Эндонуклеазы рестрикции

Поделись знанием:
(перенаправлено с «Рестриктаза»)
Перейти к: навигация, поиск

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием)[1].





Классификация

Выделяют три основных типа (или класса) ферментов рестрикции, сайты узнавания для которых могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными[2]:

  • Рестриктазы первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удалённой областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК).
  • Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого типа узнают палиндромные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии.
  • Рестриктазы третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты.

К 2007 году выделено более трёх тысяч эндонуклеаз рестрикции.[3] Более шестисот рестриктаз доступны в виде коммерческих препаратов и повседневно используются в лабораториях для модификации ДНК и решения генно-инженерных задач.[4][5][6]

Изошизомеры

Изошизомеры — это пары эндонуклеаз рестрикции, имеющих специфичность к распознаванию одинаковых последовательностей, но иногда отличающихся по наличию метилированных нуклеотидных остатков, и разрезающих эти последовательности в одинаковых местах. Например, изошизомерами являются рестриктазы Sph I (CGTAC^G) и Bbu I (CGTAC^G). Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами.

Изошизомеры выделяют из разных штаммов бактерий и поэтому разные изошизомеры могут требовать разных условий реакции.

Гетерошизомеры (неошизомеры)

Фермент, узнающий такую же последовательность, но разрезающий её по-другому, называют гетерошизомером (неошизомером). Изошизомеры, таким образом, являются частным случаем гетерошизомеров. Например, рестриктазы Sma I (GGG^CCC) и Xma I (G^GGCCC) являются гетерошизомерами, но не изошизомерами друг для друга.

Изокаудомеры

Рестриктазы, распознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами.

Искусственные рестриктазы

В генной инженерии широко используются искусственные рестриктазы, получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена цинкового пальца с ДНК-разрезающим доменом нуклеазы [7][8] Домен цинкового пальца может быть спроектирован так чтобы узнавать и связываться с желаемой последовательностью ДНК[9]. Альтернативой нуклеазам с цинковым пальцем являются искусственные ферменты рестрикции TALEN получаемые путём слияния ДНК-связывающего домена TAL эффектора с доменом расщепления ДНК [10][11][12][13].

Эндонуклеазы, работающие по «наводке» РНК

Для редактирования генома в клетках человека используются также эндонуклеазы системы CRISPR-Cas9 расщепляющие определенные последовательности ДНК по «наводке» комплементарной РНК [14][15][16][17][18][19] В отличие от цинковых пальцев и TALEN, системе CRISPR-Cas для узнавания ДНК требуется только создание соответствующей последовательности РНК «гида», а не создание новых белковых доменов фермента, что делает этот метод гораздо более доступным благодаря простоте и сравнительной дешевизне [20][21][22][23][24]

Значение

В практической молекулярной биологии чаще всего используются рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром. Все рестриктазы II типа — Mg2+-зависимы.

Рестриктазы — часть сложной системы рестрикции-модификации, используемой бактериальными клетками для регуляции содержания и активности ДНК в клетке.

Открытие рестриктаз в 1970-х годах вместе с разработкой способов секвенирования ДНК послужило основным толчком для развития генетической инженерии.

В настоящее время рестриктазы с различными сайтами узнавания являются основным инструментом генетических исследований и генной инженерии.

См. также

Напишите отзыв о статье "Эндонуклеазы рестрикции"

Примечания

  1. ↑ Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: в трех томах. — 2. — Москва: Мир, 1994. — Т. 1. — 517 с. — 10 000 экз. — ISBN 5030019855.
  2. ↑ Айала Ф. Д. Современная генетика. 1987.
  3. ↑ Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D. (2007). «[www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=17202163 REBASE--enzymes and genes for DNA restriction and modification]». Nucleic Acids Res 35 (Database issue): D269–70. DOI:10.1093/nar/gkl891. PMID 17202163.
  4. ↑ Primrose, Sandy B.; Old, R. W. Principles of gene manipulation: an introduction to genetic engineering. — Oxford: Blackwell Scientific, 1994. — ISBN 0-632-03712-1.
  5. ↑ Micklos, David A.; Bloom, Mark V.; Freyer, Greg A. Laboratory DNA science: an introduction to recombinant DNA techniques and methods of genome analysis. — Menlo Park, Calif: Benjamin/Cummings Pub. Co, 1996. — ISBN 0-8053-3040-2.
  6. ↑ Adrianne Massey; Helen Kreuzer. Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Students. — Washington, D.C: ASM Press, 2001. — ISBN 1-55581-176-0.
  7. ↑ Carroll, D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics, 188(4), 773-782.doi: 10.1534/genetics.111.131433
  8. ↑ Fujii W, Kano K, Sugiura K, Naito K (2013) Repeatable Construction Method for Engineered Zinc Finger Nuclease Based on Overlap Extension PCR and TA-Cloning. PLoS ONE 8(3): e59801. doi:10.1371/journal.pone.0059801
  9. ↑ Zhu, C., Gupta, A., Hall, V. L. et al. & Wolfe, S. A. (2013). Using defined finger–finger interfaces as units of assembly for constructing zinc-finger nucleases. Nucleic acids research, 41(4), 2455-246541 doi: 10.1093/nar/gks1357.
  10. ↑ Mussolino, C., & Cathomen, T. (2012). TALE nucleases: tailored genome engineering made easy. Current Opinion in Biotechnology, 23(5), 644-650 doi: org/10.1016/j.copbio.2012.01.013
  11. ↑ Beumer, K. J., Trautman, J. K., Christian, M.,et al. & Carroll, D. (2013). Comparing Zinc Finger Nucleases and Transcription Activator-Like Effector Nucleases for Gene Targeting in Drosophila. G3: Genes| Genomes| Genetics, 3(10), 1717-1725 doi: 10.1534/g3.113.007260
  12. ↑ Sun, N., & Zhao, H. (2013). Transcription activator‐like effector nucleases (TALENs): A highly efficient and versatile tool for genome editing. Biotechnology and bioengineering, 110(7), 1811–1821 doi: 10.1002/bit.24890
  13. ↑ Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y (2013) Rapid Assembly of Customized TALENs into Multiple Delivery Systems. PLoS ONE 8(11): e80281. doi:10.1371/journal.pone.0080281
  14. ↑ Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., & Kim, J. S. (2013). Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature biotechnology, 31, 230–232 doi:10.1038/nbt.2507
  15. ↑ Hsu, P. D., Scott, D. A., Weinstein, J. A.,et al. & Zhang, F. (2013) DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology, 31(9), 827-832.doi:10.1038/nbt.2647
  16. ↑ Golic, K. G. (2013) RNA-Guided Nucleases: A New Era for Engineering the Genomes of Model and Nonmodel Organisms. Genetics, 195(2), 303-308.
  17. ↑ Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., et al. & Zhang, F. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols, 8(11), 2281-2308 doi:10.1038/nprot.2013.143
  18. ↑ Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) [www.cell.com/trends/microbiology//retrieve/pii/S0966842X13001789?_returnURL=linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0966842X13001789?showall=true#Summary RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing?] Trends in Microbiology, 21(11), 562-567, doi: 10.1016/j.tim.2013.09.001
  19. ↑ Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak, and George Church (2014) CRISPR-Cas Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. In: Gene Correction. Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
  20. ↑ Uri Ben-David (2013) [www.molcelltherapies.com/content/1/1/3 Flowing through the CRISPR-CAScade: Will genome editing boost cell therapies?] Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi:10.1186/2052-8426-1-3
  21. ↑ Neena K. Pyzocha, F. Ann Ran, Patrick D. Hsu, and Feng Zhang (2014) RNA-Guided Genome Editing of Mammalian Cells. In: Gene Correction. Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
  22. ↑ Li, M., Suzuki, K., Kim, N. Y., Liu, G. H., & Belmonte, J. C. I. (2013). A cut above the rest: targeted genome editing technologies in human pluripotent stem cells. Journal of Biological Chemistry, jbc-R113.doi: 10.1074/jbc.R113.488247
  23. ↑ Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., & Zhang, F. (2016). «Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity». Science 351 (6268): 84-88. DOI:10.1126/science.aad5227.
  24. ↑ Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., et al., & J. Keith Joung (2016). «High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects». Nature. DOI:10.1038/nature16526.

Отрывок, характеризующий Эндонуклеазы рестрикции

У алтаря лысогорской церкви была часовня над могилой маленькой княгини, и в часовне был поставлен привезенный из Италии мраморный памятник, изображавший ангела, расправившего крылья и готовящегося подняться на небо. У ангела была немного приподнята верхняя губа, как будто он сбирался улыбнуться, и однажды князь Андрей и княжна Марья, выходя из часовни, признались друг другу, что странно, лицо этого ангела напоминало им лицо покойницы. Но что было еще страннее и чего князь Андрей не сказал сестре, было то, что в выражении, которое дал случайно художник лицу ангела, князь Андрей читал те же слова кроткой укоризны, которые он прочел тогда на лице своей мертвой жены: «Ах, зачем вы это со мной сделали?…»
Вскоре после возвращения князя Андрея, старый князь отделил сына и дал ему Богучарово, большое имение, находившееся в 40 верстах от Лысых Гор. Частью по причине тяжелых воспоминаний, связанных с Лысыми Горами, частью потому, что не всегда князь Андрей чувствовал себя в силах переносить характер отца, частью и потому, что ему нужно было уединение, князь Андрей воспользовался Богучаровым, строился там и проводил в нем большую часть времени.
Князь Андрей, после Аустерлицкой кампании, твердо pешил никогда не служить более в военной службе; и когда началась война, и все должны были служить, он, чтобы отделаться от действительной службы, принял должность под начальством отца по сбору ополчения. Старый князь с сыном как бы переменились ролями после кампании 1805 года. Старый князь, возбужденный деятельностью, ожидал всего хорошего от настоящей кампании; князь Андрей, напротив, не участвуя в войне и в тайне души сожалея о том, видел одно дурное.
26 февраля 1807 года, старый князь уехал по округу. Князь Андрей, как и большею частью во время отлучек отца, оставался в Лысых Горах. Маленький Николушка был нездоров уже 4 й день. Кучера, возившие старого князя, вернулись из города и привезли бумаги и письма князю Андрею.
Камердинер с письмами, не застав молодого князя в его кабинете, прошел на половину княжны Марьи; но и там его не было. Камердинеру сказали, что князь пошел в детскую.
– Пожалуйте, ваше сиятельство, Петруша с бумагами пришел, – сказала одна из девушек помощниц няни, обращаясь к князю Андрею, который сидел на маленьком детском стуле и дрожащими руками, хмурясь, капал из стклянки лекарство в рюмку, налитую до половины водой.
– Что такое? – сказал он сердито, и неосторожно дрогнув рукой, перелил из стклянки в рюмку лишнее количество капель. Он выплеснул лекарство из рюмки на пол и опять спросил воды. Девушка подала ему.
В комнате стояла детская кроватка, два сундука, два кресла, стол и детские столик и стульчик, тот, на котором сидел князь Андрей. Окна были завешаны, и на столе горела одна свеча, заставленная переплетенной нотной книгой, так, чтобы свет не падал на кроватку.
– Мой друг, – обращаясь к брату, сказала княжна Марья от кроватки, у которой она стояла, – лучше подождать… после…
– Ах, сделай милость, ты всё говоришь глупости, ты и так всё дожидалась – вот и дождалась, – сказал князь Андрей озлобленным шопотом, видимо желая уколоть сестру.
– Мой друг, право лучше не будить, он заснул, – умоляющим голосом сказала княжна.
Князь Андрей встал и, на цыпочках, с рюмкой подошел к кроватке.
– Или точно не будить? – сказал он нерешительно.
– Как хочешь – право… я думаю… а как хочешь, – сказала княжна Марья, видимо робея и стыдясь того, что ее мнение восторжествовало. Она указала брату на девушку, шопотом вызывавшую его.
Была вторая ночь, что они оба не спали, ухаживая за горевшим в жару мальчиком. Все сутки эти, не доверяя своему домашнему доктору и ожидая того, за которым было послано в город, они предпринимали то то, то другое средство. Измученные бессоницей и встревоженные, они сваливали друг на друга свое горе, упрекали друг друга и ссорились.
– Петруша с бумагами от папеньки, – прошептала девушка. – Князь Андрей вышел.
– Ну что там! – проговорил он сердито, и выслушав словесные приказания от отца и взяв подаваемые конверты и письмо отца, вернулся в детскую.
– Ну что? – спросил князь Андрей.
– Всё то же, подожди ради Бога. Карл Иваныч всегда говорит, что сон всего дороже, – прошептала со вздохом княжна Марья. – Князь Андрей подошел к ребенку и пощупал его. Он горел.
– Убирайтесь вы с вашим Карлом Иванычем! – Он взял рюмку с накапанными в нее каплями и опять подошел.
– Andre, не надо! – сказала княжна Марья.
Но он злобно и вместе страдальчески нахмурился на нее и с рюмкой нагнулся к ребенку. – Ну, я хочу этого, сказал он. – Ну я прошу тебя, дай ему.
Княжна Марья пожала плечами, но покорно взяла рюмку и подозвав няньку, стала давать лекарство. Ребенок закричал и захрипел. Князь Андрей, сморщившись, взяв себя за голову, вышел из комнаты и сел в соседней, на диване.
Письма всё были в его руке. Он машинально открыл их и стал читать. Старый князь, на синей бумаге, своим крупным, продолговатым почерком, употребляя кое где титлы, писал следующее:
«Весьма радостное в сей момент известие получил через курьера, если не вранье. Бенигсен под Эйлау над Буонапартием якобы полную викторию одержал. В Петербурге все ликуют, e наград послано в армию несть конца. Хотя немец, – поздравляю. Корчевский начальник, некий Хандриков, не постигну, что делает: до сих пор не доставлены добавочные люди и провиант. Сейчас скачи туда и скажи, что я с него голову сниму, чтобы через неделю всё было. О Прейсиш Эйлауском сражении получил еще письмо от Петиньки, он участвовал, – всё правда. Когда не мешают кому мешаться не следует, то и немец побил Буонапартия. Сказывают, бежит весьма расстроен. Смотри ж немедля скачи в Корчеву и исполни!»
Князь Андрей вздохнул и распечатал другой конверт. Это было на двух листочках мелко исписанное письмо от Билибина. Он сложил его не читая и опять прочел письмо отца, кончавшееся словами: «скачи в Корчеву и исполни!» «Нет, уж извините, теперь не поеду, пока ребенок не оправится», подумал он и, подошедши к двери, заглянул в детскую. Княжна Марья всё стояла у кроватки и тихо качала ребенка.
«Да, что бишь еще неприятное он пишет? вспоминал князь Андрей содержание отцовского письма. Да. Победу одержали наши над Бонапартом именно тогда, когда я не служу… Да, да, всё подшучивает надо мной… ну, да на здоровье…» и он стал читать французское письмо Билибина. Он читал не понимая половины, читал только для того, чтобы хоть на минуту перестать думать о том, о чем он слишком долго исключительно и мучительно думал.


Билибин находился теперь в качестве дипломатического чиновника при главной квартире армии и хоть и на французском языке, с французскими шуточками и оборотами речи, но с исключительно русским бесстрашием перед самоосуждением и самоосмеянием описывал всю кампанию. Билибин писал, что его дипломатическая discretion [скромность] мучила его, и что он был счастлив, имея в князе Андрее верного корреспондента, которому он мог изливать всю желчь, накопившуюся в нем при виде того, что творится в армии. Письмо это было старое, еще до Прейсиш Эйлауского сражения.
«Depuis nos grands succes d'Austerlitz vous savez, mon cher Prince, писал Билибин, que je ne quitte plus les quartiers generaux. Decidement j'ai pris le gout de la guerre, et bien m'en a pris. Ce que j'ai vu ces trois mois, est incroyable.
«Je commence ab ovo. L'ennemi du genre humain , comme vous savez, s'attaque aux Prussiens. Les Prussiens sont nos fideles allies, qui ne nous ont trompes que trois fois depuis trois ans. Nous prenons fait et cause pour eux. Mais il se trouve que l'ennemi du genre humain ne fait nulle attention a nos beaux discours, et avec sa maniere impolie et sauvage se jette sur les Prussiens sans leur donner le temps de finir la parade commencee, en deux tours de main les rosse a plate couture et va s'installer au palais de Potsdam.
«J'ai le plus vif desir, ecrit le Roi de Prusse a Bonaparte, que V. M. soit accueillie еt traitee dans mon palais d'une maniere, qui lui soit agreable et c'est avec еmpres sement, que j'ai pris a cet effet toutes les mesures que les circonstances me permettaient. Puisse je avoir reussi! Les generaux Prussiens se piquent de politesse envers les Francais et mettent bas les armes aux premieres sommations.
«Le chef de la garienison de Glogau avec dix mille hommes, demande au Roi de Prusse, ce qu'il doit faire s'il est somme de se rendre?… Tout cela est positif.
«Bref, esperant en imposer seulement par notre attitude militaire, il se trouve que nous voila en guerre pour tout de bon, et ce qui plus est, en guerre sur nos frontieres avec et pour le Roi de Prusse . Tout est au grand complet, il ne nous manque qu'une petite chose, c'est le general en chef. Comme il s'est trouve que les succes d'Austerlitz aurant pu etre plus decisifs si le general en chef eut ete moins jeune, on fait la revue des octogenaires et entre Prosorofsky et Kamensky, on donne la preference au derienier. Le general nous arrive en kibik a la maniere Souvoroff, et est accueilli avec des acclamations de joie et de triomphe.


Источник — «http://wiki-org.ru/wiki/index.php?title=Эндонуклеазы_рестрикции&oldid=78060005»