Метод дробовика

Поделись знанием:
Перейти к: навигация, поиск

Метод дробовика (англ. Shotgun sequencing или шотган-секвенирование/клонирование) — метод, используемый для секвенирования длинных участков ДНК. Суть метода состоит в получении случайной массированной выборки клонированных фрагментов ДНК данного организма, на основе которых может быть составлена его геномная библиотека.

Поскольку обычные методы секвенирования могут быть применимы только к коротким отрезкам ДНК (100-1000 пар оснований), более длинные последовательности можно разделить на фрагменты, а затем собрать заново, чтобы получить полную последовательность большого участка ДНК. Для этого используются два основных метода: хромосомная ходьба (англ. chromosome walking), который позволяет определить шаг за шагом последовательность большого участка ДНК, и данный метод, который намного быстрее, но и сложнее, так как используются случайные фрагменты ДНК, которые затем необходимо собрать вместе (с помощью специального программного обеспечения).

При секвенировании методом дробовика ДНК случайным образом фрагментируется на мелкие участки, которые затем секвенируют обычными методами, например, методом секвенирования нового поколения. Полученные перекрывающиеся случайные фрагменты ДНК затем собирают с помощью специальных программ в одну целую большую последовательность, однако, при сборке некоторые затруднения представляют повторенные последовательности ДНК.

Метод дробовика применяли для получения первых полных геномов организмов.





Пример

Для примера, допустим, что имеются два случайных фрагмента, полученных методом дробовика:

Цепь Последовательность
Первоначальная AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Первый фрагмент AGCATGCTGCAGTCATGCT-------
-------------------TAGGCTA
Второй фрагмент AGCATG--------------------
------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Восстановленная последовательность AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA

Наиболее часто используемыми программами для получения результатов в единое целое служат программы для сборки полученных ДНК-фрагментов

Расшифровка полного генома методом дробовика

Метод дробовика для малых геномов (4000- 7000-пар оснований) используется с 1979 г.[1] Более широкое применение получил метод при секвенировании парных концов,и стал известен как «двуствольный» метод дробовика. Несколько исследовательских групп, которые секвенировали более длинные последовательности ДНК методом дробовика, пришли к выводу, что полезная информация может быть получена при секвенировании парных концов фрагмента ДНК. Секвенирование с двух концов одного и того же фрагмента и отслеживание парных данных сложнее и объёмнее, чем секвенирование одного конца и получение двух отдельных фрагментов. Эти две последовательности ориентированы в противоположных направлениях и по длине фрагмента могут быть отдельны друг от друга, но, несмотря на это данные все равно являются ценными при восстановлении последовательности исходного целевого фрагмента. Первое опубликованное описание использования парных концов было в 1990 году[2] в качестве секвенируемой последовательности использовался локус гена человеческого гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы. В 1991 году было опубликовано первое теоретическое описание секвенирования парных концов[3] , которое предполагало использование фрагментов постоянной длины. В то же время исследователи пришли к выводу о том, что оптимальная продолжительность чтения фрагмента последовательностей для парных концов должна читаться в три раза дольше, чем исходная последовательность. В 1995 году Роучем и др.[4] было введено новшество с использованием фрагментов разных размеров, и показано, что такой способ секвенирования подойдет лишь для больших генов. Этот замысел был впоследствии принят Институтом геномных исследований (TIGR), исследовавших последовательность генома бактерии гемофильной инфекции в 1995 году [5] , а затем Celera Genomics в секвенировании генома дрозофилы (плодовой мушки) в 2000 году[6] и впоследствии генома человека.

Этот способ заключается в следующем: режутся случайные фрагменты ДНК-нити с высоким молекулярным весом, отобранных по размеру (обычно 2, 10, 50 и 150 Кб) и клонируются в соответствующих векторах. Клоны секвенируют с обоих концов с использованием метода обрыва цепи, в результате которого образуются две коротких последовательности. Каждая последовательность называется конечным ридом или ридом, а две считанные последовательности с одного и того же клона – парными концевыми. Так как методом обрыва цепи обычно можно производить чтение оснований длиной только от 500 до 1000, то во всех, кроме самых маленьких клонов, парные концы будут перекрываться редко.

Исходная последовательность восстанавливается с помощью программного обеспечения сборки последовательностей. Изначально перекрытые риды собираются в более сложные последовательности, известные как контиги. Контиги могут быть связаны друг с другом в временные конструкции, между парными концами. Расстояние между контигами может быть выявлено из позиции соседних пар, если средняя длина фрагмента библиотеки известна и имеет небольшие отклонения. В зависимости от размера расстояния между контигами, могут быть использованы различные методы для поиска недостающей последовательности. Если зазор мал (5-20kb), то необходима область для амплификации с использованием ПЦР и последующим секвенированием. Если зазор большой (> 20kb), то больший фрагмент клонируют в специальных векторах, таких как искусственная бактериальная хромосома с последующим секвенированием вектора.

Сторонники этого подхода уверены, что можно секвенировать весь геном сразу с помощью больших массивов, которые гораздо эффективнее традиционных подходов. Противники же утверждают, что хоть техника для чтения ДНК-последовательностей больших областей быстро развивается, способность правильно связать все части генома является сомнительной, особенно для геномов с повторяющимися частями.

В будущем программы станут все более изобретательными, а вычислительная мощность дешевле, что поможет преодолеть противоречия.

Покрытие

Покрытие (читаемая глубина или глубина) это среднее число ридов, представляющих данный нуклеотид в реконструированной последовательности. Оно может быть рассчитано исходя из длины исходного генома (G), количества операций (N), и средней длины рида (L), как: N* L / G.

Например, гипотетический геном с 2000 п.о., реконструированный из 8 ридов со средней длиной 500 нуклеотидов, будет иметь двукратную избыточность. Этот параметр также позволяет оценить другие величины, такие как процент от генома, охватываемого ридами (иногда называемые также покрытием). Высокий охват в методе дробовика необходим, поскольку он может избавиться от ошибок в установлении оснований и сборки. В теории секвенирования ДНК рассматриваются отношения таких величин.

Иногда имеется различие между покрытой последовательностью и физической последовательностью. Покрытая последовательность является средним количеством основных ридов, в то время как физическое покрытие это средняя величина считанных оснований или расстояние парных ридов[7].

Иерархия метода дробовика

Теоретически, метод дробовика можно применять к геномам любого размера. Но его непосредственное применение к большим геномам (например, генома человека) было ограничено до конца 1990-х годов, когда достижения в технологии еще не использовались в обработке огромных количеств сложных данных[8]. Так как полный геном ограничен огромными размерами больших генов и имеет сложности в секвенировании из-за высокого процента повторяющихся участков ДНК (более 50% для генома человека), присутствующих в больших геномах[9].

Признано, что метод дробовика для большой последовательности генома будет предоставлять достоверные данные. По этим причинам использовали другие методы для снижения вычислительной нагрузки последовательности сборки, перед проведением метода дробовика[9]. В иерархической последовательности, также известной как убывающее секвенирование с низким разрешением, физическая карта генома выполнена до фактического секвенирования. Из этой карты, минимальное количество фрагментов, которые охватывают всю хромосому, выбираются для секвенирования[10]. Таким образом, требуется минимальное количество высокой пропускной последовательности для сборки.

Амплифицированный геном сначала режут на крупные куски (50-200kb) и клонируют в бактериальном хозяине с использованием искусственной бактериальной хромосомы. Поскольку несколько копий генома были порезаны в случайном порядке, фрагменты, содержащиеся в этих клонах имеют разные концы, и платформа перекрытия искусственной бактериальной хромомсомы имеет достаточное покрытие, которое теоретически охватывает весь возможный геном. Эта платформа носит название - покрытая часть.

После того как покрытая часть найдена, последовательность которая формирует эту часть, режется случайным образом на более мелкие фрагменты, которые могут быть секвенированы с использованием метода дробовика в меньшем масштабе.

Несмотря на это, полные последовательности перекрытия бактериального искусственного генома не известны, в то время как известны их ориентации относительно друг друга. Есть несколько способов выведения этой части и выбора искусственного бактериального генома, которые составляют покрытую часть. Общая стратегия включает в себя следующие шаги:

1) Определение позиций клонов по отношению друг к другу;

2) Выбрать наименьшее количество клонов, необходимых для формирования непрерывного пласта, который охватывает всю интересующую область. Порядок клонов восстанавливается путем определения перекрытия относительно друг друга.[11]

Перекрытые клоны могут быть идентифицированы несколькими способами. Один из способов – это использование небольшой радиоактивно или химически помеченного зонда, содержащего участок последовательности с метками (STS). Он может быть гибридизирован на микрочипе, на котором напечатаны клоны[11]. Таким образом, все клоны, которые содержат определенную последовательность в геноме, идентифицированы. Конец одного из этих клонов может быть секвенирован с получением нового зонда, и процесс повторяется. Этот метод называется хромосомной ходьбой.

Другой способ идентифицирования клонов заключается в следующем. Производится  сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестрикцирующих нуклеаз позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков[11].

Этот метод геномного отображения называется рестрикционным картированием, поскольку он идентифицирует набор сайтов рестрикции, содержащихся в каждом клоне[10].

Так как этот метод использует изначально создание карты генома с низкой разрешающей способностью, иерархический метод дробовика более трудоемкий, чем метод дробовика целого генома и в большей степени зависит от компьютерных алгоритмов. Процесс создания обширной библиотеки ВАС и выбора покрытой части, делает иерархический метод дробовика медленным и трудоемким. Однако когда эта технология стала доступной, она показала достоверность данных[9], высокую скорость секвенирования и оправданную стоимость для целого генома, благодаря чему метод дробовика стал основным методом секвенирования генома.

Метод дробовика и методы секвенирования нового поколения

Классический метод дробовика был основан на методе Сэнгера: это был наиболее передовой метод для секвенирования геномов приблизительно 1995-2005. Метод дробовика все еще применяется сегодня, однако используются и другие технологии секвенирования, называемые секвенирование нового поколения. Эти технологии производят меньше ридов (где-то от 25-500bp), более сотни тысяч или миллионов просмотров в относительно короткий промежуток времени (порядка суток).[12] Это приводит к высокому уровню охвата, но процесс имеет намного более интенсивные вычисления. Эти технологии значительно превосходят метод Сэнгера из-за большого объема данных и относительно короткого времени, необходимого для определения последовательности целого генома[13].

Напишите отзыв о статье "Метод дробовика"

Примечания

  1. Staden R. EM [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/461197 "A strategy of DNA sequencing employing computer program"] (англ.). — 1979.
  2. Edwards, A; Caskey, T [www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202305801628 "Closure strategies for random DNA sequencing"] (англ.) // A Companion to Methods in Enzymology. — 1991. — Vol. 3, no. 1. — P. 41-47.
  3. Edwards, A; Voss, H.; Rice, P.; Civitello, A.; Stegemann, J.; Schwager, C.; Zimmerman, J.; Erfle, H.; Caskey, T.; Ansorge, W. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2341149 "Automated DNA sequencing of the human HPRT locus"] (англ.) // Genomics. — 1990. — Vol. 6, no. 4. — P. 593-608.
  4. Roach, JC; Boysen, C; Wang, K; Hood, L [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7601461 "Pairwise end sequencing: a unified approach to genomic mapping and sequencing"] (англ.) // Genomics. — 1995. — Vol. 26, no. 2. — P. 345-343.
  5. Fleischmann, RD; et al. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7542800 "Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd"] (англ.) // Science. — 1995. — Vol. 269, no. 5223. — P. 496-512.
  6. Adams, MD; et al. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10731132 "The genome sequence of Drosophila melanogaster"] (англ.) // Science. — 2000. — Vol. 287, no. 5461. — P. 2185–95.
  7. Meyerson, M.; Gabriel, S.; Getz, G. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20847746 "Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing".] (англ.) // Nature Reviews Genetics. — 2010. — Vol. 11, no. 10. — P. 685-696.
  8. Dunham, I. [onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1038/npg.els.0005378/abstract;jsessionid=D8DEF4F6A6E570CA5FA548CF7AB3BC8C.f04t03 Genome Sequencing.] (англ.) // Encyclopedia of Life Sciences. — 2005.
  9. 1 2 3 Venter, J. C. ‘’Shotgunning the Human Genome: A Personal View.’’ (англ.) // Encyclopedia of Life Sciences. — 2006.
  10. 1 2 Gibson, G. and Muse, S. V. A Primer of Genome Science. (англ.) // Encyclopedia of Life Sciences. — 2006. — Vol. 3rd, no. 84.
  11. 1 2 3 Dear, P. H. [onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1038/npg.els.0005353/abstract Genome Mapping.] (англ.) // Encyclopedia of Life Sciences. — 2005.
  12. Karl, V; et al. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19246620 "Next Generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics"] (англ.) // Clinical Chemistry. — 2009. — Vol. 55, no. 4. — P. 41-47.
  13. Metzker, Michael L. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19997069 "Sequencing technologies - the next generation".] (англ.) // Nat Rev Genet. — 2010. — Vol. 11, no. 1. — P. 31-46.

Ссылки

  • [www.the-scientist.com/news/20021231/06 Shotgun sequencing comes of age]. The Scientist. Проверено 5 апреля 2015.
  • [www.spaceref.com/news/viewpr.rss.html?pid=21532 Shotgun sequencing finds nanoorganisms - Probe of acid mine drainage turns up unsuspected virus-sized Archaea]. SpaceRef.com. Проверено 23 декабря 2006. [www.webcitation.org/6HK99eAhG Архивировано из первоисточника 12 июня 2013].
  • [www.cd-genomics.com/gene/shotgun.htm Genomic shotgun sequencing]. biology science. Проверено 11 апреля 2009. [www.webcitation.org/6HK9AmtxZ Архивировано из первоисточника 12 июня 2013].



Отрывок, характеризующий Метод дробовика

В клубе, в угловой комнате, собирались читать эти афиши, и некоторым нравилось, как Карпушка подтрунивал над французами, говоря, что они от капусты раздуются, от каши перелопаются, от щей задохнутся, что они все карлики и что их троих одна баба вилами закинет. Некоторые не одобряли этого тона и говорила, что это пошло и глупо. Рассказывали о том, что французов и даже всех иностранцев Растопчин выслал из Москвы, что между ними шпионы и агенты Наполеона; но рассказывали это преимущественно для того, чтобы при этом случае передать остроумные слова, сказанные Растопчиным при их отправлении. Иностранцев отправляли на барке в Нижний, и Растопчин сказал им: «Rentrez en vous meme, entrez dans la barque et n'en faites pas une barque ne Charon». [войдите сами в себя и в эту лодку и постарайтесь, чтобы эта лодка не сделалась для вас лодкой Харона.] Рассказывали, что уже выслали из Москвы все присутственные места, и тут же прибавляли шутку Шиншина, что за это одно Москва должна быть благодарна Наполеону. Рассказывали, что Мамонову его полк будет стоить восемьсот тысяч, что Безухов еще больше затратил на своих ратников, но что лучше всего в поступке Безухова то, что он сам оденется в мундир и поедет верхом перед полком и ничего не будет брать за места с тех, которые будут смотреть на него.
– Вы никому не делаете милости, – сказала Жюли Друбецкая, собирая и прижимая кучку нащипанной корпии тонкими пальцами, покрытыми кольцами.
Жюли собиралась на другой день уезжать из Москвы и делала прощальный вечер.
– Безухов est ridicule [смешон], но он так добр, так мил. Что за удовольствие быть так caustique [злоязычным]?
– Штраф! – сказал молодой человек в ополченском мундире, которого Жюли называла «mon chevalier» [мой рыцарь] и который с нею вместе ехал в Нижний.
В обществе Жюли, как и во многих обществах Москвы, было положено говорить только по русски, и те, которые ошибались, говоря французские слова, платили штраф в пользу комитета пожертвований.
– Другой штраф за галлицизм, – сказал русский писатель, бывший в гостиной. – «Удовольствие быть не по русски.
– Вы никому не делаете милости, – продолжала Жюли к ополченцу, не обращая внимания на замечание сочинителя. – За caustique виновата, – сказала она, – и плачу, но за удовольствие сказать вам правду я готова еще заплатить; за галлицизмы не отвечаю, – обратилась она к сочинителю: – у меня нет ни денег, ни времени, как у князя Голицына, взять учителя и учиться по русски. А вот и он, – сказала Жюли. – Quand on… [Когда.] Нет, нет, – обратилась она к ополченцу, – не поймаете. Когда говорят про солнце – видят его лучи, – сказала хозяйка, любезно улыбаясь Пьеру. – Мы только говорили о вас, – с свойственной светским женщинам свободой лжи сказала Жюли. – Мы говорили, что ваш полк, верно, будет лучше мамоновского.
– Ах, не говорите мне про мой полк, – отвечал Пьер, целуя руку хозяйке и садясь подле нее. – Он мне так надоел!
– Вы ведь, верно, сами будете командовать им? – сказала Жюли, хитро и насмешливо переглянувшись с ополченцем.
Ополченец в присутствии Пьера был уже не так caustique, и в лице его выразилось недоуменье к тому, что означала улыбка Жюли. Несмотря на свою рассеянность и добродушие, личность Пьера прекращала тотчас же всякие попытки на насмешку в его присутствии.
– Нет, – смеясь, отвечал Пьер, оглядывая свое большое, толстое тело. – В меня слишком легко попасть французам, да и я боюсь, что не влезу на лошадь…
В числе перебираемых лиц для предмета разговора общество Жюли попало на Ростовых.
– Очень, говорят, плохи дела их, – сказала Жюли. – И он так бестолков – сам граф. Разумовские хотели купить его дом и подмосковную, и все это тянется. Он дорожится.
– Нет, кажется, на днях состоится продажа, – сказал кто то. – Хотя теперь и безумно покупать что нибудь в Москве.
– Отчего? – сказала Жюли. – Неужели вы думаете, что есть опасность для Москвы?
– Отчего же вы едете?
– Я? Вот странно. Я еду, потому… ну потому, что все едут, и потом я не Иоанна д'Арк и не амазонка.
– Ну, да, да, дайте мне еще тряпочек.
– Ежели он сумеет повести дела, он может заплатить все долги, – продолжал ополченец про Ростова.
– Добрый старик, но очень pauvre sire [плох]. И зачем они живут тут так долго? Они давно хотели ехать в деревню. Натали, кажется, здорова теперь? – хитро улыбаясь, спросила Жюли у Пьера.
– Они ждут меньшого сына, – сказал Пьер. – Он поступил в казаки Оболенского и поехал в Белую Церковь. Там формируется полк. А теперь они перевели его в мой полк и ждут каждый день. Граф давно хотел ехать, но графиня ни за что не согласна выехать из Москвы, пока не приедет сын.
– Я их третьего дня видела у Архаровых. Натали опять похорошела и повеселела. Она пела один романс. Как все легко проходит у некоторых людей!
– Что проходит? – недовольно спросил Пьер. Жюли улыбнулась.
– Вы знаете, граф, что такие рыцари, как вы, бывают только в романах madame Suza.
– Какой рыцарь? Отчего? – краснея, спросил Пьер.
– Ну, полноте, милый граф, c'est la fable de tout Moscou. Je vous admire, ma parole d'honneur. [это вся Москва знает. Право, я вам удивляюсь.]
– Штраф! Штраф! – сказал ополченец.
– Ну, хорошо. Нельзя говорить, как скучно!
– Qu'est ce qui est la fable de tout Moscou? [Что знает вся Москва?] – вставая, сказал сердито Пьер.
– Полноте, граф. Вы знаете!
– Ничего не знаю, – сказал Пьер.
– Я знаю, что вы дружны были с Натали, и потому… Нет, я всегда дружнее с Верой. Cette chere Vera! [Эта милая Вера!]
– Non, madame, [Нет, сударыня.] – продолжал Пьер недовольным тоном. – Я вовсе не взял на себя роль рыцаря Ростовой, и я уже почти месяц не был у них. Но я не понимаю жестокость…
– Qui s'excuse – s'accuse, [Кто извиняется, тот обвиняет себя.] – улыбаясь и махая корпией, говорила Жюли и, чтобы за ней осталось последнее слово, сейчас же переменила разговор. – Каково, я нынче узнала: бедная Мари Волконская приехала вчера в Москву. Вы слышали, она потеряла отца?
– Неужели! Где она? Я бы очень желал увидать ее, – сказал Пьер.
– Я вчера провела с ней вечер. Она нынче или завтра утром едет в подмосковную с племянником.
– Ну что она, как? – сказал Пьер.
– Ничего, грустна. Но знаете, кто ее спас? Это целый роман. Nicolas Ростов. Ее окружили, хотели убить, ранили ее людей. Он бросился и спас ее…
– Еще роман, – сказал ополченец. – Решительно это общее бегство сделано, чтобы все старые невесты шли замуж. Catiche – одна, княжна Болконская – другая.
– Вы знаете, что я в самом деле думаю, что она un petit peu amoureuse du jeune homme. [немножечко влюблена в молодого человека.]
– Штраф! Штраф! Штраф!
– Но как же это по русски сказать?..


Когда Пьер вернулся домой, ему подали две принесенные в этот день афиши Растопчина.
В первой говорилось о том, что слух, будто графом Растопчиным запрещен выезд из Москвы, – несправедлив и что, напротив, граф Растопчин рад, что из Москвы уезжают барыни и купеческие жены. «Меньше страху, меньше новостей, – говорилось в афише, – но я жизнью отвечаю, что злодей в Москве не будет». Эти слова в первый раз ясно ыоказали Пьеру, что французы будут в Москве. Во второй афише говорилось, что главная квартира наша в Вязьме, что граф Витгснштейн победил французов, но что так как многие жители желают вооружиться, то для них есть приготовленное в арсенале оружие: сабли, пистолеты, ружья, которые жители могут получать по дешевой цене. Тон афиш был уже не такой шутливый, как в прежних чигиринских разговорах. Пьер задумался над этими афишами. Очевидно, та страшная грозовая туча, которую он призывал всеми силами своей души и которая вместе с тем возбуждала в нем невольный ужас, – очевидно, туча эта приближалась.
«Поступить в военную службу и ехать в армию или дожидаться? – в сотый раз задавал себе Пьер этот вопрос. Он взял колоду карт, лежавших у него на столе, и стал делать пасьянс.
– Ежели выйдет этот пасьянс, – говорил он сам себе, смешав колоду, держа ее в руке и глядя вверх, – ежели выйдет, то значит… что значит?.. – Он не успел решить, что значит, как за дверью кабинета послышался голос старшей княжны, спрашивающей, можно ли войти.
– Тогда будет значить, что я должен ехать в армию, – договорил себе Пьер. – Войдите, войдите, – прибавил он, обращаясь к княжие.
(Одна старшая княжна, с длинной талией и окаменелым лидом, продолжала жить в доме Пьера; две меньшие вышли замуж.)
– Простите, mon cousin, что я пришла к вам, – сказала она укоризненно взволнованным голосом. – Ведь надо наконец на что нибудь решиться! Что ж это будет такое? Все выехали из Москвы, и народ бунтует. Что ж мы остаемся?
– Напротив, все, кажется, благополучно, ma cousine, – сказал Пьер с тою привычкой шутливости, которую Пьер, всегда конфузно переносивший свою роль благодетеля перед княжною, усвоил себе в отношении к ней.
– Да, это благополучно… хорошо благополучие! Мне нынче Варвара Ивановна порассказала, как войска наши отличаются. Уж точно можно чести приписать. Да и народ совсем взбунтовался, слушать перестают; девка моя и та грубить стала. Этак скоро и нас бить станут. По улицам ходить нельзя. А главное, нынче завтра французы будут, что ж нам ждать! Я об одном прошу, mon cousin, – сказала княжна, – прикажите свезти меня в Петербург: какая я ни есть, а я под бонапартовской властью жить не могу.
– Да полноте, ma cousine, откуда вы почерпаете ваши сведения? Напротив…
– Я вашему Наполеону не покорюсь. Другие как хотят… Ежели вы не хотите этого сделать…
– Да я сделаю, я сейчас прикажу.
Княжне, видимо, досадно было, что не на кого было сердиться. Она, что то шепча, присела на стул.
– Но вам это неправильно доносят, – сказал Пьер. – В городе все тихо, и опасности никакой нет. Вот я сейчас читал… – Пьер показал княжне афишки. – Граф пишет, что он жизнью отвечает, что неприятель не будет в Москве.
– Ах, этот ваш граф, – с злобой заговорила княжна, – это лицемер, злодей, который сам настроил народ бунтовать. Разве не он писал в этих дурацких афишах, что какой бы там ни был, тащи его за хохол на съезжую (и как глупо)! Кто возьмет, говорит, тому и честь и слава. Вот и долюбезничался. Варвара Ивановна говорила, что чуть не убил народ ее за то, что она по французски заговорила…
– Да ведь это так… Вы всё к сердцу очень принимаете, – сказал Пьер и стал раскладывать пасьянс.
Несмотря на то, что пасьянс сошелся, Пьер не поехал в армию, а остался в опустевшей Москве, все в той же тревоге, нерешимости, в страхе и вместе в радости ожидая чего то ужасного.
На другой день княжна к вечеру уехала, и к Пьеру приехал его главноуправляющий с известием, что требуемых им денег для обмундирования полка нельзя достать, ежели не продать одно имение. Главноуправляющий вообще представлял Пьеру, что все эти затеи полка должны были разорить его. Пьер с трудом скрывал улыбку, слушая слова управляющего.
– Ну, продайте, – говорил он. – Что ж делать, я не могу отказаться теперь!
Чем хуже было положение всяких дел, и в особенности его дел, тем Пьеру было приятнее, тем очевиднее было, что катастрофа, которой он ждал, приближается. Уже никого почти из знакомых Пьера не было в городе. Жюли уехала, княжна Марья уехала. Из близких знакомых одни Ростовы оставались; но к ним Пьер не ездил.
В этот день Пьер, для того чтобы развлечься, поехал в село Воронцово смотреть большой воздушный шар, который строился Леппихом для погибели врага, и пробный шар, который должен был быть пущен завтра. Шар этот был еще не готов; но, как узнал Пьер, он строился по желанию государя. Государь писал графу Растопчину об этом шаре следующее:
«Aussitot que Leppich sera pret, composez lui un equipage pour sa nacelle d'hommes surs et intelligents et depechez un courrier au general Koutousoff pour l'en prevenir. Je l'ai instruit de la chose.
Recommandez, je vous prie, a Leppich d'etre bien attentif sur l'endroit ou il descendra la premiere fois, pour ne pas se tromper et ne pas tomber dans les mains de l'ennemi. Il est indispensable qu'il combine ses mouvements avec le general en chef».
[Только что Леппих будет готов, составьте экипаж для его лодки из верных и умных людей и пошлите курьера к генералу Кутузову, чтобы предупредить его.
Я сообщил ему об этом. Внушите, пожалуйста, Леппиху, чтобы он обратил хорошенько внимание на то место, где он спустится в первый раз, чтобы не ошибиться и не попасть в руки врага. Необходимо, чтоб он соображал свои движения с движениями главнокомандующего.]
Возвращаясь домой из Воронцова и проезжая по Болотной площади, Пьер увидал толпу у Лобного места, остановился и слез с дрожек. Это была экзекуция французского повара, обвиненного в шпионстве. Экзекуция только что кончилась, и палач отвязывал от кобылы жалостно стонавшего толстого человека с рыжими бакенбардами, в синих чулках и зеленом камзоле. Другой преступник, худенький и бледный, стоял тут же. Оба, судя по лицам, были французы. С испуганно болезненным видом, подобным тому, который имел худой француз, Пьер протолкался сквозь толпу.
– Что это? Кто? За что? – спрашивал он. Но вниманье толпы – чиновников, мещан, купцов, мужиков, женщин в салопах и шубках – так было жадно сосредоточено на то, что происходило на Лобном месте, что никто не отвечал ему. Толстый человек поднялся, нахмурившись, пожал плечами и, очевидно, желая выразить твердость, стал, не глядя вокруг себя, надевать камзол; но вдруг губы его задрожали, и он заплакал, сам сердясь на себя, как плачут взрослые сангвинические люди. Толпа громко заговорила, как показалось Пьеру, – для того, чтобы заглушить в самой себе чувство жалости.
– Повар чей то княжеский…
– Что, мусью, видно, русский соус кисел французу пришелся… оскомину набил, – сказал сморщенный приказный, стоявший подле Пьера, в то время как француз заплакал. Приказный оглянулся вокруг себя, видимо, ожидая оценки своей шутки. Некоторые засмеялись, некоторые испуганно продолжали смотреть на палача, который раздевал другого.
Пьер засопел носом, сморщился и, быстро повернувшись, пошел назад к дрожкам, не переставая что то бормотать про себя в то время, как он шел и садился. В продолжение дороги он несколько раз вздрагивал и вскрикивал так громко, что кучер спрашивал его: