое? – спросил Болконский.
– Ach, Erlaucht? – сказал Франц, с трудом взваливая чемодан в бричку. – Wir ziehen noch weiter. Der Bosewicht ist schon wieder hinter uns her! [Ах, ваше сиятельство! Мы отправляемся еще далее. Злодей уж опять за нами по пятам.]
– Что такое? Что? – спрашивал князь Андрей.
Билибин вышел навстречу Болконскому. На всегда спокойном лице Билибина было волнение.
– Non, non, avouez que c'est charmant, – говорил он, – cette histoire du pont de Thabor (мост в Вене). Ils l'ont passe sans coup ferir. [Нет, нет, признайтесь, что это прелесть, эта история с Таборским мостом. Они перешли его без сопротивления.]
Князь Андрей ничего не понимал.
– Да откуда же вы, что вы не знаете того, что уже знают все кучера в городе?
– Я от эрцгерцогини. Там я ничего не слыхал.
– И не видали, что везде укладываются?
– Не видал… Да в чем дело? – нетерпеливо спросил князь Андрей.
– В чем дело? Дело в том, что французы перешли мост, который защищает Ауэсперг, и мост не взорвали, так что Мюрат бежит теперь по дороге к Брюнну, и нынче завтра они будут здесь.
– Как здесь? Да как же не взорвали мост, когда он минирован?
– А это я у вас спрашиваю. Этого никто, и сам Бонапарте, не знает.
Болконский пожал плечами.
– Но ежели мост перейден, значит, и армия погибла: она будет отрезана, – сказал он.
– В этом то и штука, – отвечал Билибин. – Слушайте. Вступают французы в Вену, как я вам говорил. Всё очень хорошо. На другой день, то есть вчера, господа маршалы: Мюрат Ланн и Бельяр, садятся верхом и отправляются на мост. (Заметьте, все трое гасконцы.) Господа, – говорит один, – вы знаете, что Таборский мост минирован и контраминирован, и что перед ним грозный tete de pont и пятнадцать тысяч войска, которому велено взорвать мост и нас не пускать. Но нашему государю императору Наполеону будет приятно, ежели мы возьмем этот мост. Проедемте втроем и возьмем этот мост. – Поедемте, говорят другие; и они отправляются и берут мост, переходят его и теперь со всею армией по сю сторону Дуная направляются на нас, на вас и на ваши сообщения.
– Полноте шутить, – грустно и серьезно сказал князь Андрей.
Известие это было горестно и вместе с тем приятно князю Андрею.
Как только он узнал, что русская армия находится в таком безнадежном положении, ему пришло в голову, что ему то именно предназначено вывести русскую армию из этого положения, что вот он, тот Тулон, который выведет его из рядов неизвестных офицеров и откроет ему первый путь к славе! Слушая Билибина, он соображал уже, как, приехав к армии, он на военном совете подаст мнение, которое одно спасет армию, и как ему одному будет поручено исполнение этого плана.
– Полноте шутить, – сказал он.
– Не шучу, – продолжал Билибин, – ничего нет справедливее и печальнее. Господа эти приезжают на мост одни и поднимают белые платки; уверяют, что перемирие, и что они, маршалы, едут для переговоров с князем Ауэрспергом. Дежурный офицер пускает их в tete de pont. [мостовое укрепление.] Они рассказывают ему тысячу гасконских глупостей: говорят, что война кончена, что император Франц назначил свидание Бонапарту, что они желают видеть князя Ауэрсперга, и тысячу гасконад и проч. Офицер посылает за Ауэрспергом; господа эти обнимают офицеров, шутят, садятся на пушки, а между тем французский баталион незамеченный входит на мост, сбрасывает мешки с горючими веществами в воду и подходит к tete de pont. Наконец, является сам генерал лейтенант, наш милый князь Ауэрсперг фон Маутерн. «Милый неприятель! Цвет австрийского воинства, герой турецких войн! Вражда кончена, мы можем подать друг другу руку… император Наполеон сгорает желанием узнать князя Ауэрсперга». Одним словом, эти господа, не даром гасконцы, так забрасывают Ауэрсперга прекрасными словами, он так прельщен своею столь быстро установившеюся интимностью с французскими маршалами, так ослеплен видом мантии и страусовых перьев Мюрата, qu'il n'y voit que du feu, et oubl celui qu'il devait faire faire sur l'ennemi. [Что он видит только их огонь и забывает о своем, о том, который он обязан был открыть против неприятеля.] (Несмотря на живость своей речи, Билибин не забыл приостановиться после этого mot, чтобы дать время оценить его.) Французский баталион вбегает в tete de pont, заколачивают пушки, и мост взят. Нет, но что лучше всего, – продолжал он, успокоиваясь в своем волнении прелестью собственного рассказа, – это то, что сержант, приставленный к той пушке, по сигналу которой должно было зажигать мины и взрывать мост, сержант этот, увидав, что французские войска бегут на мост, хотел уже стрелять, но Ланн отвел его руку. Сержант, который, видно, был умнее своего генерала, подходит к Ауэрспергу и говорит: «Князь, вас обманывают, вот французы!» Мюрат видит, что дело проиграно, ежели дать говорить сержанту. Он с удивлением (настоящий гасконец) обращается к Ауэрспергу: «Я не узнаю столь хваленую в мире австрийскую дисциплину, – говорит он, – и вы позволяете так говорить с вами низшему чину!» C'est genial. Le prince d'Auersperg se pique d'honneur et fait mettre le sergent aux arrets. Non, mais avouez que c'est charmant toute cette histoire du pont de Thabor. Ce n'est ni betise, ni lachete… [Это гениально. Князь Ауэрсперг оскорбляется и приказывает арестовать сержанта. Нет, признайтесь, что это прелесть, вся эта история с мостом. Это не то что глупость, не то что подлость…]