Пиросеквенирование

Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путём синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов. Технология была разработана Полом Ниреном (Pål Nyrén) и его студентом Мустафой Ронаги, в Королевском Техническом Институте (Стокгольм) в 1996 году.

Процедура

«Секвенирование путём синтеза» заключается в том, что для секвенирования одноцепочечной ДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путём синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.

Матрица одноцепочечной ДНК гибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатами (APS) и люциферином.

1. Добавление одного из четырёх дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP)(в случае dATP добавляют dATPαS, который не является субстратом для люциферазы) инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезоксинуклеотид в цепочку. При этом стехиометрически высвобождается пирофосфат (PPi).
2. Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат (АТФ) в присутствии аденозин-5´-фосфосульфата. АТФ выступает «топливом» для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ. Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой.
3. Невключённые нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.

В настоящий момент существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300—500 нуклеотидов, что короче, чем 800—1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида.

Коммерциализация

Компания «Pyrosequencing AB», которая располагается в Уппсале, Швеция, коммерциализовала технологию и реагенты для секвенирования коротких участков ДНК. В 2003 году «Pyrosequencing AB» переименована в «Biotage». В 2008 году Qiagen приобрел Biotage. Далее технология пиросеквенирования была лицензирована 454 Life Sciences. 454 разработала технологию пиросеквенирования, которая взяла начало от высокоэффективного секвенирования (High-throughput sequencing). Наиболее значимы приложения для секвенирования геномов и метагеномики. «GS FLX», наиболее крупная платформа 454 Life Sciences (в настоящее время приобретена Roche Diagnostics), может получать информацию о 400 миллионах нуклеотидах за 10-часовой период работы на одной установке. Каждый раунд работы стоит порядка пяти-семи тысяч долларов, что эквивалентно стоимости секвенирования генома млекопитающего в миллион долларов.

Литература

• Ronaghi M. (January 2001). «[genome.cshlp.org/cgi/reprint/11/1/3.pdf Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing]» (PDF). Genome Research 11: 3–11. DOI:10.1101/gr.11.1.3. PMID 11156611.
• Ronaghi et al. (2000). «Improved performance of Pyrosequencing using single-stranded DNA-binding protein». Analytical Biochemistry 286: 282. DOI:10.1006/abio.2000.4808. PMID 11067751.
• Elahi et al. (2004). «Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis». Methods Mol Biol 255: 211–219. PMID 15020827.
• Gharizadeh et al. (2002). «Long-read pyrosequencing using pure 2'-deoxyadenosine-5'-O'-(1-thiotriphosphate) Sp-isomer». Anal Biochem 301: 82. DOI:10.1006/abio.2001.5494. PMID 11811970.
• Fakhrai-Rad et al. (2002). «Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms». Hum Mutat. 19: 479. DOI:10.1002/humu.10078. PMID 11968080.

Отрывок, характеризующий Пиросеквенирование

– Qu'est ce que c'est? [Что это?] – спросил кто то из другой комнаты.
– Encore un petitionnaire, [Еще один проситель,] – отвечал человек в помочах.
– Скажите ему, что после. Сейчас выйдет, надо ехать.
– После, после, завтра. Поздно…
Ростов повернулся и хотел выйти, но человек в помочах остановил его.
– От кого? Вы кто?
– От майора Денисова, – отвечал Ростов.
– Вы кто? офицер?
– Поручик, граф Ростов.
– Какая смелость! По команде подайте. А сами идите, идите… – И он стал надевать подаваемый камердинером мундир.
Ростов вышел опять в сени и заметил, что на крыльце было уже много офицеров и генералов в полной парадной форме, мимо которых ему надо было пройти.
Проклиная свою смелость, замирая от мысли, что всякую минуту он может встретить государя и при нем быть осрамлен и выслан под арест, понимая вполне всю неприличность своего поступка и раскаиваясь в нем, Ростов, опустив глаза, пробирался вон из дома, окруженного толпой блестящей свиты, когда чей то знакомый голос окликнул его и чья то рука остановила его.
– Вы, батюшка, что тут делаете во фраке? – спросил его басистый голос.
Это был кавалерийский генерал, в эту кампанию заслуживший особенную милость государя, бывший начальник дивизии, в которой служил Ростов.
Ростов испуганно начал оправдываться, но увидав добродушно шутливое лицо генерала, отойдя к стороне, взволнованным голосом передал ему всё дело, прося заступиться за известного генералу Денисова. Генерал выслушав Ростова серьезно покачал головой.
– Жалко, жалко молодца; давай письмо.
Едва Ростов успел передать письмо и рассказать всё дело Денисова, как с лестницы застучали быстрые шаги со шпорами и генерал, отойдя от него, подвинулся к крыльцу. Господа свиты государя сбежали с лестницы и пошли к лошадям. Берейтор Эне, тот самый, который был в Аустерлице, подвел лошадь государя, и на лестнице послышался легкий скрип шагов, которые сейчас узнал Ростов. Забыв опасность быть узнанным, Ростов подвинулся с несколькими любопытными из жителей к самому крыльцу и опять, после двух лет, он увидал те же обожаемые им черты, то же лицо, тот же взгляд, ту же походку, то же соединение величия и кротости… И чувство восторга и любви к государю с прежнею силою воскресло в душе Ростова. Государь в Преображенском мундире, в белых лосинах и высоких ботфортах, с звездой, которую не знал Ростов (это была legion d'honneur) [звезда почетного легиона] вышел на крыльцо, держа шляпу под рукой и надевая перчатку. Он остановился, оглядываясь и всё освещая вокруг себя своим взглядом. Кое кому из генералов он сказал несколько слов. Он узнал тоже бывшего начальника дивизии Ростова, улыбнулся ему и подозвал его к себе.
Вся свита отступила, и Ростов видел, как генерал этот что то довольно долго говорил государю.
Государь сказал ему несколько слов и сделал шаг, чтобы подойти к лошади. Опять толпа свиты и толпа улицы, в которой был Ростов, придвинулись к государю. Остановившись у лошади и взявшись рукою за седло, государь обратился к кавалерийскому генералу и сказал громко, очевидно с желанием, чтобы все слышали его.
– Не могу, генерал, и потому не могу, что закон сильнее меня, – сказал государь и занес ногу в стремя. Генерал почтительно наклонил голову, государь сел и поехал галопом по улице. Ростов, не помня себя от восторга, с толпою побежал за ним.


На площади куда поехал государь, стояли лицом к лицу справа батальон преображенцев, слева батальон французской гвардии в медвежьих шапках.
В то время как государь подъезжал к одному флангу баталионов, сделавших на караул, к противоположному флангу подскакивала другая толпа всадников и впереди их Ростов узнал Наполеона. Это не мог быть никто другой. Он ехал галопом в маленькой шляпе, с Андреевской лентой через плечо, в раскрытом над белым камзолом синем мундире, на необыкновенно породистой арабской серой лошади, на малиновом, золотом шитом, чепраке. Подъехав к Александру, он приподнял шляпу и при этом движении кавалерийский глаз Ростова не мог не заметить, что Наполеон дурно и не твердо сидел на лошади. Батальоны закричали: Ура и Vive l'Empereur! [Да здравствует Император!] Наполеон что то сказал Александру. Оба императора слезли с лошадей и взяли друг друга за руки. На лице Наполеона была неприятно притворная улыбка. Александр с ласковым выражением что то говорил ему.
Ростов не спуская глаз, несмотря на топтание лошадьми французских жандармов, осаживавших толпу, следил за каждым движением императора Александра и Бонапарте. Его, как неожиданность, поразило то, что Александр держал себя как равный с Бонапарте, и что Бонапарте совершенно свободно, как будто эта близость с государем естественна и привычна ему, как равный, обращался с русским царем.
Александр и Наполеон с длинным хвостом свиты подошли к правому флангу Преображенского батальона, прямо на толпу, которая стояла тут. Толпа очутилась неожиданно так близко к императорам, что Ростову, стоявшему в передних рядах ее, стало страшно, как бы его не узнали.
– Sire, je vous demande la permission de donner la legion d'honneur au plus brave de vos soldats, [Государь, я прошу у вас позволенья дать орден Почетного легиона храбрейшему из ваших солдат,] – сказал резкий, точный голос, договаривающий каждую букву. Это говорил малый ростом Бонапарте, снизу прямо глядя в глаза Александру. Александр внимательно слушал то, что ему говорили, и наклонив голову, приятно улыбнулся.