Секвенирование ДНК одиночных клеток

Поделись знанием:
Перейти к: навигация, поиск

Секвени́рование ДНК одино́чных кле́ток (англ. Single-cell DNA sequencing) — подход, позволяющий получить данные о последовательности ДНК отдельной клетки с помощью секвенирования и, следовательно, выявлять различия между отдельными клетками одноклеточных организмов, органов, тканей и клеточных субпопуляций многоклеточных организмов. Подход позволяет анализировать функциональные особенности клетки в контексте микроокружения. Секвенирование генома единичной клетки включает несколько шагов: выделение одной клетки, полногеномная амплификация, создание библиотек и секвенирование ДНК с использованием методов секвенирования нового поколения.

С появлением разнообразных методов секвенирования возникла возможность устанавливать последовательность геномной ДНК. Однако большинство данных на текущий момент получены при секвенировании образцов геномной ДНК, выделенных из популяций микроорганизмов или клеточных субпопуляций многоклеточных организмов[1]. Однако известно, что разнообразие внутри обеих групп может быть существенным, так как сами клетки вносят разный вклад в существование популяции или организма.

Секвенирование генома единичной клетки позволяет перевести изучение генома на клеточный уровень. Сегодня это помогает решать такие задачи, как de novo[en] секвенирование некультивируемых микроорганизмов[2], изучение генетического мозаицизма в нормальных и патологических случаях[3], выявление и изучение вклада клеточных субпопуляций опухолей в развитие рака и возникновение устойчивости к лечению[4].





Технологические задачи

Перед секвенированием ДНК одиночных клеток стоят задачи физического выделения отдельных клеток, выбора метода амплификации с наименьшей вероятностью внесения ошибок для получения достаточного количества материала и выбора способа секвенирования[5][6].

Изолирование отдельных клеток

Первым шагом в изолировании клеток является создание суспензии жизнеспособных клеток, не связанных друг с другом. Целью изолирования может быть как случайный выбор клеток для создания репрезентативной выборочной совокупности при анализе состава субпопуляций, так и целенаправленный поиск определенных клеток. При исследовании твердых тканей необходима предварительная механическая или химическая диссоциация образца, при этом условия диссоциации должны одинаково действовать на все субпопуляции клеток тканей. Это необходимо для создания несмещенной относительно исходного набора клеток выборки, где сохраняется изначальная представленность клеток, что может быть важно для анализа состава субпопуляций. Стоит учитывать, что условия диссоциации нормальных и нездоровых тканей могут различаться, поэтому на данном этапе важно подобрать соответствующие условия. Работа с цельными образцами тканей также возможна, например, с помощью лазерной захватывающей микродиссекции[7].

После получения суспензии можно приступать к изолированию клеток методами серийного разведения[8], микропипетирования[9], разведения в микроячейках[10], с использованием оптического пинцета. Метод проточной флуоресцентной цитометрии может использоваться для отделения клеток с определенными флуоресцентными свойствами, которые могут быть как естественными, так и введены экспериментатором. Большое развитие в последнее время получили автоматизированные методы микроманипуляции[11][12], том числе изолирование клеток на чипах с использованием технологий микрофлюидики[13]; взятие нанобиопсий уже позволяет исследовать ДНК отдельных органелл[14]. Изолированные клетки впоследствии подвергаются лизису.

Полногеномная амплификация

Следующий шаг — полногеномная амплификация (англ. whole genome amplification, WGA), — служит для наработки такого количества ДНК, которого достаточно для детекции сигнала и его выделения из шума в дальнейшем при секвенировании. При этом желательно минимизировать внесение таких артефактов, как предпочтительная амплификация простых последовательностей, введение случайных мутаций и формирование химерных последовательностей. За последнее время появился набор возможностей для решения этой задачи. Использование ПЦР не оправдало себя ввиду, например, повышенной частоты введения ошибок термостабильными полимеразами. Поэтому наибольшего распространения добились изотермические и гибридные методы, такие как метод амплификации со множественным замещением цепи[en] (англ. Multiple displacement amplification, MDA) и амплификации со множественным выпрямлением и выпетливанием[en] (англ. Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC)[15].

MDA

MDA позволяет быстро амплифицировать ДНК, не задействуя ПЦР. Метод основан на использовании фаговой полимеразы phi29, которая характеризуется повышенной процессивностью (может синтезировать участки длиной свыше 10 килобаз без диссоциации) и низкой частотой ошибок (1 на 106−107 пар оснований). Реакция происходит следующим образом: гексамерные праймеры отжигаются на матрице, элонгируются посредством полимеразы; когда фермент встречает другой праймер (который также элонгируется), то он вытесняет (замещает) его и продолжает свой путь по матрице. Замещенный новосинтезированный участок служит местом посадки новых праймеров и становится матрицей. Таким образом формируется ветвистое дерево, где синтез происходит на каждой ветви. В конце процедуры полимераза ингибируется, добавляется нуклеаза S1 для отщепления ветвей в местах ветвления и ДНК-полимераза I[en] для достраивания образующихся одноцепочечных участков[15].

Метод имеет ряд проблем, таких как потеря аллелей, предпочтительная амплификация и взаимодействия между праймерами. Первая проблема возникает вследствие случайной амплификации только одного из аллелей в гетерозиготах, в результате чего гетерозиготы неверно определяются как гомозиготы. Из-за высокой частоты проявления этого эффекта (0 — 60 %) уменьшается точность генотипирования[en]. Вторая проблема заключается в сверхамплификации одного аллеля по сравнению с другими. Взаимодействия между гексамерными праймерами происходят вследствие случайного характера последовательностей; их можно значительно уменьшить, введя ограничения при синтезе этих праймеров[15].

MALBAC

MALBAC — гибридный линейный метод полногеномной амплификации. Основа метода — специальные праймеры: они имеют длину 35 нуклеотидов, 27 из которых одинаковы во всех праймерах (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), а 8 оставшихся нуклеотидов варьируются. Весь процесс амплификации описывается следующим образом[9]:

  1. Плавление (94 °С) двухцепочечной ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов.
  2. Охлаждение (0 °С), добавление праймеров и полимеразы.
  3. Отжиг праймеров в случайных местах на матрице. ДНК-полимераза Bst удлиняет праймеры с образованием полуампликона при 64 °С. Все встречные праймеры смещаются с матрицы.
  4. Плавление (94 °С), отделение полуампликона от матрицы.
  5. Охлаждение (0 °С), добавление праймеров и полимеразы. Праймеры эффективно связываются и с матрицей, и с полуампликоном.
  6. ДНК-полимераза Bst удлиняет праймеры при 64 °С. На исходной матрице синтезируются полуампликоны, на полуампликонах, полученных ранее, синтезируются полные ампликоны[en].
  7. Плавление (94 °С).
  8. Образование петель (58 °С): у полных ампликонов 3' и 5' концы комплементарны друг другу и образуют петлю, не допуская использования полного ампликона в качестве матрицы.
  9. Повторение шагов 5—8 пять раз.
  10. ПЦР с использованием 27 общих нуклеотидов в качестве праймеров для амплификации только полных ампликонов[9].

Преимуществом метода является уменьшение шума, связанного с экспоненциальным характером ПЦР амплификации, благодаря введению предварительной квази-линейной амплификации. Это позволило увеличить покрытие генома (доля генома, покрытая хотя бы одним ридом), уменьшить вероятность потери аллелей и однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs). Помимо этого, на вход требуется очень небольшое количество исходной ДНК, однако любое загрязнение образцов способно значительно повлиять на результаты секвенирования[9].

Недостатком является то, что для избавления от ложно-положительных результатов необходимо сравнивать результаты секвенирования 2—3 клеток как из той же, так и из иной клеточных линий[9]. При этом может теряться часть полиморфизмов, так как клетки, принадлежащие одной клеточной линии, все же имеют некоторые различия в геноме. Кроме того, используемая ДНК-полимераза bst имеет высокую частоту ошибок (1 на 105 оснований)[16].

Сравнение методов полногеномной амплификации

В последнее время было проведено несколько исследований, посвященных сравнению этих методов[17][18][19]. Результатом одного из исследований стал вывод о том, что MDA позволяет получить большее покрытие, чем MALBAC (84 % и 52 % соответственно), что позволяет более точно определять однонуклеотидные полиморфизмы[17]. Однако MALBAC обеспечивает более равномерное покрытие и поэтому дает возможность более точно выявлять вариации числа копий (CNVs)[17]. Интересно, что при секвенировании некоторых клеток уровень детекции вариаций числа копий методом MDA был сопоставим с MALBAC[17]. Другие авторы также подтверждают разницу в покрытии между MDA и MALBAC (84 % и 72 %) и сравнительно более высокую равномерность покрытия MALBAC (коэффициент вариации 0,10 против 0,21 у MDA)[18]. Показано, что MDA дает меньше ложно-положительных результатов, но число ложно-отрицательных результатов меняется от эксперимента к эксперименту[18]. MALBAC дает меньшую частоту потери аллелей (21 %), однако и покрытие его меньше, чем у MDA[18]. В целом не ясно, какой приводит к меньшему количеству ложно-отрицательных результатов, так как MDA покрывает большую часть генома, но при этом теряет больше аллелей из-за предпочтительной амплификации только одного из аллелей в гетерозиготе[15][18].

Таким образом, MDA и MALBAC имеют набор преимуществ и недостатков, и выбор должен зависеть от поставленной задачи.

Создание библиотеки

После амплификации можно приступать к приготовлению библиотек с помощью коммерческих наборов. Здесь возможно несколько вариантов: выбор определенного локуса, выбор экзома или всего генома для дальнейшего секвенирования. Каждый из этих вариантов предполагает определенные значения покрытия, склонности к ошибкам и стоимости[20]. Выбор небольших участков позволяет сфокусироваться на областях, вносящих наибольший биологический вклад в работу изучаемой системы. При это уменьшается цена исследования и вероятность внесения ошибок при подготовке проб. Использование референсного генома[en] позволяет уменьшить ложно-положительные результаты, хотя и ограничивает определяемые однонуклеотидные полиморфизмы теми, что присутствуют в референсном геноме. Секвенирование экзома позволяет выделить уникальные особенности клеток, однако с ростом длины секвенируемого участка растет вероятность внесения ошибок в ходе амплификации. Использование всего генома позволяет выявить некодирующие и структурные участки, однако стоимость исследования резко возрастает, что затрудняет полногеномное секвенирование многих клеток[20].

ДНК из созданных тем или иным способом библиотек используется в секвенировании одним из существующих методов.

Обработка данных

Распространенные ошибки

Большинство артефактов секвенирования возникают при подготовке образцов: изоляция клеток, загрязнение геномной ДНК, амплификация и создание библиотек, так как все эти шаги привносят дополнительные ошибки, приводят к потере покрытия, уменьшению однородности покрытия, смещениям в выборке при предпочтительном отборе определенных групп клеток и амплификации определенных последовательностей ДНК, являются причиной потери аллелей в гетерозиготных позициях. Следует также принимать во внимание клеточные линии, на которых проводится оптимизация всех стадий секвенирования: не все клетки диплоидны, есть и гаплоидные, и анеуплоидные популяции, и их плоидность может значительно влиять на эксперимент[4]. Препятствием на пути сравнения различных результатов в этой области подчас является отсутствие информации об общем количестве оцененных клеток и мере оценки качества секвенирования в конкретных работах[20].

Однонуклеотидные полиморфизмы

Однонуклеотидные полиморфизмы, согласно проекту 1000 геномов[en], вносят наибольшее разнообразие в геном человека[21]: на карте гаплотипа подтверждено 38 млн однонуклеотидных полиморфизмов, 1,4 млн вставок[en]/делеций и более 14 тыс крупных делеций[21]. Также предполагается, что многие комплексные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера[22], различные виды рака[23], аутоиммунные заболевания[24] могут быть связаны именно с наличием полиморфизмов.

Сегодня поиск полиморфизмов в данных секвенирования отдельных клеток опирается на те же алгоритмы, что и анализ результатов обычного секвенирования: [www.broadinstitute.org/gatk/ GATK][25], [www.mybiosoftware.com/snpdetector-20051014-sensitive-accurate-snp-detection.html SNPdetector][26], [soap.genomics.org.cn SOAPsnp][27], [varscan.sourceforge.net VarScan][28]. Однако есть отличия между секвенированием популяции клеток и секвенированием отдельных клеток: в последнем случае меньше покрытие генома и выше уровень ложно-положительных результатов.

Вариация числа копий участков ДНК

Вариации числа копий фрагментов ДНК приводят к ненормальному числу копий этих фрагментов; разнообразие этого типа генетического полиморфизма также влияет на здоровье людей[29][30]. Некоторые исследования подчеркивают их связь с развитием опухолей[31], аутоиммунных заболеваний[24], аутизма[32] и др. Здесь, как и при поиске однонуклеотидных полиморфизмов, используются в основном те же алгоритмы, что и для обычного секвенирования: CNV-seq[33], PenCNV[34], CNAseg[35], ReadDepth[36], и cn.MOPS[37]. Для того, чтобы учитывать вносимый шум, необходимо произвести анализ влияния методов амплификации на появление и исчезновение вариаций числа копий ДНК[38].

Сравнительный анализ клеток

Одной из стратегий кластеризации клеток исходя из геномных данных является введение функции расстояний, которая обеспечивает количественную оценку различий между парами образцов[39]. В данном случае Мера Жаккара считается наиболее подходящей ввиду бинарной природы генетических данных (см. ниже)[40]. Альтернативой основанным на функции расстояния методам является основанная на модели кластеризация, предполагающая вероятностный подход: вместо «жёстких» расстояний вводятся «мягкие» вероятности происхождения клеток от различных клонов.

Представив данные секвенирования единичных клеток в качестве матрицы, где по вертикали отмечены интересующие нас мутации, а по горизонтали — клетки, заполняем ее 0 и 1 в зависимости от присутствия конкретной мутации в конкретной клетке. Если исследуется опухоль, то для нее с течением времени характерны экспансия одних клонов и исчезновение других[41]. При этом мы не знаем, сколько каких клонов присутствует, и предполагаем, что часть данных потеряна в ходе подготовки проб.

Параметры модели, такие как вероятность клетки произойти от определенного клона, а также уровень ложно-отрицательных результатов, могут быть оценены посредством алгоритма максимизации ожидания[42]. Тогда проблема определения числа клонов сводится к выбору статистической модели, которая наилучшим образом описывает данные секвенирования; оценка проводится с помощью информационных критериев Байеса и Акаике[43]. Существует и гибридный подход, позволяющий осуществлять первоначальную кластеризацию с помощью функции расстояния, что увеличивает скорость основанной на модели кластеризации, требующей больших вычислительных мощностей[44]. Основываясь на результатах кластеризации, строится профиль консенсусных клональных мутаций[45]. По нему с помощью различных методов построения деревьев можно выявлять взаимоотношения между разными клонами. Так, например, можно продемонстрировать эволюционную историю опухоли[45].

Достижения

Клональная эволюция клеток рака груди

Анализ паттернов мутаций (вставки, делеции, однонуклеотидные замены, вариации числа копий генов) различных популяций клеток рака груди позволил выявить как набор мутаций, характерных для каждой из популяций (клональные мутации), так и тех, что встречались в нескольких клетках (субклональные мутации). Данные были получены с помощью секвенирования экзомов отдельных клеток, проверены методом глубокого секвенирования. В исследовании использовались клетки анеуплоидных популяций ERBC (ER+/PR+/Her2-) и TNBC (ER-/PR-/Her2-), отличающихся по наличию определенных рецепторов (ER/PR/Her2) на поверхности мембраны, а также нормальные диплоидные клетки. Результатом стало выявление значительно большего количества клональных мутаций в популяции TNBC по сравнению с ERBC и нормальными клетками. В популяции клеток TNBC показано существование трех субпопуляций раковых клеток, найденных по паттернам субклональных мутаций. Получены доказательства того, что TNBC обладает большей частотой возникновения мутаций, и их накопление может происходить не только из-за ошибок при ускоренной пролиферации[4].

Пока неясно, как именно возникает устойчивость опухолей к химиотерапии. Либо в популяции уже есть редко встречающиеся устойчивые клетки, либо ответ возникает спонтанно после действия лекарств. Кроме того, не всегда ясно, за счет чего накапливаются мутации: либо это ускоренная скорость мутаций, как в случае TNBC, либо это накопление мутаций с обычной скоростью, но в большом количестве вследствие ускорения пролиферации[4].

Перспективы

На данный момент основную проблему представляет наличие шага амплификации геномной ДНК, ответственного за внесение наибольшего числа артефактов. Требования к количеству ДНК при приготовлении библиотек все уменьшаются, и уже было продемонстрировано прямое создание библиотек из выделенной ДНК[46][47]. Более того, была показана возможность вовсе обходиться без библиотек, подавая на секвенирование выделенную из клетки ДНК[48]. Существует также возможность выявления эпигенетической информации, такой как поиск паттернов метилирования[49][50] и захват конформационного состояния хромосом[51]. Сегодня ученые обычно оперируют десятками-сотнями клеток, но развитие автоматических платформ для захвата клеток, амплификации ДНК и приготовления библиотек существенно увеличит масштабы и доступность анализа отдельных клеток, позволяя проводить более крупные эксперименты в короткий срок[52].
Применение метода секвенирования ДНК отдельных клеток вместе с эпигеномными и транскриптомными исследованиями позволит точно классифицировать клетки и дополнить существующий взгляд на клеточные популяции. Также станет возможным установление взаимоотношений между последовательностью генома, эпигенетическим статусом и экспрессией генов, определение функциональных возможностей клеток[52].

Напишите отзыв о статье "Секвенирование ДНК одиночных клеток"

Примечания

  1. ↑ Tringe S. G., von Mering C., Kobayashi A., Salamov A. A., Chen K., Chang H. W., Podar M., Short J. M., Mathur E. J., Detter J. C., Bork P., Hugenholtz P., Rubin E. M. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15845853 Comparative metagenomics of microbial communities.] (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2005. — Vol. 308, no. 5721. — P. 554—557. — DOI:10.1126/science.1107851. — PMID 15845853. исправить
  2. ↑ Marcy Y., Ouverney C., Bik E. M., Lösekann T., Ivanova N., Martin H. G., Szeto E., Platt D., Hugenholtz P., Relman D. A., Quake S. R. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17620602 Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated TM7 microbes from the human mouth.] (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2007. — Vol. 104, no. 29. — P. 11889—11894. — DOI:10.1073/pnas.0704662104. — PMID 17620602. исправить
  3. ↑ McConnell M. J., Lindberg M. R., Brennand K. J., Piper J. C., Voet T., Cowing-Zitron C., Shumilina S., Lasken R. S., Vermeesch J. R., Hall I. M., Gage F. H. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24179226 Mosaic copy number variation in human neurons.] (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2013. — Vol. 342, no. 6158. — P. 632—637. — DOI:10.1126/science.1243472. — PMID 24179226. исправить
  4. ↑ 1 2 3 4 Wang Y., Waters J., Leung M. L., Unruh A., Roh W., Shi X., Chen K., Scheet P., Vattathil S., Liang H., Multani A., Zhang H., Zhao R., Michor F., Meric-Bernstam F., Navin N. E. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25079324 Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.] (англ.) // Nature. — 2014. — Vol. 512, no. 7513. — P. 155—160. — DOI:10.1038/nature13600. — PMID 25079324. исправить
  5. ↑ Wen L., Tang F. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27083874 Single-cell sequencing in stem cell biology.] (англ.) // Genome biology. — 2016. — Vol. 17, no. 1. — P. 71. — DOI:10.1186/s13059-016-0941-0. — PMID 27083874. исправить
  6. ↑ Bacher R., Kendziorski C. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27052890 Design and computational analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.] (англ.) // Genome biology. — 2016. — Vol. 17, no. 1. — P. 63. — DOI:10.1186/s13059-016-0927-y. — PMID 27052890. исправить
  7. ↑ Emmert-Buck M. R., Bonner R. F., Smith P. D., Chuaqui R. F., Zhuang Z., Goldstein S. R., Weiss R. A., Liotta L. A. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8875945 Laser capture microdissection.] (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 1996. — Vol. 274, no. 5289. — P. 998—1001. — PMID 8875945. исправить
  8. ↑ HAM R. G. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14294058 CLONAL GROWTH OF MAMMALIAN CELLS IN A CHEMICALLY DEFINED, SYNTHETIC MEDIUM.] (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1965. — Vol. 53. — P. 288—293. — PMID 14294058. исправить
  9. ↑ 1 2 3 4 5 Zong C., Lu S., Chapman A. R., Xie X. S. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23258894 Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.] (англ.) // Science (New York, N.Y.). — 2012. — Vol. 338, no. 6114. — P. 1622—1626. — DOI:10.1126/science.1229164. — PMID 23258894. исправить
  10. ↑ Gole J., Gore A., Richards A., Chiu Y. J., Fung H. L., Bushman D., Chiang H. I., Chun J., Lo Y. H., Zhang K. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24213699 Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.] (англ.) // Nature biotechnology. — 2013. — Vol. 31, no. 12. — P. 1126—1132. — DOI:10.1038/nbt.2720. — PMID 24213699. исправить
  11. ↑ White A. K., VanInsberghe M., Petriv O. I., Hamidi M., Sikorski D., Marra M. A., Piret J., Aparicio S., Hansen C. L. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21808033 High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.] (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2011. — Vol. 108, no. 34. — P. 13999—14004. — DOI:10.1073/pnas.1019446108. — PMID 21808033. исправить
  12. ↑ Macosko E. Z., Basu A., Satija R., Nemesh J., Shekhar K., Goldman M., Tirosh I., Bialas A. R., Kamitaki N., Martersteck E. M., Trombetta J. J., Weitz D. A., Sanes J. R., Shalek A. K., Regev A., McCarroll S. A. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26000488 Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.] (англ.) // Cell. — 2015. — Vol. 161, no. 5. — P. 1202—1214. — DOI:10.1016/j.cell.2015.05.002. — PMID 26000488. исправить
  13. ↑ Thompson A. M., Paguirigan A. L., Kreutz J. E., Radich J. P., Chiu D. T. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24789374 Microfluidics for single-cell genetic analysis.] (англ.) // Lab on a chip. — 2014. — Vol. 14, no. 17. — P. 3135—3142. — DOI:10.1039/c4lc00175c. — PMID 24789374. исправить
  14. ↑ Actis P., Maalouf M. M., Kim H. J., Lohith A., Vilozny B., Seger R. A., Pourmand N. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24279711 Compartmental genomics in living cells revealed by single-cell nanobiopsy.] (англ.) // ACS nano. — 2014. — Vol. 8, no. 1. — P. 546—553. — DOI:10.1021/nn405097u. — PMID 24279711. исправить
  15. ↑ 1 2 3 4 Paez J. G., Lin M., Beroukhim R., Lee J. C., Zhao X., Richter D. J., Gabriel S., Herman P., Sasaki H., Altshuler D., Li C., Meyerson M., Sellers W. R. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15150323 Genome coverage and sequence fidelity of phi29 polymerase-based multiple strand displacement whole genome amplification.] (англ.) // Nucleic acids research. — 2004. — Vol. 32, no. 9. — P. e71. — DOI:10.1093/nar/gnh069. — PMID 15150323. исправить
  16. ↑ Ausubel, F.M. et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. — 1995.
  17. ↑ 1 2 3 4 Hou Y., Wu K., Shi X., Li F., Song L., Wu H., Dean M., Li G., Tsang S., Jiang R., Zhang X., Li B., Liu G., Bedekar N., Lu N., Xie G., Liang H., Chang L., Wang T., Chen J., Li Y., Zhang X., Yang H., Xu X., Wang L., Wang J. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26251698 Comparison of variations detection between whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing.] (англ.) // GigaScience. — 2015. — Vol. 4. — P. 37. — DOI:10.1186/s13742-015-0068-3. — PMID 26251698. исправить
  18. ↑ 1 2 3 4 5 Huang L., Ma F., Chapman A., Lu S., Xie X. S. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26077818 Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications.] (англ.) // Annual review of genomics and human genetics. — 2015. — Vol. 16. — P. 79—102. — DOI:10.1146/annurev-genom-090413-025352. — PMID 26077818. исправить
  19. ↑ Chen M., Song P., Zou D., Hu X., Zhao S., Gao S., Ling F. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25485707 Comparison of multiple displacement amplification (MDA) and multiple annealing and looping-based amplification cycles (MALBAC) in single-cell sequencing.] (англ.) // Public Library of Science ONE. — 2014. — Vol. 9, no. 12. — P. e114520. — DOI:10.1371/journal.pone.0114520. — PMID 25485707. исправить
  20. ↑ 1 2 3 Gawad C., Koh W., Quake S. R. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26806412 Single-cell genome sequencing: current state of the science.] (англ.) // Nature reviews. Genetics. — 2016. — Vol. 17, no. 3. — P. 175—188. — DOI:10.1038/nrg.2015.16. — PMID 26806412. исправить
  21. ↑ 1 2 Abecasis G. R., Auton A., Brooks L. D., DePristo M. A., Durbin R. M., Handsaker R. E., Kang H. M., Marth G. T., McVean G. A. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23128226 An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.] (англ.) // Nature. — 2012. — Vol. 491, no. 7422. — P. 56—65. — DOI:10.1038/nature11632. — PMID 23128226. исправить
  22. ↑ Martin E. R., Lai E. H., Gilbert J. R., Rogala A. R., Afshari A. J., Riley J., Finch K. L., Stevens J. F., Livak K. J., Slotterbeck B. D., Slifer S. H., Warren L. L., Conneally P. M., Schmechel D. E., Purvis I., Pericak-Vance M. A., Roses A. D., Vance J. M. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10869235 SNPing away at complex diseases: analysis of single-nucleotide polymorphisms around APOE in Alzheimer disease.] (англ.) // American journal of human genetics. — 2000. — Vol. 67, no. 2. — P. 383—394. — DOI:10.1086/303003. — PMID 10869235. исправить
  23. ↑ Zhu Y., Spitz M. R., Lei L., Mills G. B., Wu X. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11691799 A single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase-1 promoter enhances lung cancer susceptibility.] (англ.) // Cancer research. — 2001. — Vol. 61, no. 21. — P. 7825—7829. — PMID 11691799. исправить
  24. ↑ 1 2 Schaschl H., Aitman T. J., Vyse T. J. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19220326 Copy number variation in the human genome and its implication in autoimmunity.] (англ.) // Clinical and experimental immunology. — 2009. — Vol. 156, no. 1. — P. 12—16. — DOI:10.1111/j.1365-2249.2008.03865.x. — PMID 19220326. исправить
  25. ↑ McKenna A., Hanna M., Banks E., Sivachenko A., Cibulskis K., Kernytsky A., Garimella K., Altshuler D., Gabriel S., Daly M., DePristo M. A. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20644199 The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.] (англ.) // Genome research. — 2010. — Vol. 20, no. 9. — P. 1297—1303. — DOI:10.1101/gr.107524.110. — PMID 20644199. исправить
  26. ↑ Zhang J., Wheeler D. A., Yakub I., Wei S., Sood R., Rowe W., Liu P. P., Gibbs R. A., Buetow K. H. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16261194 SNPdetector: a software tool for sensitive and accurate SNP detection.] (англ.) // Public Library of Science for Computational Biology. — 2005. — Vol. 1, no. 5. — P. e53. — DOI:10.1371/journal.pcbi.0010053. — PMID 16261194. исправить
  27. ↑ Li R., Li Y., Fang X., Yang H., Wang J., Kristiansen K., Wang J. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19420381 SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.] (англ.) // Genome research. — 2009. — Vol. 19, no. 6. — P. 1124—1132. — DOI:10.1101/gr.088013.108. — PMID 19420381. исправить
  28. ↑ Koboldt D. C., Chen K., Wylie T., Larson D. E., McLellan M. D., Mardis E. R., Weinstock G. M., Wilson R. K., Ding L. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19542151 VarScan: variant detection in massively parallel sequencing of individual and pooled samples.] (англ.) // Bioinformatics. — 2009. — Vol. 25, no. 17. — P. 2283—2285. — DOI:10.1093/bioinformatics/btp373. — PMID 19542151. исправить
  29. ↑ Redon R., Ishikawa S., Fitch K. R., Feuk L., Perry G. H., Andrews T. D., Fiegler H., Shapero M. H., Carson A. R., Chen W., Cho E. K., Dallaire S., Freeman J. L., González J. R., Gratacòs M., Huang J., Kalaitzopoulos D., Komura D., MacDonald J. R., Marshall C. R., Mei R., Montgomery L., Nishimura K., Okamura K., Shen F., Somerville M. J., Tchinda J., Valsesia A., Woodwark C., Yang F., Zhang J., Zerjal T., Zhang J., Armengol L., Conrad D. F., Estivill X., Tyler-Smith C., Carter N. P., Aburatani H., Lee C., Jones K. W., Scherer S. W., Hurles M. E. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17122850 Global variation in copy number in the human genome.] (англ.) // Nature. — 2006. — Vol. 444, no. 7118. — P. 444—454. — DOI:10.1038/nature05329. — PMID 17122850. исправить
  30. ↑ Zhang F., Gu W., Hurles M. E., Lupski J. R. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19715442 Copy number variation in human health, disease, and evolution.] (англ.) // Annual review of genomics and human genetics. — 2009. — Vol. 10. — P. 451—481. — DOI:10.1146/annurev.genom.9.081307.164217. — PMID 19715442. исправить
  31. ↑ Frank B., Bermejo J. L., Hemminki K., Sutter C., Wappenschmidt B., Meindl A., Kiechle-Bahat M., Bugert P., Schmutzler R. K., Bartram C. R., Burwinkel B. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17301065 Copy number variant in the candidate tumor suppressor gene MTUS1 and familial breast cancer risk.] (англ.) // Carcinogenesis. — 2007. — Vol. 28, no. 7. — P. 1442—1445. — DOI:10.1093/carcin/bgm033. — PMID 17301065. исправить
  32. ↑ Glessner J. T., Wang K., Cai G., Korvatska O., Kim C. E., Wood S., Zhang H., Estes A., Brune C. W., Bradfield J. P., Imielinski M., Frackelton E. C., Reichert J., Crawford E. L., Munson J., Sleiman P. M., Chiavacci R., Annaiah K., Thomas K., Hou C., Glaberson W., Flory J., Otieno F., Garris M., Soorya L., Klei L., Piven J., Meyer K. J., Anagnostou E., Sakurai T., Game R. M., Rudd D. S., Zurawiecki D., McDougle C. J., Davis L. K., Miller J., Posey D. J., Michaels S., Kolevzon A., Silverman J. M., Bernier R., Levy S. E., Schultz R. T., Dawson G., Owley T., McMahon W. M., Wassink T. H., Sweeney J. A., Nurnberger J. I., Coon H., Sutcliffe J. S., Minshew N. J., Grant S. F., Bucan M., Cook E. H., Buxbaum J. D., Devlin B., Schellenberg G. D., Hakonarson H. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19404257 Autism genome-wide copy number variation reveals ubiquitin and neuronal genes.] (англ.) // Nature. — 2009. — Vol. 459, no. 7246. — P. 569—573. — DOI:10.1038/nature07953. — PMID 19404257. исправить
  33. ↑ Xie C., Tammi M. T. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19267900 CNV-seq, a new method to detect copy number variation using high-throughput sequencing.] (англ.) // BMC bioinformatics. — 2009. — Vol. 10. — P. 80. — DOI:10.1186/1471-2105-10-80. — PMID 19267900. исправить
  34. ↑ Wang K., Li M., Hadley D., Liu R., Glessner J., Grant S. F., Hakonarson H., Bucan M. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17921354 PennCNV: an integrated hidden Markov model designed for high-resolution copy number variation detection in whole-genome SNP genotyping data.] (англ.) // Genome research. — 2007. — Vol. 17, no. 11. — P. 1665—1674. — DOI:10.1101/gr.6861907. — PMID 17921354. исправить
  35. ↑ Ivakhno S., Royce T., Cox A. J., Evers D. J., Cheetham R. K., Tavaré S. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20966003 CNAseg--a novel framework for identification of copy number changes in cancer from second-generation sequencing data.] (англ.) // Bioinformatics. — 2010. — Vol. 26, no. 24. — P. 3051—3058. — DOI:10.1093/bioinformatics/btq587. — PMID 20966003. исправить
  36. ↑ Miller C. A., Hampton O., Coarfa C., Milosavljevic A. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21305028 ReadDepth: a parallel R package for detecting copy number alterations from short sequencing reads.] (англ.) // Public Library of Science ONE. — 2011. — Vol. 6, no. 1. — P. e16327. — DOI:10.1371/journal.pone.0016327. — PMID 21305028. исправить
  37. ↑ Klambauer G., Schwarzbauer K., Mayr A., Clevert D. A., Mitterecker A., Bodenhofer U., Hochreiter S. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22302147 cn.MOPS: mixture of Poissons for discovering copy number variations in next-generation sequencing data with a low false discovery rate.] (англ.) // Nucleic acids research. — 2012. — Vol. 40, no. 9. — P. e69. — DOI:10.1093/nar/gks003. — PMID 22302147. исправить
  38. ↑ Ning L., Liu G., Li G., Hou Y., Tong Y., He J. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24478987 Current challenges in the bioinformatics of single cell genomics.] (англ.) // Frontiers in oncology. — 2014. — Vol. 4. — P. 7. — DOI:10.3389/fonc.2014.00007. — PMID 24478987. исправить
  39. ↑ Eisen M. B., Spellman P. T., Brown P. O., Botstein D. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9843981 Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.] (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1998. — Vol. 95, no. 25. — P. 14863—14868. — PMID 9843981. исправить
  40. ↑ Prokopenko D., Hecker J., Silverman E. K., Pagano M., Nöthen M. M., Dina C., Lange C., Fier H. L. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26722118 Utilizing the Jaccard index to reveal population stratification in sequencing data: a simulation study and an application to the 1000 Genomes Project.] (англ.) // Bioinformatics. — 2016. — Vol. 32, no. 9. — P. 1366—1372. — DOI:10.1093/bioinformatics/btv752. — PMID 26722118. исправить
  41. ↑ Greaves M., Maley C. C. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22258609 Clonal evolution in cancer.] (англ.) // Nature. — 2012. — Vol. 481, no. 7381. — P. 306—313. — DOI:10.1038/nature10762. — PMID 22258609. исправить
  42. ↑ A. P. Dempster; N. M. Laird; D. B. Rubin [www.isi.edu/natural-language/teaching/cs562/2009/readings/DLR77.pdf Maximum likelihood from incomplete data via the EM algorithm] // Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). — 1977. — Vol. 39, № 1. — P. 1—38. — DOI:10.2307/2984875.
  43. ↑ C. Fraley, A. E. Raftery [www.stat.washington.edu/raftery/Research/PDF/fraley1998.pdf How Many Clusters? Which Clustering Method? Answers Via Model-Based Cluster Analysis] (англ.). — 1998. — DOI:10.1093/comjnl/41.8.578.
  44. ↑ Chris Fraley, Adrian E. Raftery [link.springer.com/article/10.1007/s003579900058 MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis] (англ.) // Journal of Classification. — 1999. — DOI:10.1007/s003579900058.
  45. ↑ 1 2 Kim K. I., Simon R. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24460695 Using single cell sequencing data to model the evolutionary history of a tumor.] (англ.) // BMC bioinformatics. — 2014. — Vol. 15. — P. 27. — DOI:10.1186/1471-2105-15-27. — PMID 24460695. исправить
  46. ↑ Falconer E., Hills M., Naumann U., Poon S. S., Chavez E. A., Sanders A. D., Zhao Y., Hirst M., Lansdorp P. M. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23042453 DNA template strand sequencing of single-cells maps genomic rearrangements at high resolution.] (англ.) // Nature methods. — 2012. — Vol. 9, no. 11. — P. 1107—1112. — DOI:10.1038/nmeth.2206. — PMID 23042453. исправить
  47. ↑ Falconer E., Lansdorp P. M. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23665005 Strand-seq: a unifying tool for studies of chromosome segregation.] (англ.) // Seminars in cell & developmental biology. — 2013. — Vol. 24, no. 8-9. — P. 643—652. — DOI:10.1016/j.semcdb.2013.04.005. — PMID 23665005. исправить
  48. ↑ Coupland P., Chandra T., Quail M., Reik W., Swerdlow H. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23227987 Direct sequencing of small genomes on the Pacific Biosciences RS without library preparation.] (англ.) // BioTechniques. — 2012. — Vol. 53, no. 6. — P. 365—372. — DOI:10.2144/000113962. — PMID 23227987. исправить
  49. ↑ El Hajj N., Trapphoff T., Linke M., May A., Hansmann T., Kuhtz J., Reifenberg K., Heinzmann J., Niemann H., Daser A., Eichenlaub-Ritter U., Zechner U., Haaf T. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21937882 Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.] (англ.) // Epigenetics. — 2011. — Vol. 6, no. 10. — P. 1176—1188. — DOI:10.4161/epi.6.10.17202. — PMID 21937882. исправить
  50. ↑ Guo H., Zhu P., Wu X., Li X., Wen L., Tang F. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24179143 Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing.] (англ.) // Genome research. — 2013. — Vol. 23, no. 12. — P. 2126—2135. — DOI:10.1101/gr.161679.113. — PMID 24179143. исправить
  51. ↑ Nagano T., Lubling Y., Yaffe E., Wingett S. W., Dean W., Tanay A., Fraser P. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26540590 Single-cell Hi-C for genome-wide detection of chromatin interactions that occur simultaneously in a single cell.] (англ.) // Nature protocols. — 2015. — Vol. 10, no. 12. — P. 1986—2003. — DOI:10.1038/nprot.2015.127. — PMID 26540590. исправить
  52. ↑ 1 2 Macaulay I. C., Voet T. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24497842 Single cell genomics: advances and future perspectives.] (англ.) // PLoS genetics. — 2014. — Vol. 10, no. 1. — P. e1004126. — DOI:10.1371/journal.pgen.1004126. — PMID 24497842. исправить

Отрывок, характеризующий Секвенирование ДНК одиночных клеток

Женитьба на богатой невесте в Петербурге не удалась Борису и он с этой же целью приехал в Москву. В Москве Борис находился в нерешительности между двумя самыми богатыми невестами – Жюли и княжной Марьей. Хотя княжна Марья, несмотря на свою некрасивость, и казалась ему привлекательнее Жюли, ему почему то неловко было ухаживать за Болконской. В последнее свое свиданье с ней, в именины старого князя, на все его попытки заговорить с ней о чувствах, она отвечала ему невпопад и очевидно не слушала его.
Жюли, напротив, хотя и особенным, одной ей свойственным способом, но охотно принимала его ухаживанье.
Жюли было 27 лет. После смерти своих братьев, она стала очень богата. Она была теперь совершенно некрасива; но думала, что она не только так же хороша, но еще гораздо больше привлекательна, чем была прежде. В этом заблуждении поддерживало ее то, что во первых она стала очень богатой невестой, а во вторых то, что чем старее она становилась, тем она была безопаснее для мужчин, тем свободнее было мужчинам обращаться с нею и, не принимая на себя никаких обязательств, пользоваться ее ужинами, вечерами и оживленным обществом, собиравшимся у нее. Мужчина, который десять лет назад побоялся бы ездить каждый день в дом, где была 17 ти летняя барышня, чтобы не компрометировать ее и не связать себя, теперь ездил к ней смело каждый день и обращался с ней не как с барышней невестой, а как с знакомой, не имеющей пола.
Дом Карагиных был в эту зиму в Москве самым приятным и гостеприимным домом. Кроме званых вечеров и обедов, каждый день у Карагиных собиралось большое общество, в особенности мужчин, ужинающих в 12 м часу ночи и засиживающихся до 3 го часу. Не было бала, гулянья, театра, который бы пропускала Жюли. Туалеты ее были всегда самые модные. Но, несмотря на это, Жюли казалась разочарована во всем, говорила всякому, что она не верит ни в дружбу, ни в любовь, ни в какие радости жизни, и ожидает успокоения только там . Она усвоила себе тон девушки, понесшей великое разочарованье, девушки, как будто потерявшей любимого человека или жестоко обманутой им. Хотя ничего подобного с ней не случилось, на нее смотрели, как на такую, и сама она даже верила, что она много пострадала в жизни. Эта меланхолия, не мешавшая ей веселиться, не мешала бывавшим у нее молодым людям приятно проводить время. Каждый гость, приезжая к ним, отдавал свой долг меланхолическому настроению хозяйки и потом занимался и светскими разговорами, и танцами, и умственными играми, и турнирами буриме, которые были в моде у Карагиных. Только некоторые молодые люди, в числе которых был и Борис, более углублялись в меланхолическое настроение Жюли, и с этими молодыми людьми она имела более продолжительные и уединенные разговоры о тщете всего мирского, и им открывала свои альбомы, исписанные грустными изображениями, изречениями и стихами.
Жюли была особенно ласкова к Борису: жалела о его раннем разочаровании в жизни, предлагала ему те утешения дружбы, которые она могла предложить, сама так много пострадав в жизни, и открыла ему свой альбом. Борис нарисовал ей в альбом два дерева и написал: Arbres rustiques, vos sombres rameaux secouent sur moi les tenebres et la melancolie. [Сельские деревья, ваши темные сучья стряхивают на меня мрак и меланхолию.]
В другом месте он нарисовал гробницу и написал:
«La mort est secourable et la mort est tranquille
«Ah! contre les douleurs il n'y a pas d'autre asile».
[Смерть спасительна и смерть спокойна;
О! против страданий нет другого убежища.]
Жюли сказала, что это прелестно.
– II y a quelque chose de si ravissant dans le sourire de la melancolie, [Есть что то бесконечно обворожительное в улыбке меланхолии,] – сказала она Борису слово в слово выписанное это место из книги.
– C'est un rayon de lumiere dans l'ombre, une nuance entre la douleur et le desespoir, qui montre la consolation possible. [Это луч света в тени, оттенок между печалью и отчаянием, который указывает на возможность утешения.] – На это Борис написал ей стихи:
«Aliment de poison d'une ame trop sensible,
«Toi, sans qui le bonheur me serait impossible,
«Tendre melancolie, ah, viens me consoler,
«Viens calmer les tourments de ma sombre retraite
«Et mele une douceur secrete
«A ces pleurs, que je sens couler».
[Ядовитая пища слишком чувствительной души,
Ты, без которой счастье было бы для меня невозможно,
Нежная меланхолия, о, приди, меня утешить,
Приди, утиши муки моего мрачного уединения
И присоедини тайную сладость
К этим слезам, которых я чувствую течение.]
Жюли играла Борису нa арфе самые печальные ноктюрны. Борис читал ей вслух Бедную Лизу и не раз прерывал чтение от волнения, захватывающего его дыханье. Встречаясь в большом обществе, Жюли и Борис смотрели друг на друга как на единственных людей в мире равнодушных, понимавших один другого.
Анна Михайловна, часто ездившая к Карагиным, составляя партию матери, между тем наводила верные справки о том, что отдавалось за Жюли (отдавались оба пензенские именья и нижегородские леса). Анна Михайловна, с преданностью воле провидения и умилением, смотрела на утонченную печаль, которая связывала ее сына с богатой Жюли.
– Toujours charmante et melancolique, cette chere Julieie, [Она все так же прелестна и меланхолична, эта милая Жюли.] – говорила она дочери. – Борис говорит, что он отдыхает душой в вашем доме. Он так много понес разочарований и так чувствителен, – говорила она матери.
– Ах, мой друг, как я привязалась к Жюли последнее время, – говорила она сыну, – не могу тебе описать! Да и кто может не любить ее? Это такое неземное существо! Ах, Борис, Борис! – Она замолкала на минуту. – И как мне жалко ее maman, – продолжала она, – нынче она показывала мне отчеты и письма из Пензы (у них огромное имение) и она бедная всё сама одна: ее так обманывают!
Борис чуть заметно улыбался, слушая мать. Он кротко смеялся над ее простодушной хитростью, но выслушивал и иногда выспрашивал ее внимательно о пензенских и нижегородских имениях.
Жюли уже давно ожидала предложенья от своего меланхолического обожателя и готова была принять его; но какое то тайное чувство отвращения к ней, к ее страстному желанию выйти замуж, к ее ненатуральности, и чувство ужаса перед отречением от возможности настоящей любви еще останавливало Бориса. Срок его отпуска уже кончался. Целые дни и каждый божий день он проводил у Карагиных, и каждый день, рассуждая сам с собою, Борис говорил себе, что он завтра сделает предложение. Но в присутствии Жюли, глядя на ее красное лицо и подбородок, почти всегда осыпанный пудрой, на ее влажные глаза и на выражение лица, изъявлявшего всегдашнюю готовность из меланхолии тотчас же перейти к неестественному восторгу супружеского счастия, Борис не мог произнести решительного слова: несмотря на то, что он уже давно в воображении своем считал себя обладателем пензенских и нижегородских имений и распределял употребление с них доходов. Жюли видела нерешительность Бориса и иногда ей приходила мысль, что она противна ему; но тотчас же женское самообольщение представляло ей утешение, и она говорила себе, что он застенчив только от любви. Меланхолия ее однако начинала переходить в раздражительность, и не задолго перед отъездом Бориса, она предприняла решительный план. В то самое время как кончался срок отпуска Бориса, в Москве и, само собой разумеется, в гостиной Карагиных, появился Анатоль Курагин, и Жюли, неожиданно оставив меланхолию, стала очень весела и внимательна к Курагину.
– Mon cher, – сказала Анна Михайловна сыну, – je sais de bonne source que le Prince Basile envoie son fils a Moscou pour lui faire epouser Julieie. [Мой милый, я знаю из верных источников, что князь Василий присылает своего сына в Москву, для того чтобы женить его на Жюли.] Я так люблю Жюли, что мне жалко бы было ее. Как ты думаешь, мой друг? – сказала Анна Михайловна.
Мысль остаться в дураках и даром потерять весь этот месяц тяжелой меланхолической службы при Жюли и видеть все расписанные уже и употребленные как следует в его воображении доходы с пензенских имений в руках другого – в особенности в руках глупого Анатоля, оскорбляла Бориса. Он поехал к Карагиным с твердым намерением сделать предложение. Жюли встретила его с веселым и беззаботным видом, небрежно рассказывала о том, как ей весело было на вчерашнем бале, и спрашивала, когда он едет. Несмотря на то, что Борис приехал с намерением говорить о своей любви и потому намеревался быть нежным, он раздражительно начал говорить о женском непостоянстве: о том, как женщины легко могут переходить от грусти к радости и что у них расположение духа зависит только от того, кто за ними ухаживает. Жюли оскорбилась и сказала, что это правда, что для женщины нужно разнообразие, что всё одно и то же надоест каждому.
– Для этого я бы советовал вам… – начал было Борис, желая сказать ей колкость; но в ту же минуту ему пришла оскорбительная мысль, что он может уехать из Москвы, не достигнув своей цели и даром потеряв свои труды (чего с ним никогда ни в чем не бывало). Он остановился в середине речи, опустил глаза, чтоб не видать ее неприятно раздраженного и нерешительного лица и сказал: – Я совсем не с тем, чтобы ссориться с вами приехал сюда. Напротив… – Он взглянул на нее, чтобы увериться, можно ли продолжать. Всё раздражение ее вдруг исчезло, и беспокойные, просящие глаза были с жадным ожиданием устремлены на него. «Я всегда могу устроиться так, чтобы редко видеть ее», подумал Борис. «А дело начато и должно быть сделано!» Он вспыхнул румянцем, поднял на нее глаза и сказал ей: – «Вы знаете мои чувства к вам!» Говорить больше не нужно было: лицо Жюли сияло торжеством и самодовольством; но она заставила Бориса сказать ей всё, что говорится в таких случаях, сказать, что он любит ее, и никогда ни одну женщину не любил более ее. Она знала, что за пензенские имения и нижегородские леса она могла требовать этого и она получила то, что требовала.
Жених с невестой, не поминая более о деревьях, обсыпающих их мраком и меланхолией, делали планы о будущем устройстве блестящего дома в Петербурге, делали визиты и приготавливали всё для блестящей свадьбы.


Граф Илья Андреич в конце января с Наташей и Соней приехал в Москву. Графиня всё была нездорова, и не могла ехать, – а нельзя было ждать ее выздоровления: князя Андрея ждали в Москву каждый день; кроме того нужно было закупать приданое, нужно было продавать подмосковную и нужно было воспользоваться присутствием старого князя в Москве, чтобы представить ему его будущую невестку. Дом Ростовых в Москве был не топлен; кроме того они приехали на короткое время, графини не было с ними, а потому Илья Андреич решился остановиться в Москве у Марьи Дмитриевны Ахросимовой, давно предлагавшей графу свое гостеприимство.
Поздно вечером четыре возка Ростовых въехали во двор Марьи Дмитриевны в старой Конюшенной. Марья Дмитриевна жила одна. Дочь свою она уже выдала замуж. Сыновья ее все были на службе.
Она держалась всё так же прямо, говорила также прямо, громко и решительно всем свое мнение, и всем своим существом как будто упрекала других людей за всякие слабости, страсти и увлечения, которых возможности она не признавала. С раннего утра в куцавейке, она занималась домашним хозяйством, потом ездила: по праздникам к обедни и от обедни в остроги и тюрьмы, где у нее бывали дела, о которых она никому не говорила, а по будням, одевшись, дома принимала просителей разных сословий, которые каждый день приходили к ней, и потом обедала; за обедом сытным и вкусным всегда бывало человека три четыре гостей, после обеда делала партию в бостон; на ночь заставляла себе читать газеты и новые книги, а сама вязала. Редко она делала исключения для выездов, и ежели выезжала, то ездила только к самым важным лицам в городе.
Она еще не ложилась, когда приехали Ростовы, и в передней завизжала дверь на блоке, пропуская входивших с холода Ростовых и их прислугу. Марья Дмитриевна, с очками спущенными на нос, закинув назад голову, стояла в дверях залы и с строгим, сердитым видом смотрела на входящих. Можно бы было подумать, что она озлоблена против приезжих и сейчас выгонит их, ежели бы она не отдавала в это время заботливых приказаний людям о том, как разместить гостей и их вещи.
– Графские? – сюда неси, говорила она, указывая на чемоданы и ни с кем не здороваясь. – Барышни, сюда налево. Ну, вы что лебезите! – крикнула она на девок. – Самовар чтобы согреть! – Пополнела, похорошела, – проговорила она, притянув к себе за капор разрумянившуюся с мороза Наташу. – Фу, холодная! Да раздевайся же скорее, – крикнула она на графа, хотевшего подойти к ее руке. – Замерз, небось. Рому к чаю подать! Сонюшка, bonjour, – сказала она Соне, этим французским приветствием оттеняя свое слегка презрительное и ласковое отношение к Соне.
Когда все, раздевшись и оправившись с дороги, пришли к чаю, Марья Дмитриевна по порядку перецеловала всех.
– Душой рада, что приехали и что у меня остановились, – говорила она. – Давно пора, – сказала она, значительно взглянув на Наташу… – старик здесь и сына ждут со дня на день. Надо, надо с ним познакомиться. Ну да об этом после поговорим, – прибавила она, оглянув Соню взглядом, показывавшим, что она при ней не желает говорить об этом. – Теперь слушай, – обратилась она к графу, – завтра что же тебе надо? За кем пошлешь? Шиншина? – она загнула один палец; – плаксу Анну Михайловну? – два. Она здесь с сыном. Женится сын то! Потом Безухова чтоль? И он здесь с женой. Он от нее убежал, а она за ним прискакала. Он обедал у меня в середу. Ну, а их – она указала на барышень – завтра свожу к Иверской, а потом и к Обер Шельме заедем. Ведь, небось, всё новое делать будете? С меня не берите, нынче рукава, вот что! Намедни княжна Ирина Васильевна молодая ко мне приехала: страх глядеть, точно два боченка на руки надела. Ведь нынче, что день – новая мода. Да у тебя то у самого какие дела? – обратилась она строго к графу.
– Всё вдруг подошло, – отвечал граф. – Тряпки покупать, а тут еще покупатель на подмосковную и на дом. Уж ежели милость ваша будет, я времечко выберу, съезжу в Маринское на денек, вам девчат моих прикину.
– Хорошо, хорошо, у меня целы будут. У меня как в Опекунском совете. Я их и вывезу куда надо, и побраню, и поласкаю, – сказала Марья Дмитриевна, дотрогиваясь большой рукой до щеки любимицы и крестницы своей Наташи.
На другой день утром Марья Дмитриевна свозила барышень к Иверской и к m me Обер Шальме, которая так боялась Марьи Дмитриевны, что всегда в убыток уступала ей наряды, только бы поскорее выжить ее от себя. Марья Дмитриевна заказала почти всё приданое. Вернувшись она выгнала всех кроме Наташи из комнаты и подозвала свою любимицу к своему креслу.
– Ну теперь поговорим. Поздравляю тебя с женишком. Подцепила молодца! Я рада за тебя; и его с таких лет знаю (она указала на аршин от земли). – Наташа радостно краснела. – Я его люблю и всю семью его. Теперь слушай. Ты ведь знаешь, старик князь Николай очень не желал, чтоб сын женился. Нравный старик! Оно, разумеется, князь Андрей не дитя, и без него обойдется, да против воли в семью входить нехорошо. Надо мирно, любовно. Ты умница, сумеешь обойтись как надо. Ты добренько и умненько обойдись. Вот всё и хорошо будет.
Наташа молчала, как думала Марья Дмитриевна от застенчивости, но в сущности Наташе было неприятно, что вмешивались в ее дело любви князя Андрея, которое представлялось ей таким особенным от всех людских дел, что никто, по ее понятиям, не мог понимать его. Она любила и знала одного князя Андрея, он любил ее и должен был приехать на днях и взять ее. Больше ей ничего не нужно было.
– Ты видишь ли, я его давно знаю, и Машеньку, твою золовку, люблю. Золовки – колотовки, ну а уж эта мухи не обидит. Она меня просила ее с тобой свести. Ты завтра с отцом к ней поедешь, да приласкайся хорошенько: ты моложе ее. Как твой то приедет, а уж ты и с сестрой и с отцом знакома, и тебя полюбили. Так или нет? Ведь лучше будет?
– Лучше, – неохотно отвечала Наташа.


На другой день, по совету Марьи Дмитриевны, граф Илья Андреич поехал с Наташей к князю Николаю Андреичу. Граф с невеселым духом собирался на этот визит: в душе ему было страшно. Последнее свидание во время ополчения, когда граф в ответ на свое приглашение к обеду выслушал горячий выговор за недоставление людей, было памятно графу Илье Андреичу. Наташа, одевшись в свое лучшее платье, была напротив в самом веселом расположении духа. «Не может быть, чтобы они не полюбили меня, думала она: меня все всегда любили. И я так готова сделать для них всё, что они пожелают, так готова полюбить его – за то, что он отец, а ее за то, что она сестра, что не за что им не полюбить меня!»
Они подъехали к старому, мрачному дому на Вздвиженке и вошли в сени.
– Ну, Господи благослови, – проговорил граф, полу шутя, полу серьезно; но Наташа заметила, что отец ее заторопился, входя в переднюю, и робко, тихо спросил, дома ли князь и княжна. После доклада о их приезде между прислугой князя произошло смятение. Лакей, побежавший докладывать о них, был остановлен другим лакеем в зале и они шептали о чем то. В залу выбежала горничная девушка, и торопливо тоже говорила что то, упоминая о княжне. Наконец один старый, с сердитым видом лакей вышел и доложил Ростовым, что князь принять не может, а княжна просит к себе. Первая навстречу гостям вышла m lle Bourienne. Она особенно учтиво встретила отца с дочерью и проводила их к княжне. Княжна с взволнованным, испуганным и покрытым красными пятнами лицом выбежала, тяжело ступая, навстречу к гостям, и тщетно пытаясь казаться свободной и радушной. Наташа с первого взгляда не понравилась княжне Марье. Она ей показалась слишком нарядной, легкомысленно веселой и тщеславной. Княжна Марья не знала, что прежде, чем она увидала свою будущую невестку, она уже была дурно расположена к ней по невольной зависти к ее красоте, молодости и счастию и по ревности к любви своего брата. Кроме этого непреодолимого чувства антипатии к ней, княжна Марья в эту минуту была взволнована еще тем, что при докладе о приезде Ростовых, князь закричал, что ему их не нужно, что пусть княжна Марья принимает, если хочет, а чтоб к нему их не пускали. Княжна Марья решилась принять Ростовых, но всякую минуту боялась, как бы князь не сделал какую нибудь выходку, так как он казался очень взволнованным приездом Ростовых.
– Ну вот, я вам, княжна милая, привез мою певунью, – сказал граф, расшаркиваясь и беспокойно оглядываясь, как будто он боялся, не взойдет ли старый князь. – Уж как я рад, что вы познакомились… Жаль, жаль, что князь всё нездоров, – и сказав еще несколько общих фраз он встал. – Ежели позволите, княжна, на четверть часика вам прикинуть мою Наташу, я бы съездил, тут два шага, на Собачью Площадку, к Анне Семеновне, и заеду за ней.
Илья Андреич придумал эту дипломатическую хитрость для того, чтобы дать простор будущей золовке объясниться с своей невесткой (как он сказал это после дочери) и еще для того, чтобы избежать возможности встречи с князем, которого он боялся. Он не сказал этого дочери, но Наташа поняла этот страх и беспокойство своего отца и почувствовала себя оскорбленною. Она покраснела за своего отца, еще более рассердилась за то, что покраснела и смелым, вызывающим взглядом, говорившим про то, что она никого не боится, взглянула на княжну. Княжна сказала графу, что очень рада и просит его только пробыть подольше у Анны Семеновны, и Илья Андреич уехал.
M lle Bourienne, несмотря на беспокойные, бросаемые на нее взгляды княжны Марьи, желавшей с глазу на глаз поговорить с Наташей, не выходила из комнаты и держала твердо разговор о московских удовольствиях и театрах. Наташа была оскорблена замешательством, происшедшим в передней, беспокойством своего отца и неестественным тоном княжны, которая – ей казалось – делала милость, принимая ее. И потом всё ей было неприятно. Княжна Марья ей не нравилась. Она казалась ей очень дурной собою, притворной и сухою. Наташа вдруг нравственно съёжилась и приняла невольно такой небрежный тон, который еще более отталкивал от нее княжну Марью. После пяти минут тяжелого, притворного разговора, послышались приближающиеся быстрые шаги в туфлях. Лицо княжны Марьи выразило испуг, дверь комнаты отворилась и вошел князь в белом колпаке и халате.


Источник — «http://wiki-org.ru/wiki/index.php?title=Секвенирование_ДНК_одиночных_клеток&oldid=78558635»