Пространственное выравнивание

Простра́нственное выра́внивание — способ установления гомологии между двумя или более полимерными структурами на основании их трёхмерной структуры. Этот процесс обычно применяется к третичной структуре белков, но может также использоваться и для больших молекул РНК. В противоположность простому наложению структур, когда известно по крайней мере несколько эквивалентных аминокислотных остатков, пространственное выравнивание не требует никаких предварительных данных, кроме координат атомов.

Пространственное выравнивание подходит для сравнения белков с непохожими последовательностями, когда эволюционные отношения не могут быть установлены стандартными методами выравнивания последовательностей, но в этом случае необходимо принимать во внимание влияние конвергентной эволюции.

Пространственное выравнивание позволяет сравнивать две и более молекулы, для которых известны трехмерные структуры. Два основных метода их получения — рентгеноструктурный анализ и ЯМР-спектроскопия. Для пространственного выравнивания можно также использовать структуры, полученные методами предсказания структуры белка. Пространственные выравнивания особенно важны для анализа данных, полученных методами структурной геномики и протеомики, они также могут использоваться для оценки выравниваний, полученных путём сравнения последовательностей.

Данные, получаемые путём структурного выравнивания

Результатом работы программ структурного выравнивания, как правило, является совмещение наборов координат атомов и наименьшее среднеквадратическое отклонение (RMSD) между структурами. Кроме того, могут быть рассчитаны и более сложные параметры, оценивающие структурное сходство, например, тест глобальных расстояний. RMSD указывает на степень расхождения выравниваемых структур. Структурное выравнивание может быть затруднено из-за наличия нескольких доменов в структуре выравниваемых белков, так как изменения в относительном расположении этих доменов между двумя структурами могут искусственно изменять значение RMSD. Из структурного выравнивания непосредственно вытекает соответствующее одномерное выравнивание последовательностей, кроме того, на его основании можно рассчитать долю аминокислотных остатков, идентичных между двумя белками.

Типы сравнений

Для создания структурного выравнивания и подсчёта соответствующих значений RMSD могут быть использованы как все атомы, входящие в молекулу белка, так и их подмножества. Например, атомы боковых радикалов аминокислотных остатков учитываются не всегда, и для выравнивания могут использоваться только атомы, входящие в пептидный остов молекулы. Такой вариант выбирают, если у выравниваемых структур очень разная аминокислотная последовательность и боковые радикалы различаются у большого числа остатков. По этой причине по умолчанию методы пространственного выравнивания используют только атомы остова, вовлечённые в пептидную связь. Для большего упрощения и увеличения эффективности часто используется положение только альфа-атомов углерода, так как их положение достаточно точно определяет положение атомов полипептидного остова. Только при выравнивании очень похожих или даже идентичных структур важно учитывать позиции атомов боковых цепей. В этом случае RMSD отражает не только схожесть конформации белкового остова, но и ротамерные состояния боковых цепей. Другие способы, позволяющие снизить шум и увеличить число правильных сопоставлений, используют разметку элементов вторичной структуры, карты нативных контактов или паттерны взаимодействия остатков, меры степени упаковки боковых цепей и меры сохранения водородных связей.

Самый простой способ сравнить две структуры не требует выравнивания самих структур, а использует выравнивание последовательностей. Оно определяет, какие пары аминокислотных остатков сопоставлены друг другу, и затем только они используются для подсчёта RMSD. Наложение структур обычно используется для сравнения нескольких конформаций одного белка (в этом случае даже не нужно выравнивать последовательности) и для оценки качества выравниваний последовательностей, если для них известны структуры. Традиционно при наложении структур используется простой метод наименьших квадратов, в котором оптимальные повороты и трансляции находят через минимизацию суммы квадратов расстояний между всеми структурами в наложении. В недавнее время подобный поиск стал более точным благодаря методам максимального правдоподобия и байесовским методам.

Алгоритмы, основанные на многомерных поворотах и модифицированных кватернионах, были разработаны для определения топологических отношений между структурами белков без построения выравнивания последовательностей. Такие алгоритмы успешно определили канонические укладки, такие как четырёхспиральный пучок. Метод [wishart.biology.ualberta.ca/SuperPose/ SuperPose] позволяет учитывать относительные вращения доменов и другие сложные моменты структурного выравнивания.

Представление структур

Для того чтобы сравнивать структуры белков, нужно представить их в пространстве, которое не зависит от координат. Это обычно достигается с помощью матрицы «последовательность против последовательности» или серии матриц, которые включают меры сравнения, относящиеся к фиксированному пространству координат, а не абсолютные расстояния. Очевидным способом подобного представления является матрица расстояний, которая представляет собой двумерную матрицу, содержащую все попарные расстояния между некоторым набором атомов в каждой структуре (например, альфа-атомами углерода). Размерность такой матрицы с увеличением числа одновременно сравниваемых структур растёт. Представив белок в виде крупных частей, таких как элементы вторичной структуры (SSEs) или другие структурные фрагменты, тоже можно получить разумное выравнивание, несмотря на потерю информации от неучтенных расстояний, так как не будет учитываться и шум от них. Таким образом, выбор способа представления белка для облегчения вычислений является критическим для разработки эффективного алгоритма выравнивания.

Вычислительная сложность

Оптимальное решение

Было показано, что оптимальное «протягивание» белковой последовательности через известную структуру и построение оптимального множественного выравнивания последовательностей являются NP-полными задачами. Однако обычная задача структурного выравнивания не является NP-полной. Строго говоря, оптимальное решение задачи структурного выравнивания белков известно только для некоторых мер сходства белковых структур — например, мер, используемых в задачах предсказания структуры белка GDT_TS и MaxSub. Такие меры могут быть оптимизированы, используя алгоритм, способный максимизировать число атомов в двух белках, которые могут быть совмещены, так как удовлетворяют предустановленному порогу на расстояние между ними. К сожалению, алгоритм оптимального выравнивания непрактичен, так как время его работы зависит не только от длин последовательностей, но и от геометрии выравниваемых белков.

Приближенное решение

Были разработаны и приближённые алгоритмы структурного выравнивания, работающие полиномиальное время и выдающие целое семейство «оптимальных» решений в пределах параметра приближения для заданной функции счёта. Хотя теоретически задача приближённого структурного выравнивания белков легко даётся таким алгоритмам, они всё равно являются вычислительно затратными для масштабного анализа белковых структур. Как следствие, не существует практичных алгоритмов, которые с заданной функцией счёта сходились бы к глобальному решению выравнивания. По этой причине большинство алгоритмов являются эвристическими, но всё же были разработаны практичные алгоритмы, которые гарантируют схождение хотя бы к локальной максимизации функции счёта.

Методы

Структурное выравнивание используется как при сравнении отдельных структур или их наборов, так и при создании баз данных сравнений «все-против-всех» («all-to-all»), которые отражают различия между каждой парой структур, присутствующих в Protein Data Bank (PDB). Такие базы данных обычно используются для классификации белков по их укладке.

DALI

Одним из популярных методов структурного выравнивания является DALI (англ. distance alignment matrix method — метод с использованием матрицы дистанционных выравниваний). В нём исходные структуры белков разбиваются на гексапептиды и через оценку паттернов контактов между фрагментами рассчитывается матрица расстояний. Элементы вторичной структуры, остатки которых являются соседними в последовательности, оказываются на главной диагонали матрицы; остальные диагонали матрицы отражают пространственные контакты между остатками, которые в последовательности не находятся рядом друг с другом. Если эти диагонали параллельны главной диагонали, то элементы вторичной структуры, которые они представляют, тоже параллельны; если они, напротив, перпендикулярны ей, то их элементы вторичной структуры антипараллельны. Такое представление интенсивно работает с памятью, так как используемая матрица симметрична относительно главной диагонали (и потому избыточна).

Когда матрицы расстояний двух белков имеют одинаковые или похожие элементы примерно на одинаковых позициях, можно сказать, что белки имеют схожую укладку и их элементы вторичной структуры соединены петлями примерно одинаковой длины. Непосредственный процесс выравнивания DALI заключается в поиске схожестей матриц, построенных для двух белков; обычно это осуществляется с помощью серии перекрывающихся подматриц размера 6 × 6. Соответствия подматриц потом пересобираются в конечное выравнивание с помощью стандартного алгоритма максимизации счёта. Оригинальная версия DALI использует симуляцию Монте-Карло для максимизации значения пространственной схожести, являющегося функцией от расстояний между предполагаемыми соответствующими атомами. В частности, вес более отдалённых атомов внутри соответствующих элементов структуры экспоненциально занижается, чтобы уменьшить шум, вызванный подвижностью петель, искривлением спиралей и другими мелкими вариациями структур. Поскольку DALI основан на матрице расстояний типа «все-против-всех», метод может учитывать расположение элементов структур в различном порядке в двух сравниваемых последовательностях.

Метод DALI был использован для создания базы данных FSSP (англ. Families of Structurally Similar Proteins), в которой все известные структуры белков были попарно выровнены для определения их пространственного родства и классификации укладок.

[ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/start DaliLite] является скачиваемой программой, использующей алгоритм DALI.

Комбинаторное расширение

Метод комбинаторного расширения (англ. Combinational extension (СЕ)) похож на DALI тем, что тоже разбивает каждую структуру на ряд фрагментов, которые затем пытается заново собрать в полное выравнивание. Серия попарных сочетаний фрагментов, называемых AFP (англ. aligned fragment pairs — пары выровненных фрагментов), используется для задания матрицы сходства, через которую прокладывается оптимальный путь для определения конечного выравнивания. Только те AFP, которые удовлетворяют заданным критериям локального сходства, включаются в матрицу, что сокращает необходимое пространство поиска и увеличивает эффективность. Возможны разные меры сходства; в первоначальном виде метод CE использовал только структурные совмещения и расстояния между остатками, но со временем был расширен для использования локальных свойств, таких как вторичная структура, доступность растворителя, паттерны водородных связей и двугранные углы.

Путь, соответствующий выравниванию, рассчитывается как оптимальный путь через матрицу сходства с помощью линейного прохода через последовательности, расширяя выравнивание следующей возможной AFP с высоким счётом. Начальная AFP, инициирующая выравнивание, может быть выбрана в любой точке матрицы последовательностей. Далее происходит расширение на AFP, которая удовлетворяет заданному критерию на расстояние, ограничивающему размер гэпов (разрывов) в выравнивании. Размер каждой AFP и наибольшая длина гэпа являются необходимыми входными параметрами, но обычно устанавливаются равными эмпирически определённым значениям 8 и 30 соответственно. Подобно DALI или SSAP, CE использовался для создания базы данных классификации укладок на основе известных пространственных структур белков из PDB. Недавно PDB выпустил обновлённую версию CE, которая может определять циклические перестановки в структуре белков.

SSAP

Метод SSAP (англ. Sequential Structure Alignment Program) использует двойное динамическое программирование для построения структурного выравнивания, основанного на векторах «от атома к атому» в пространстве структур. Вместо альфа-атомов углерода, обычно используемых в структурных выравниваниях, SSAP задаёт свои вектора из бета-атомов для всех аминокислотных остатков за исключением глицина. Таким образом, этот метод учитывает положение ротамера каждого остатка, также как и их положение в остове. Сначала SSAP для каждого белка строит серию векторов расстояний между каждым остатком и его ближайшим, но не смежным в последовательности соседом. После этого конструируется ряд матриц, содержащих разницу векторов между соседями для каждой пары остатков, для которых строились вектора. Для каждой получившейся матрицы с помощью динамического программирования определяется ряд оптимальных локальных выравниваний. Затем полученные выравнивания складываются в обобщённую матрицу, к которой снова применяется динамическое программирование для определения полного структурного выравнивания. Изначально SSAP создавал только попарные выравнивания, но в дальнейшем был расширен и для создания множественных выравниваний. Он был применён для выравнивания типа «все-против-всех» для создания иерархической системы классификации укладок, известной как CATH, которая используется в базе данных [www.cathdb.info/latest/index.html CATH Protein Structure Classification].

Недавние разработки

Усовершенствование методов пространственного выравнивания остаётся активно исследуемой областью. Новые или модифицированные методы часто имеют преимущества над более старыми и широко распространенными техниками. Один из недавних примеров — программа ТМ-align, использующая новый метод для взвешивания матрицы расстояний, к которой потом применяется динамическое программирование. Взвешивание ускоряет сходимость динамического программирования и корректирует эффект от длины выравнивания. Тесты показали, что ТМ-align работает с более высокой точностью и скоростью, чем DALI и CE.

Однако с новыми алгоритмическими продвижениями и развитием вычислительных мощностей стало ясно, что нет универсального критерия для оптимального выравнивания. Поэтому недавние разработки сфокусированы на оптимизации конкретных параметров, таких как скорость, вычисление счетов, корреляция с альтернативными золотыми стандартами или устойчивость к погрешностям структурных данных или ab initio структурных моделей. Альтернативная методология, набирающая популярность — использование консенсуса множества методов, чтобы уточнить структурные сходства белков.

Гибкое выравнивание

Стандартные алгоритмы структурного выравнивания подразумевают жёсткость выравниваемых структур, что не отражает биологической реальности. Поэтому были разработаны алгоритмы гибкого выравнивания, которые рассматривают возможность движения двух фрагментов внутри белка относительно друг друга, а также внутренних перестановок фрагментов. Один из таких алгоритмов — FATCAT. Он использует AFP, как и CE (см. соответствующий раздел), и пытается составить из них длинную цепочку, но при этом соединение между соседними AFP считается гибким и алгоритм изгибает его, если это улучшает наложение структур. FATCAT суммирует гэпы, повороты и простые присоединения новых пар к выровненной части в единую функцию счёта и строит выравнивание одновременно с определением участков петель, используя динамическое программирование.

Было показано, что гибкое выравнивание превосходит жёсткое выравнивание с точки зрения геометрического наложения и поиска сходств в структурах.

Непоследовательное выравнивание

Иногда белки могут содержать сходные фрагменты, расположенные в разном порядке, что не учитывается классическими алгоритмами. Методы непоследовательного выравнивания, независимые от порядка расположения элементов структуры, могут обрабатывать такие случаи. Примерами могут служить программы FATCAT, MASS, MultiProt.

Выравнивание молекулярных комплексов

В некоторых случаях есть необходимость сравнить структуры не одиночных молекул белка, а комплексов белков с белками или нуклеиновыми кислотами. Построение таких выравниваний затруднено по нескольким причинам. Во-первых, часто выровненные участки разбросаны по всему комплексу, тогда как конкретные цепи выровнены лишь частично. Во-вторых, необходимо учитывать подвижность белковых цепей, перемещения доменов и перестановки субъединиц. В-третьих, в комплексах встречаются повторы и симметрии, которые не могут быть наложены одновременно. Кроме того, большое количество выравниваемых атомов накладывает дополнительные требования на скорость вычислений. Для выполнения такой задачи алгоритм TopMatch строит точные локальные выравнивания, из которых затем конструируется полное выравнивание. Качество выравнивания оценивается по его длине и по пространственному отклонению выравниваемых структур. Воспользоваться методом можно на веб-сервисе TopMatch.

Выравнивание РНК

Крупные молекулы РНК, как и белковые молекулы, характеризуются сложной пространственной структурой, которая удерживается за счёт спаривания оснований посредством водородных связей и стэкинга. Однако для некодирующих РНК со сходными функциями получить данные геномики очень сложно, поскольку у таких молекул, как и у белков, структура последовательностей гораздо консервативнее, но при этом алфавит РНК существенно меньше (4 нуклеотида вместо 20 аминокислот), поэтому собственная информация любого нуклеотида в любой позиции ниже, чем у аминокислотного остатка.

Впрочем, в связи с возрастающим интересом к РНК и увеличением количества экспериментально установленных 3D структур РНК были разработаны методы оценки структурного сходства РНК. Один из таких методов — [siret.cz/setter/ SETTER] — разбивает каждую РНК-структуру на меньшие фрагменты, называемые общими элементами вторичной структуры (GSSU). GSSU далее подвергаются пространственному выравниванию, и эти частичные выравнивания объединяются в общее выравнивание.

[foldalign.kvl.dk/ FOLDALIGN] — это метод для построения попарных выравниваний молекул РНК с низкой схожестью последовательностей. Этот метод отличается от методов для пространственного выравнивания белков тем, что он сам предсказывает пространственные структуры последовательностей РНК, подаваемых на вход, а не использует подаваемые на вход экспериментально установленные структуры. В то время как задача предсказания фолдинга белка в настоящее время не решена, пространственную структуру молекулы РНК без псевдоузлов предсказать можно.

Отрывок, характеризующий Пространственное выравнивание

Распорядившись таким образом, Денисов намеревался, без донесения о том высшим начальникам, вместе с Долоховым атаковать и взять этот транспорт своими небольшими силами. Транспорт шел 22 октября от деревни Микулиной к деревне Шамшевой. С левой стороны дороги от Микулина к Шамшеву шли большие леса, местами подходившие к самой дороге, местами отдалявшиеся от дороги на версту и больше. По этим то лесам целый день, то углубляясь в середину их, то выезжая на опушку, ехал с партией Денисов, не выпуская из виду двигавшихся французов. С утра, недалеко от Микулина, там, где лес близко подходил к дороге, казаки из партии Денисова захватили две ставшие в грязи французские фуры с кавалерийскими седлами и увезли их в лес. С тех пор и до самого вечера партия, не нападая, следила за движением французов. Надо было, не испугав их, дать спокойно дойти до Шамшева и тогда, соединившись с Долоховым, который должен был к вечеру приехать на совещание к караулке в лесу (в версте от Шамшева), на рассвете пасть с двух сторон как снег на голову и побить и забрать всех разом.
Позади, в двух верстах от Микулина, там, где лес подходил к самой дороге, было оставлено шесть казаков, которые должны были донести сейчас же, как только покажутся новые колонны французов.
Впереди Шамшева точно так же Долохов должен был исследовать дорогу, чтобы знать, на каком расстоянии есть еще другие французские войска. При транспорте предполагалось тысяча пятьсот человек. У Денисова было двести человек, у Долохова могло быть столько же. Но превосходство числа не останавливало Денисова. Одно только, что еще нужно было знать ему, это то, какие именно были эти войска; и для этой цели Денисову нужно было взять языка (то есть человека из неприятельской колонны). В утреннее нападение на фуры дело сделалось с такою поспешностью, что бывших при фурах французов всех перебили и захватили живым только мальчишку барабанщика, который был отсталый и ничего не мог сказать положительно о том, какие были войска в колонне.
Нападать другой раз Денисов считал опасным, чтобы не встревожить всю колонну, и потому он послал вперед в Шамшево бывшего при его партии мужика Тихона Щербатого – захватить, ежели можно, хоть одного из бывших там французских передовых квартиргеров.


Был осенний, теплый, дождливый день. Небо и горизонт были одного и того же цвета мутной воды. То падал как будто туман, то вдруг припускал косой, крупный дождь.
На породистой, худой, с подтянутыми боками лошади, в бурке и папахе, с которых струилась вода, ехал Денисов. Он, так же как и его лошадь, косившая голову и поджимавшая уши, морщился от косого дождя и озабоченно присматривался вперед. Исхудавшее и обросшее густой, короткой, черной бородой лицо его казалось сердито.
Рядом с Денисовым, также в бурке и папахе, на сытом, крупном донце ехал казачий эсаул – сотрудник Денисова.
Эсаул Ловайский – третий, также в бурке и папахе, был длинный, плоский, как доска, белолицый, белокурый человек, с узкими светлыми глазками и спокойно самодовольным выражением и в лице и в посадке. Хотя и нельзя было сказать, в чем состояла особенность лошади и седока, но при первом взгляде на эсаула и Денисова видно было, что Денисову и мокро и неловко, – что Денисов человек, который сел на лошадь; тогда как, глядя на эсаула, видно было, что ему так же удобно и покойно, как и всегда, и что он не человек, который сел на лошадь, а человек вместе с лошадью одно, увеличенное двойною силою, существо.
Немного впереди их шел насквозь промокший мужичок проводник, в сером кафтане и белом колпаке.
Немного сзади, на худой, тонкой киргизской лошаденке с огромным хвостом и гривой и с продранными в кровь губами, ехал молодой офицер в синей французской шинели.
Рядом с ним ехал гусар, везя за собой на крупе лошади мальчика в французском оборванном мундире и синем колпаке. Мальчик держался красными от холода руками за гусара, пошевеливал, стараясь согреть их, свои босые ноги, и, подняв брови, удивленно оглядывался вокруг себя. Это был взятый утром французский барабанщик.
Сзади, по три, по четыре, по узкой, раскиснувшей и изъезженной лесной дороге, тянулись гусары, потом казаки, кто в бурке, кто во французской шинели, кто в попоне, накинутой на голову. Лошади, и рыжие и гнедые, все казались вороными от струившегося с них дождя. Шеи лошадей казались странно тонкими от смокшихся грив. От лошадей поднимался пар. И одежды, и седла, и поводья – все было мокро, склизко и раскисло, так же как и земля, и опавшие листья, которыми была уложена дорога. Люди сидели нахохлившись, стараясь не шевелиться, чтобы отогревать ту воду, которая пролилась до тела, и не пропускать новую холодную, подтекавшую под сиденья, колени и за шеи. В середине вытянувшихся казаков две фуры на французских и подпряженных в седлах казачьих лошадях громыхали по пням и сучьям и бурчали по наполненным водою колеям дороги.
Лошадь Денисова, обходя лужу, которая была на дороге, потянулась в сторону и толканула его коленкой о дерево.
– Э, чег'т! – злобно вскрикнул Денисов и, оскаливая зубы, плетью раза три ударил лошадь, забрызгав себя и товарищей грязью. Денисов был не в духе: и от дождя и от голода (с утра никто ничего не ел), и главное оттого, что от Долохова до сих пор не было известий и посланный взять языка не возвращался.
«Едва ли выйдет другой такой случай, как нынче, напасть на транспорт. Одному нападать слишком рискованно, а отложить до другого дня – из под носа захватит добычу кто нибудь из больших партизанов», – думал Денисов, беспрестанно взглядывая вперед, думая увидать ожидаемого посланного от Долохова.
Выехав на просеку, по которой видно было далеко направо, Денисов остановился.
– Едет кто то, – сказал он.
Эсаул посмотрел по направлению, указываемому Денисовым.
– Едут двое – офицер и казак. Только не предположительно, чтобы был сам подполковник, – сказал эсаул, любивший употреблять неизвестные казакам слова.
Ехавшие, спустившись под гору, скрылись из вида и через несколько минут опять показались. Впереди усталым галопом, погоняя нагайкой, ехал офицер – растрепанный, насквозь промокший и с взбившимися выше колен панталонами. За ним, стоя на стременах, рысил казак. Офицер этот, очень молоденький мальчик, с широким румяным лицом и быстрыми, веселыми глазами, подскакал к Денисову и подал ему промокший конверт.
– От генерала, – сказал офицер, – извините, что не совсем сухо…
Денисов, нахмурившись, взял конверт и стал распечатывать.
– Вот говорили всё, что опасно, опасно, – сказал офицер, обращаясь к эсаулу, в то время как Денисов читал поданный ему конверт. – Впрочем, мы с Комаровым, – он указал на казака, – приготовились. У нас по два писто… А это что ж? – спросил он, увидав французского барабанщика, – пленный? Вы уже в сраженье были? Можно с ним поговорить?
– Ростов! Петя! – крикнул в это время Денисов, пробежав поданный ему конверт. – Да как же ты не сказал, кто ты? – И Денисов с улыбкой, обернувшись, протянул руку офицеру.
Офицер этот был Петя Ростов.
Во всю дорогу Петя приготавливался к тому, как он, как следует большому и офицеру, не намекая на прежнее знакомство, будет держать себя с Денисовым. Но как только Денисов улыбнулся ему, Петя тотчас же просиял, покраснел от радости и, забыв приготовленную официальность, начал рассказывать о том, как он проехал мимо французов, и как он рад, что ему дано такое поручение, и что он был уже в сражении под Вязьмой, и что там отличился один гусар.
– Ну, я г'ад тебя видеть, – перебил его Денисов, и лицо его приняло опять озабоченное выражение.
– Михаил Феоклитыч, – обратился он к эсаулу, – ведь это опять от немца. Он пг'и нем состоит. – И Денисов рассказал эсаулу, что содержание бумаги, привезенной сейчас, состояло в повторенном требовании от генерала немца присоединиться для нападения на транспорт. – Ежели мы его завтг'а не возьмем, они у нас из под носа выг'вут, – заключил он.
В то время как Денисов говорил с эсаулом, Петя, сконфуженный холодным тоном Денисова и предполагая, что причиной этого тона было положение его панталон, так, чтобы никто этого не заметил, под шинелью поправлял взбившиеся панталоны, стараясь иметь вид как можно воинственнее.
– Будет какое нибудь приказание от вашего высокоблагородия? – сказал он Денисову, приставляя руку к козырьку и опять возвращаясь к игре в адъютанта и генерала, к которой он приготовился, – или должен я оставаться при вашем высокоблагородии?
– Приказания?.. – задумчиво сказал Денисов. – Да ты можешь ли остаться до завтрашнего дня?
– Ах, пожалуйста… Можно мне при вас остаться? – вскрикнул Петя.
– Да как тебе именно велено от генег'ала – сейчас вег'нуться? – спросил Денисов. Петя покраснел.
– Да он ничего не велел. Я думаю, можно? – сказал он вопросительно.
– Ну, ладно, – сказал Денисов. И, обратившись к своим подчиненным, он сделал распоряжения о том, чтоб партия шла к назначенному у караулки в лесу месту отдыха и чтобы офицер на киргизской лошади (офицер этот исполнял должность адъютанта) ехал отыскивать Долохова, узнать, где он и придет ли он вечером. Сам же Денисов с эсаулом и Петей намеревался подъехать к опушке леса, выходившей к Шамшеву, с тем, чтобы взглянуть на то место расположения французов, на которое должно было быть направлено завтрашнее нападение.
– Ну, бог'ода, – обратился он к мужику проводнику, – веди к Шамшеву.
Денисов, Петя и эсаул, сопутствуемые несколькими казаками и гусаром, который вез пленного, поехали влево через овраг, к опушке леса.


Дождик прошел, только падал туман и капли воды с веток деревьев. Денисов, эсаул и Петя молча ехали за мужиком в колпаке, который, легко и беззвучно ступая своими вывернутыми в лаптях ногами по кореньям и мокрым листьям, вел их к опушке леса.
Выйдя на изволок, мужик приостановился, огляделся и направился к редевшей стене деревьев. У большого дуба, еще не скинувшего листа, он остановился и таинственно поманил к себе рукою.
Денисов и Петя подъехали к нему. С того места, на котором остановился мужик, были видны французы. Сейчас за лесом шло вниз полубугром яровое поле. Вправо, через крутой овраг, виднелась небольшая деревушка и барский домик с разваленными крышами. В этой деревушке и в барском доме, и по всему бугру, в саду, у колодцев и пруда, и по всей дороге в гору от моста к деревне, не более как в двухстах саженях расстояния, виднелись в колеблющемся тумане толпы народа. Слышны были явственно их нерусские крики на выдиравшихся в гору лошадей в повозках и призывы друг другу.
– Пленного дайте сюда, – негромко сказал Денисоп, не спуская глаз с французов.
Казак слез с лошади, снял мальчика и вместе с ним подошел к Денисову. Денисов, указывая на французов, спрашивал, какие и какие это были войска. Мальчик, засунув свои озябшие руки в карманы и подняв брови, испуганно смотрел на Денисова и, несмотря на видимое желание сказать все, что он знал, путался в своих ответах и только подтверждал то, что спрашивал Денисов. Денисов, нахмурившись, отвернулся от него и обратился к эсаулу, сообщая ему свои соображения.
Петя, быстрыми движениями поворачивая голову, оглядывался то на барабанщика, то на Денисова, то на эсаула, то на французов в деревне и на дороге, стараясь не пропустить чего нибудь важного.
– Пг'идет, не пг'идет Долохов, надо бг'ать!.. А? – сказал Денисов, весело блеснув глазами.
– Место удобное, – сказал эсаул.
– Пехоту низом пошлем – болотами, – продолжал Денисов, – они подлезут к саду; вы заедете с казаками оттуда, – Денисов указал на лес за деревней, – а я отсюда, с своими гусаг'ами. И по выстг'елу…
– Лощиной нельзя будет – трясина, – сказал эсаул. – Коней увязишь, надо объезжать полевее…
В то время как они вполголоса говорили таким образом, внизу, в лощине от пруда, щелкнул один выстрел, забелелся дымок, другой и послышался дружный, как будто веселый крик сотен голосов французов, бывших на полугоре. В первую минуту и Денисов и эсаул подались назад. Они были так близко, что им показалось, что они были причиной этих выстрелов и криков. Но выстрелы и крики не относились к ним. Низом, по болотам, бежал человек в чем то красном. Очевидно, по нем стреляли и на него кричали французы.
– Ведь это Тихон наш, – сказал эсаул.
– Он! он и есть!
– Эка шельма, – сказал Денисов.
– Уйдет! – щуря глаза, сказал эсаул.
Человек, которого они называли Тихоном, подбежав к речке, бултыхнулся в нее так, что брызги полетели, и, скрывшись на мгновенье, весь черный от воды, выбрался на четвереньках и побежал дальше. Французы, бежавшие за ним, остановились.
– Ну ловок, – сказал эсаул.
– Экая бестия! – с тем же выражением досады проговорил Денисов. – И что он делал до сих пор?
– Это кто? – спросил Петя.
– Это наш пластун. Я его посылал языка взять.
– Ах, да, – сказал Петя с первого слова Денисова, кивая головой, как будто он все понял, хотя он решительно не понял ни одного слова.
Тихон Щербатый был один из самых нужных людей в партии. Он был мужик из Покровского под Гжатью. Когда, при начале своих действий, Денисов пришел в Покровское и, как всегда, призвав старосту, спросил о том, что им известно про французов, староста отвечал, как отвечали и все старосты, как бы защищаясь, что они ничего знать не знают, ведать не ведают. Но когда Денисов объяснил им, что его цель бить французов, и когда он спросил, не забредали ли к ним французы, то староста сказал, что мародеры бывали точно, но что у них в деревне только один Тишка Щербатый занимался этими делами. Денисов велел позвать к себе Тихона и, похвалив его за его деятельность, сказал при старосте несколько слов о той верности царю и отечеству и ненависти к французам, которую должны блюсти сыны отечества.
– Мы французам худого не делаем, – сказал Тихон, видимо оробев при этих словах Денисова. – Мы только так, значит, по охоте баловались с ребятами. Миродеров точно десятка два побили, а то мы худого не делали… – На другой день, когда Денисов, совершенно забыв про этого мужика, вышел из Покровского, ему доложили, что Тихон пристал к партии и просился, чтобы его при ней оставили. Денисов велел оставить его.
Тихон, сначала исправлявший черную работу раскладки костров, доставления воды, обдирания лошадей и т. п., скоро оказал большую охоту и способность к партизанской войне. Он по ночам уходил на добычу и всякий раз приносил с собой платье и оружие французское, а когда ему приказывали, то приводил и пленных. Денисов отставил Тихона от работ, стал брать его с собою в разъезды и зачислил в казаки.
Тихон не любил ездить верхом и всегда ходил пешком, никогда не отставая от кавалерии. Оружие его составляли мушкетон, который он носил больше для смеха, пика и топор, которым он владел, как волк владеет зубами, одинаково легко выбирая ими блох из шерсти и перекусывая толстые кости. Тихон одинаково верно, со всего размаха, раскалывал топором бревна и, взяв топор за обух, выстрагивал им тонкие колышки и вырезывал ложки. В партии Денисова Тихон занимал свое особенное, исключительное место. Когда надо было сделать что нибудь особенно трудное и гадкое – выворотить плечом в грязи повозку, за хвост вытащить из болота лошадь, ободрать ее, залезть в самую середину французов, пройти в день по пятьдесят верст, – все указывали, посмеиваясь, на Тихона.
– Что ему, черту, делается, меренина здоровенный, – говорили про него.
Один раз француз, которого брал Тихон, выстрелил в него из пистолета и попал ему в мякоть спины. Рана эта, от которой Тихон лечился только водкой, внутренне и наружно, была предметом самых веселых шуток во всем отряде и шуток, которым охотно поддавался Тихон.
– Что, брат, не будешь? Али скрючило? – смеялись ему казаки, и Тихон, нарочно скорчившись и делая рожи, притворяясь, что он сердится, самыми смешными ругательствами бранил французов. Случай этот имел на Тихона только то влияние, что после своей раны он редко приводил пленных.
Тихон был самый полезный и храбрый человек в партии. Никто больше его не открыл случаев нападения, никто больше его не побрал и не побил французов; и вследствие этого он был шут всех казаков, гусаров и сам охотно поддавался этому чину. Теперь Тихон был послан Денисовым, в ночь еще, в Шамшево для того, чтобы взять языка. Но, или потому, что он не удовлетворился одним французом, или потому, что он проспал ночь, он днем залез в кусты, в самую середину французов и, как видел с горы Денисов, был открыт ими.


Поговорив еще несколько времени с эсаулом о завтрашнем нападении, которое теперь, глядя на близость французов, Денисов, казалось, окончательно решил, он повернул лошадь и поехал назад.
– Ну, бг'ат, тепег'ь поедем обсушимся, – сказал он Пете.
Подъезжая к лесной караулке, Денисов остановился, вглядываясь в лес. По лесу, между деревьев, большими легкими шагами шел на длинных ногах, с длинными мотающимися руками, человек в куртке, лаптях и казанской шляпе, с ружьем через плечо и топором за поясом. Увидав Денисова, человек этот поспешно швырнул что то в куст и, сняв с отвисшими полями мокрую шляпу, подошел к начальнику. Это был Тихон. Изрытое оспой и морщинами лицо его с маленькими узкими глазами сияло самодовольным весельем. Он, высоко подняв голову и как будто удерживаясь от смеха, уставился на Денисова.
– Ну где пг'опадал? – сказал Денисов.
– Где пропадал? За французами ходил, – смело и поспешно отвечал Тихон хриплым, но певучим басом.
– Зачем же ты днем полез? Скотина! Ну что ж, не взял?..
– Взять то взял, – сказал Тихон.
– Где ж он?
– Да я его взял сперва наперво на зорьке еще, – продолжал Тихон, переставляя пошире плоские, вывернутые в лаптях ноги, – да и свел в лес. Вижу, не ладен. Думаю, дай схожу, другого поаккуратнее какого возьму.
– Ишь, шельма, так и есть, – сказал Денисов эсаулу. – Зачем же ты этого не пг'ивел?
– Да что ж его водить то, – сердито и поспешно перебил Тихон, – не гожающий. Разве я не знаю, каких вам надо?
– Эка бестия!.. Ну?..
– Пошел за другим, – продолжал Тихон, – подполоз я таким манером в лес, да и лег. – Тихон неожиданно и гибко лег на брюхо, представляя в лицах, как он это сделал. – Один и навернись, – продолжал он. – Я его таким манером и сграбь. – Тихон быстро, легко вскочил. – Пойдем, говорю, к полковнику. Как загалдит. А их тут четверо. Бросились на меня с шпажками. Я на них таким манером топором: что вы, мол, Христос с вами, – вскрикнул Тихон, размахнув руками и грозно хмурясь, выставляя грудь.
– То то мы с горы видели, как ты стречка задавал через лужи то, – сказал эсаул, суживая свои блестящие глаза.
Пете очень хотелось смеяться, но он видел, что все удерживались от смеха. Он быстро переводил глаза с лица Тихона на лицо эсаула и Денисова, не понимая того, что все это значило.
– Ты дуг'ака то не представляй, – сказал Денисов, сердито покашливая. – Зачем пег'вого не пг'ивел?
Тихон стал чесать одной рукой спину, другой голову, и вдруг вся рожа его растянулась в сияющую глупую улыбку, открывшую недостаток зуба (за что он и прозван Щербатый). Денисов улыбнулся, и Петя залился веселым смехом, к которому присоединился и сам Тихон.
– Да что, совсем несправный, – сказал Тихон. – Одежонка плохенькая на нем, куда же его водить то. Да и грубиян, ваше благородие. Как же, говорит, я сам анаральский сын, не пойду, говорит.
– Экая скотина! – сказал Денисов. – Мне расспросить надо…
– Да я его спрашивал, – сказал Тихон. – Он говорит: плохо зн аком. Наших, говорит, и много, да всё плохие; только, говорит, одна названия. Ахнете, говорит, хорошенько, всех заберете, – заключил Тихон, весело и решительно взглянув в глаза Денисова.
– Вот я те всыплю сотню гог'ячих, ты и будешь дуг'ака то ког'чить, – сказал Денисов строго.
– Да что же серчать то, – сказал Тихон, – что ж, я не видал французов ваших? Вот дай позатемняет, я табе каких хошь, хоть троих приведу.
– Ну, поедем, – сказал Денисов, и до самой караулки он ехал, сердито нахмурившись и молча.
Тихон зашел сзади, и Петя слышал, как смеялись с ним и над ним казаки о каких то сапогах, которые он бросил в куст.
Когда прошел тот овладевший им смех при словах и улыбке Тихона, и Петя понял на мгновенье, что Тихон этот убил человека, ему сделалось неловко. Он оглянулся на пленного барабанщика, и что то кольнуло его в сердце. Но эта неловкость продолжалась только одно мгновенье. Он почувствовал необходимость повыше поднять голову, подбодриться и расспросить эсаула с значительным видом о завтрашнем предприятии, с тем чтобы не быть недостойным того общества, в котором он находился.