Теломераза

Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК (TTAGGG у позвоночных) к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках. Теломеры содержат уплотнённую ДНК и стабилизируют хромосомы. При каждом делении клетки теломерные участки укорачиваются. Существование механизма, компенсирующего укорочение теломер (теломеразы), было предсказано в 1973 году А. М. Оловниковым.

Теломераза является обратной транскриптазой, причём с ней связана особая молекула РНК, которая используется в качестве матрицы для обратной транскрипции во время удлинения теломер.

Теломераза была обнаружена Кэрол Грейдер в 1984 году.

За открытие защитных механизмов хромосом от концевой недорепликации с помощью теломер и теломеразы в 2009 году присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине австралийке, работающей в США, Элизабет Блэкбёрн, американке Кэрол Грейдер и её соотечественнику Джеку Шостаку.

Общие сведения

В результате деятельности теломеразы длина теломерных участков хромосом клетки увеличивается или сохраняется на постоянном уровне, компенсируя таким образом концевую недорепликацию и позволяя клетке делиться неограниченно долго. В ходе исследования этого фермента (состоящего, как описано ниже, из РНК-компонента и белкового компонента) выяснилось, что РНК-компонент экспрессируется на постоянном уровне практически во всех клетках, и для индуцирования теломеразной активности необходима экспрессия белкового компонента, названного поэтому каталитическим компонентом теломеразы. Искусственно индуцированная экспрессия гена каталитического компонента теломеразы (путём введения гена при помощи методов генной инженерии) делает клеточную культуру бессмертной, то есть способной делиться неограниченно долго, отменяя тем самым для культуры предел Хейфлика. Теломераза экспрессируется в стволовых, половых и некоторых других типах клеток организма, которым необходимо постоянно делиться для функционирования определённых тканей (например, клетки эпителия кишечника). Обычные соматические клетки организма лишены теломеразной активности. Клетки 85 % раковых опухолей обладают теломеразной активностью, поэтому считается, что активация теломеразы является одним из событий на пути клетки к злокачественному перерождению.

Строение

Строение человеческой теломеразы было выяснено Скоттом Коэном и его исследовательской группой в австралийском Исследовательском институте детской медицины. Теломераза состоит из теломеразной обратной транскриптазы (TERT), теломеразной РНК (hTR или TERC), и дискерина (по две молекулы каждого из этих веществ). Две субъединицы фермента кодируются двумя различными генами. Кодирующий регион для TERT имеет длину 3396 пар, TERT таким образом содержит 1131 аминокислоту. Этот белок сворачивается и захватывает TERC (имеющую длину 451 нуклеотид), которая не транслируется, оставаясь РНК. TERT имеет форму рукавицы, что позволяет ему закрепляться на хромосоме и добавлять в неё одноцепочечные теломерные участки.

TERT — это обратная транскриптаза, то есть фермент, создающий одноцепочечную ДНК на основе шаблонной одноцепочечной РНК. Такие ферменты (а именно — образцы, полученные из вирусов) используются исследователями в лабораторном процессе полимеразной цепной реакции обратной транскрипции (RT-PCR), при помощи которого создаются копии ДНК на основе заданного РНК-шаблона. TERT же удерживает свой собственный шаблон — TERC.

Профессор Скордалакес и его коллеги первыми выявили полный набор и строение критически важных белков в молекуле теломеразы.

Назначение

Используя TERC, TERT добавляет повторяющуюся последовательность из шести нуклеотидов 5'-TTAGGG к 3'-нити хромосом. Указанная последовательность используется у позвоночных; у других классов организмов последовательности отличаются. Эти повторяющиеся последовательности TTAGGG вместе со своими парными белками и называются теломерами.

Шаблонный участок TERC содержит последовательность 3'-AAUCCC-5'. Теломераза связывает первые несколько нуклеотидов шаблона с последней теломерной последовательностью на хромосоме, добавляет новый повторяющийся участок (5'-TTAGGG-3'), отделяется, связывает новый 3'-конец теломеры с шаблоном и повторяет весь процесс заново.

Объяснение необходимости удлинения теломер приведено в основной статье о теломерах.

Клинические представления

Старение

Теломеразу считают ключом к клеточному бессмертию, «источником юности». Этот фермент позволяет клеткам быстро размножаться без старения. Стволовые клетки эмбрионов, например, экспрессируют теломеразу, которая позволяет им непрерывно делиться, формируя ткани и органы. У взрослых организмов теломераза экспрессируется в клетках, которые должны часто делиться, однако большинство соматических клеток её не производят.

Один из наиболее очевидных признаков старости — сниженная активность клеток кожи. Предполагается, что лечение теломеразой сможет помочь избавиться по крайней мере от этих проблем.

Выяснилось что β-катенин, избежавший деградации благодаря Wnt сигналу, активирует синтез ферментативной субъединицы теломеразы (TERT) в стволовых и раковых клетках. В этом ему помогает один из транскрипционных факторов плюрипотенции — Klf4, направляющий его на промотор гена Tert. Компании [www.reviveskincare.com/ Revive Skincare] и [www.tasciences.com TaSciences.com] выпускают косметические продукты на основе теломераз. По заявлениям Revive, производство одного грамма теломеразы обходится компании в 4 миллиона долларов США. Активной теломеразы в косметических препаратах нет и быть не может, поскольку содержащаяся в составе теломеразы РНК очень быстро разрезается рибонуклеазой А, которая очень распространена в природе. Кроме того и сам фермент не очень стабилен. Активную теломеразу в лабораториях выделяют в стерильных условиях и хранят в замороженном виде (желательно в низкотемпературном холодильнике).

Возникновение многих признаков раннего старения приписывают сокращению теломер. Это, например, прогерия, Атаксия-телангиэктазия, синдром Блума, анемия Фанкони, синдром Наймегена и другие телангиэктазивные нарушения. Гены, мутация которых приводит к этим заболеваниям, задействованы в восстановлении ДНК. Их участие в управлении длиной теломер активно исследуется. Поскольку на настоящий момент неизвестно, насколько разрушение теломер влияет на процесс старения, основные исследования направлены на процессы сохранения целостности ДНК и в особенности её теломерных участков. Майкл Фоссел в одном из [www.singularityweblog.com/michael-fossel-the-telomerase-revolution/ интервью] предположил, что лечение теломеразой может использоваться не только для борьбы с раком, но даже для борьбы со старением человеческого организма и таким образом для увеличения продолжительности жизни. Он считает, что уже в ближайшем десятилетии будут проведены первые испытания теломеразных методов увеличения продолжительности жизни человека. Это весьма обнадёживает, так как примерно в это же время произойдёт массовый уход на пенсию людей поколения беби-бума в США и западной Европе.

Рак

Когда клетки в культуре приближаются к пределу Хейфлика, старение может быть замедлено деактивацией генов, которые кодируют белки, подавляющие образование опухолей. Это, в частности, белок, называемый p53, и белок ретинобластомы (pRb). Измененные таким образом клетки рано или поздно достигают состояния, называемого «кризисом», когда большая часть клеточной культуры умирает. Иногда, однако, клетка не перестаёт делиться при достижении кризиса. Обычно в это время теломеры полностью разрушены и состояние хромосомы ухудшается с каждым делением.

Оголенные концы хромосом распознаются как разрывы обеих цепей ДНК. Повреждения такого рода обычно устраняются путём соединения разорванных концов. Однако в данном случае соединёнными могут оказаться концы разных хромосом, так как они более не защищены теломерами. Это временно позволяет решить проблему отсутствия теломер, однако во время анафазы клеточного деления сцепленные хромосомы разрываются на части случайным образом, что приводит к большому количеству мутаций и хромосомных аномалий.

По мере продолжения этого процесса геном клетки повреждается всё больше. Наконец, наступает момент, когда либо объём повреждённого генетического материала становится достаточным для гибели клетки (путём запрограммированной клеточной смерти — апоптоза), либо происходит дополнительная мутация, активирующая теломеразу.

После активации теломеразы некоторые виды клеток становятся бессмертными: их хромосомы не становятся менее стабильными вне зависимости от числа клеточных делений, и процесс клеточной смерти не запускается. Многие раковые клетки считаются бессмертными, поскольку активность генов теломеразы в них позволяет им делиться практически бесконечно, что и является причиной образования опухолей.

Хороший пример бессмертия раковых клеток — это клетки HeLa, изначально полученные из опухоли шейки матки Генриетты Лекс (Henrietta Lacks, отсюда название культуры HeLa) в 1951 г. Эта культура по сей день используется в лабораторных исследованиях. Клетки Hela в самом деле бессмертны: по оценкам ежедневно производится несколько тонн этих клеток, причём все они являются потомками нескольких клеток, извлечённых из опухоли Г. Лекс.

Несмотря на то, что описанный метод моделирования рака в культуре клеток эффективен и используется уже много лет, он весьма неточен. Какое именно воздействие в рамках этого метода вызывает рождение клеток, образующих опухоли, изначально было неясно. Однако впоследствии удалось ответить на этот вопрос. В модельных клетках вызывались различные мутации, которые встречаются в разных видах человеческих раковых клеток. Это позволило выявить несколько сочетаний мутаций, которые являются достаточными для образования опухолевых клеток из различных их видов.

Собственно сочетания мутаций различается в зависимости от вида клеток. Однако большинство из них содержат следующие изменения:

• активацию теломеразы;
• нарушение цикла белка p53;
• активацию прото-онкогенов Ras, Myc или других;
• нарушение формирования фосфатазы белка PP2A.

Эти изменения приводят к отключению механизма гибели клетки в результате разрушения хромосом или апоптоза. Кроме того клетка начинает непрерывно делиться.

Эта модель рака, созданная в клеточной культуре, проливает свет на роль теломеразы в формирование опухолей у человека. Активация теломеразы наблюдается в 90 % всех опухолей. Это позволяет заключить, что предоставляемое ею бессмертие является ключевым фактором в развитии рака.

Опухоли, в клетках которых TERT не активировался, в основном использовали другой механизм сохранения теломер, называемый ALT (альтернативное удлинение теломер, alternative lengthening of telomeres). Детали этого механизма неизвестны.

Как показано в работе Элизабет Блекбёрн и др., теломераза также участвует в регуляции активности 70 генов, которые участвуют либо подозреваются в участии в образовании и развитии раковых опухолей. Кроме того, она активирует гликолиз, что позволяет раковым клеткам использовать сахара для поддержания заданной скорости роста и деления (эти скорости сравнимы со скоростями роста клеток в зародыше).

Э. Блэкбёрн и ещё двое исследователей получили премию Ласкера в 2006 г. за открытие теломеразы и последующие её исследования. За те же достижения Э. Блэкбёрн также получила премию Грубера по генетике в 2006 г.

Роль теломеразы в других болезнях человека

Считается, что мутации белка TERT вызывают у пациентов предрасположенность к апластической анемии — нарушению кроветворения в костном мозге.

Синдром кошачьего крика (CdCS) — сложное расстройство, включающее в себя утрату дистальной части короткого конца пятой хромосомы. Ген белка TERT располагается в утраченном фрагменте. Предполагается, что потеря этой копии гена является если не причиной, то одним из условий возникновения этой болезни.

Врожденный дискератоз (ВД) — болезнь костного мозга, которая может быть вызвана мутацией в TERC-субъединице теломеразы. Эта мутация является причиной болезни лишь в 5 % случаев, однако в этих случаях болезнь наследуется как доминантное аутосомное расстройство. Мутации в гене дискерина (DKC1) обуславливают примерно 35 % всех случаев ВД; эти мутации — рецессивные Х-связанные.

Пациенты с ВД страдают от серьёзного нарушения функционирования костного мозга, которое проявляется в аномальной пигментации кожи, лейкоплакии (белые бляшки на слизистой ротовой полости), дистрофии ногтей, а также другими симптомами. У носителей мутаций TERC или DKC1 также выявлены более короткие теломеры, а также некорректная активность теломеразы in vitro, по сравнению с особями того же возраста, свободными от мутаций.

Обнаружена целая семья, у членов которой аутосомальный доминантный ВД проявился одновременно с гетерозиготной мутацией TERT. У этих людей скорость сокращения теломер была выше нормальной. Кроме того, фенотип ВД ухудшался с каждым поколением.

Часть исследований показывает, что активация теломеразы не ведет к раку, а наоборот борется с ним.

1. Основным средством защиты организма от рака является иммунная система. По мере старения активность кроветворных стволовых клеток, дающих начало клеткам иммунной системы, снижается из-за укорочения теломер. Теломераза омолаживает иммунную систему и таким образом помогает организму противостоять раку.
2. Когда длина теломер достигает критического значения, клетка вступает в фазу физиологического старения и начинает высвобождать гормоны (или цитокины), повышающие воспалительный статус всего организма и повреждающие окружающие клетки. Теломераза предотвращает это.
3. Когда теломеры клетки становятся слишком короткими, может происходить фрагментация хромосом, что, в свою очередь, может быть причиной озлокачествления. Теломераза предотвращает и это.

В экспериментах на животных все примерно так и выглядит и, судя по всему, теоретические причины беспокойства по поводу теломеразы основаны на не заслуживающей доверия теории.

В печать вышла статья с результатами исследования датских ученых, в рамках которого впервые была проанализирована взаимосвязь между длиной теломер и смертностью членов очень большой популяции. Благодаря размеру популяции эта работа предоставила очень серьезный аргумент в пользу того, что более длинные теломеры являются прогностическим фактором долголетия.

Теломераза как мишень для лекарственных препаратов

С раковыми опухолями очень тяжело бороться, так как иммунная система организма их не опознаёт как чужеродные. Кроме того, раковые клетки бессмертны и будут продолжать делиться при любых условиях. Поскольку в большинстве видов опухолей бессмертие клеток достигается за счёт присутствия в них теломеразы, именно она могла бы быть целью для препаратов против рака. Если какой-либо препарат сможет отключить теломеразу в раковых клетках, процесс сокращения теломер возобновится, по мере деления клеток теломеры разрушатся, возникнут мутации и клетки погибнут.

Экспериментальные препараты, воздействующие на активную теломеразу, тестируются на мышах, и некоторые уже перешли к клиническим испытаниям. Geron Corporation в настоящее время испытывает на людях препараты, использующих ингибирование теломеразы двумя различными способами. Один — это вакцина (GRNVAC1), а другой — липидный препарат (GRN163L). В действительности во многих типах раковых клеток, выращенных в культуре, подавление теломеразы ведёт к быстрой гибели популяции клеток. Между тем существуют определённые препятствия к развитию такого рода лекарств, например, существование альтернативного механизма удлинения теломер. Есть свидетельства, что альтернативные методы поддержания длины теломер и хранения ДНК применены в стволовых раковых клетках. Geron Corp., однако, заявляет, что им удалось уничтожить и стволовые раковые клетки при помощи их ингибитора теломеразы GRN163L. Этот ингибитор присоединяется непосредственно к РНК-шаблону теломеразы. Даже единичная мутация шаблона могла бы полностью лишить теломеразу её способности удлинять теломеры и таким образом лишить клетку возможности бесконечно делиться. В этом случае не может начаться гликолиз, а также не может начаться экспрессия 70 раковых генов Блэкбёрн (Blackburn et al).

Поскольку Блэкбёрн показала, что большинство негативных эффектов теломеразы исчезают при повреждении РНК-шаблона, этот шаблон является довольно эффективной мишенью. Однако если даже некоторые из раковых клеток используют альтернативный метод удлинения теломер, они не погибнут, если РНК-шаблон теломеразы будет заблокирован. По мнению Блэкбёрн, неправильно считать, что только теломераза отвечает за удлинение теломер. Предотвращение в раковых клетках гликолиза, а также предотвращение экспрессии 70 «плохих» генов, вероятно, может убить раковые клетки, не использующие теломеразу.

См. также

• Репарация ДНК
• Рак
• Старение
• Метилирование ДНК
• Предел Хейфлика

Ссылки

• [telomerase.asu.edu/ The Telomerase Database — A Web-based tool for telomerase research.]
• [www.telomerase.org/ Telomerase.org — A blog-style discussion of telomerase and anti-aging therapies.]
• [web.archive.org/web/20040507220247/www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/telomerase_model.gif Three-dimensional model of telomerase] (недоступная ссылка с 13-05-2013 (3995 дней) — история) at Memorial University of Newfoundland

Отрывок, характеризующий Теломераза

Так думал князь Андрей, слушая толки, и очнулся только тогда, когда Паулучи позвал его и все уже расходились.
На другой день на смотру государь спросил у князя Андрея, где он желает служить, и князь Андрей навеки потерял себя в придворном мире, не попросив остаться при особе государя, а попросив позволения служить в армии.


Ростов перед открытием кампании получил письмо от родителей, в котором, кратко извещая его о болезни Наташи и о разрыве с князем Андреем (разрыв этот объясняли ему отказом Наташи), они опять просили его выйти в отставку и приехать домой. Николай, получив это письмо, и не попытался проситься в отпуск или отставку, а написал родителям, что очень жалеет о болезни и разрыве Наташи с ее женихом и что он сделает все возможное для того, чтобы исполнить их желание. Соне он писал отдельно.
«Обожаемый друг души моей, – писал он. – Ничто, кроме чести, не могло бы удержать меня от возвращения в деревню. Но теперь, перед открытием кампании, я бы счел себя бесчестным не только перед всеми товарищами, но и перед самим собою, ежели бы я предпочел свое счастие своему долгу и любви к отечеству. Но это последняя разлука. Верь, что тотчас после войны, ежели я буду жив и все любим тобою, я брошу все и прилечу к тебе, чтобы прижать тебя уже навсегда к моей пламенной груди».
Действительно, только открытие кампании задержало Ростова и помешало ему приехать – как он обещал – и жениться на Соне. Отрадненская осень с охотой и зима со святками и с любовью Сони открыли ему перспективу тихих дворянских радостей и спокойствия, которых он не знал прежде и которые теперь манили его к себе. «Славная жена, дети, добрая стая гончих, лихие десять – двенадцать свор борзых, хозяйство, соседи, служба по выборам! – думал он. Но теперь была кампания, и надо было оставаться в полку. А так как это надо было, то Николай Ростов, по своему характеру, был доволен и той жизнью, которую он вел в полку, и сумел сделать себе эту жизнь приятною.
Приехав из отпуска, радостно встреченный товарищами, Николай был посылал за ремонтом и из Малороссии привел отличных лошадей, которые радовали его и заслужили ему похвалы от начальства. В отсутствие его он был произведен в ротмистры, и когда полк был поставлен на военное положение с увеличенным комплектом, он опять получил свой прежний эскадрон.
Началась кампания, полк был двинут в Польшу, выдавалось двойное жалованье, прибыли новые офицеры, новые люди, лошади; и, главное, распространилось то возбужденно веселое настроение, которое сопутствует началу войны; и Ростов, сознавая свое выгодное положение в полку, весь предался удовольствиям и интересам военной службы, хотя и знал, что рано или поздно придется их покинуть.
Войска отступали от Вильны по разным сложным государственным, политическим и тактическим причинам. Каждый шаг отступления сопровождался сложной игрой интересов, умозаключений и страстей в главном штабе. Для гусар же Павлоградского полка весь этот отступательный поход, в лучшую пору лета, с достаточным продовольствием, был самым простым и веселым делом. Унывать, беспокоиться и интриговать могли в главной квартире, а в глубокой армии и не спрашивали себя, куда, зачем идут. Если жалели, что отступают, то только потому, что надо было выходить из обжитой квартиры, от хорошенькой панны. Ежели и приходило кому нибудь в голову, что дела плохи, то, как следует хорошему военному человеку, тот, кому это приходило в голову, старался быть весел и не думать об общем ходе дел, а думать о своем ближайшем деле. Сначала весело стояли подле Вильны, заводя знакомства с польскими помещиками и ожидая и отбывая смотры государя и других высших командиров. Потом пришел приказ отступить к Свенцянам и истреблять провиант, который нельзя было увезти. Свенцяны памятны были гусарам только потому, что это был пьяный лагерь, как прозвала вся армия стоянку у Свенцян, и потому, что в Свенцянах много было жалоб на войска за то, что они, воспользовавшись приказанием отбирать провиант, в числе провианта забирали и лошадей, и экипажи, и ковры у польских панов. Ростов помнил Свенцяны потому, что он в первый день вступления в это местечко сменил вахмистра и не мог справиться с перепившимися всеми людьми эскадрона, которые без его ведома увезли пять бочек старого пива. От Свенцян отступали дальше и дальше до Дриссы, и опять отступили от Дриссы, уже приближаясь к русским границам.
13 го июля павлоградцам в первый раз пришлось быть в серьезном деле.
12 го июля в ночь, накануне дела, была сильная буря с дождем и грозой. Лето 1812 года вообще было замечательно бурями.
Павлоградские два эскадрона стояли биваками, среди выбитого дотла скотом и лошадьми, уже выколосившегося ржаного поля. Дождь лил ливмя, и Ростов с покровительствуемым им молодым офицером Ильиным сидел под огороженным на скорую руку шалашиком. Офицер их полка, с длинными усами, продолжавшимися от щек, ездивший в штаб и застигнутый дождем, зашел к Ростову.
– Я, граф, из штаба. Слышали подвиг Раевского? – И офицер рассказал подробности Салтановского сражения, слышанные им в штабе.
Ростов, пожимаясь шеей, за которую затекала вода, курил трубку и слушал невнимательно, изредка поглядывая на молодого офицера Ильина, который жался около него. Офицер этот, шестнадцатилетний мальчик, недавно поступивший в полк, был теперь в отношении к Николаю тем, чем был Николай в отношении к Денисову семь лет тому назад. Ильин старался во всем подражать Ростову и, как женщина, был влюблен в него.
Офицер с двойными усами, Здржинский, рассказывал напыщенно о том, как Салтановская плотина была Фермопилами русских, как на этой плотине был совершен генералом Раевским поступок, достойный древности. Здржинский рассказывал поступок Раевского, который вывел на плотину своих двух сыновей под страшный огонь и с ними рядом пошел в атаку. Ростов слушал рассказ и не только ничего не говорил в подтверждение восторга Здржинского, но, напротив, имел вид человека, который стыдился того, что ему рассказывают, хотя и не намерен возражать. Ростов после Аустерлицкой и 1807 года кампаний знал по своему собственному опыту, что, рассказывая военные происшествия, всегда врут, как и сам он врал, рассказывая; во вторых, он имел настолько опытности, что знал, как все происходит на войне совсем не так, как мы можем воображать и рассказывать. И потому ему не нравился рассказ Здржинского, не нравился и сам Здржинский, который, с своими усами от щек, по своей привычке низко нагибался над лицом того, кому он рассказывал, и теснил его в тесном шалаше. Ростов молча смотрел на него. «Во первых, на плотине, которую атаковали, должна была быть, верно, такая путаница и теснота, что ежели Раевский и вывел своих сыновей, то это ни на кого не могло подействовать, кроме как человек на десять, которые были около самого его, – думал Ростов, – остальные и не могли видеть, как и с кем шел Раевский по плотине. Но и те, которые видели это, не могли очень воодушевиться, потому что что им было за дело до нежных родительских чувств Раевского, когда тут дело шло о собственной шкуре? Потом оттого, что возьмут или не возьмут Салтановскую плотину, не зависела судьба отечества, как нам описывают это про Фермопилы. И стало быть, зачем же было приносить такую жертву? И потом, зачем тут, на войне, мешать своих детей? Я бы не только Петю брата не повел бы, даже и Ильина, даже этого чужого мне, но доброго мальчика, постарался бы поставить куда нибудь под защиту», – продолжал думать Ростов, слушая Здржинского. Но он не сказал своих мыслей: он и на это уже имел опыт. Он знал, что этот рассказ содействовал к прославлению нашего оружия, и потому надо было делать вид, что не сомневаешься в нем. Так он и делал.
– Однако мочи нет, – сказал Ильин, замечавший, что Ростову не нравится разговор Здржинского. – И чулки, и рубашка, и под меня подтекло. Пойду искать приюта. Кажется, дождик полегче. – Ильин вышел, и Здржинский уехал.
Через пять минут Ильин, шлепая по грязи, прибежал к шалашу.
– Ура! Ростов, идем скорее. Нашел! Вот тут шагов двести корчма, уж туда забрались наши. Хоть посушимся, и Марья Генриховна там.
Марья Генриховна была жена полкового доктора, молодая, хорошенькая немка, на которой доктор женился в Польше. Доктор, или оттого, что не имел средств, или оттого, что не хотел первое время женитьбы разлучаться с молодой женой, возил ее везде за собой при гусарском полку, и ревность доктора сделалась обычным предметом шуток между гусарскими офицерами.
Ростов накинул плащ, кликнул за собой Лаврушку с вещами и пошел с Ильиным, где раскатываясь по грязи, где прямо шлепая под утихавшим дождем, в темноте вечера, изредка нарушаемой далекими молниями.
– Ростов, ты где?
– Здесь. Какова молния! – переговаривались они.


В покинутой корчме, перед которою стояла кибиточка доктора, уже было человек пять офицеров. Марья Генриховна, полная белокурая немочка в кофточке и ночном чепчике, сидела в переднем углу на широкой лавке. Муж ее, доктор, спал позади ее. Ростов с Ильиным, встреченные веселыми восклицаниями и хохотом, вошли в комнату.
– И! да у вас какое веселье, – смеясь, сказал Ростов.
– А вы что зеваете?
– Хороши! Так и течет с них! Гостиную нашу не замочите.
– Марьи Генриховны платье не запачкать, – отвечали голоса.
Ростов с Ильиным поспешили найти уголок, где бы они, не нарушая скромности Марьи Генриховны, могли бы переменить мокрое платье. Они пошли было за перегородку, чтобы переодеться; но в маленьком чуланчике, наполняя его весь, с одной свечкой на пустом ящике, сидели три офицера, играя в карты, и ни за что не хотели уступить свое место. Марья Генриховна уступила на время свою юбку, чтобы употребить ее вместо занавески, и за этой занавеской Ростов и Ильин с помощью Лаврушки, принесшего вьюки, сняли мокрое и надели сухое платье.
В разломанной печке разложили огонь. Достали доску и, утвердив ее на двух седлах, покрыли попоной, достали самоварчик, погребец и полбутылки рому, и, попросив Марью Генриховну быть хозяйкой, все столпились около нее. Кто предлагал ей чистый носовой платок, чтобы обтирать прелестные ручки, кто под ножки подкладывал ей венгерку, чтобы не было сыро, кто плащом занавешивал окно, чтобы не дуло, кто обмахивал мух с лица ее мужа, чтобы он не проснулся.
– Оставьте его, – говорила Марья Генриховна, робко и счастливо улыбаясь, – он и так спит хорошо после бессонной ночи.
– Нельзя, Марья Генриховна, – отвечал офицер, – надо доктору прислужиться. Все, может быть, и он меня пожалеет, когда ногу или руку резать станет.
Стаканов было только три; вода была такая грязная, что нельзя было решить, когда крепок или некрепок чай, и в самоваре воды было только на шесть стаканов, но тем приятнее было по очереди и старшинству получить свой стакан из пухлых с короткими, не совсем чистыми, ногтями ручек Марьи Генриховны. Все офицеры, казалось, действительно были в этот вечер влюблены в Марью Генриховну. Даже те офицеры, которые играли за перегородкой в карты, скоро бросили игру и перешли к самовару, подчиняясь общему настроению ухаживанья за Марьей Генриховной. Марья Генриховна, видя себя окруженной такой блестящей и учтивой молодежью, сияла счастьем, как ни старалась она скрывать этого и как ни очевидно робела при каждом сонном движении спавшего за ней мужа.
Ложка была только одна, сахару было больше всего, но размешивать его не успевали, и потому было решено, что она будет поочередно мешать сахар каждому. Ростов, получив свой стакан и подлив в него рому, попросил Марью Генриховну размешать.
– Да ведь вы без сахара? – сказала она, все улыбаясь, как будто все, что ни говорила она, и все, что ни говорили другие, было очень смешно и имело еще другое значение.
– Да мне не сахар, мне только, чтоб вы помешали своей ручкой.
Марья Генриховна согласилась и стала искать ложку, которую уже захватил кто то.
– Вы пальчиком, Марья Генриховна, – сказал Ростов, – еще приятнее будет.
– Горячо! – сказала Марья Генриховна, краснея от удовольствия.
Ильин взял ведро с водой и, капнув туда рому, пришел к Марье Генриховне, прося помешать пальчиком.
– Это моя чашка, – говорил он. – Только вложите пальчик, все выпью.
Когда самовар весь выпили, Ростов взял карты и предложил играть в короли с Марьей Генриховной. Кинули жребий, кому составлять партию Марьи Генриховны. Правилами игры, по предложению Ростова, было то, чтобы тот, кто будет королем, имел право поцеловать ручку Марьи Генриховны, а чтобы тот, кто останется прохвостом, шел бы ставить новый самовар для доктора, когда он проснется.
– Ну, а ежели Марья Генриховна будет королем? – спросил Ильин.
– Она и так королева! И приказания ее – закон.
Только что началась игра, как из за Марьи Генриховны вдруг поднялась вспутанная голова доктора. Он давно уже не спал и прислушивался к тому, что говорилось, и, видимо, не находил ничего веселого, смешного или забавного во всем, что говорилось и делалось. Лицо его было грустно и уныло. Он не поздоровался с офицерами, почесался и попросил позволения выйти, так как ему загораживали дорогу. Как только он вышел, все офицеры разразились громким хохотом, а Марья Генриховна до слез покраснела и тем сделалась еще привлекательнее на глаза всех офицеров. Вернувшись со двора, доктор сказал жене (которая перестала уже так счастливо улыбаться и, испуганно ожидая приговора, смотрела на него), что дождь прошел и что надо идти ночевать в кибитку, а то все растащат.
– Да я вестового пошлю… двух! – сказал Ростов. – Полноте, доктор.
– Я сам стану на часы! – сказал Ильин.
– Нет, господа, вы выспались, а я две ночи не спал, – сказал доктор и мрачно сел подле жены, ожидая окончания игры.
Глядя на мрачное лицо доктора, косившегося на свою жену, офицерам стало еще веселей, и многие не могла удерживаться от смеха, которому они поспешно старались приискивать благовидные предлоги. Когда доктор ушел, уведя свою жену, и поместился с нею в кибиточку, офицеры улеглись в корчме, укрывшись мокрыми шинелями; но долго не спали, то переговариваясь, вспоминая испуг доктора и веселье докторши, то выбегая на крыльцо и сообщая о том, что делалось в кибиточке. Несколько раз Ростов, завертываясь с головой, хотел заснуть; но опять чье нибудь замечание развлекало его, опять начинался разговор, и опять раздавался беспричинный, веселый, детский хохот.


В третьем часу еще никто не заснул, как явился вахмистр с приказом выступать к местечку Островне.
Все с тем же говором и хохотом офицеры поспешно стали собираться; опять поставили самовар на грязной воде. Но Ростов, не дождавшись чаю, пошел к эскадрону. Уже светало; дождик перестал, тучи расходились. Было сыро и холодно, особенно в непросохшем платье. Выходя из корчмы, Ростов и Ильин оба в сумерках рассвета заглянули в глянцевитую от дождя кожаную докторскую кибиточку, из под фартука которой торчали ноги доктора и в середине которой виднелся на подушке чепчик докторши и слышалось сонное дыхание.
– Право, она очень мила! – сказал Ростов Ильину, выходившему с ним.
– Прелесть какая женщина! – с шестнадцатилетней серьезностью отвечал Ильин.
Через полчаса выстроенный эскадрон стоял на дороге. Послышалась команда: «Садись! – солдаты перекрестились и стали садиться. Ростов, выехав вперед, скомандовал: «Марш! – и, вытянувшись в четыре человека, гусары, звуча шлепаньем копыт по мокрой дороге, бренчаньем сабель и тихим говором, тронулись по большой, обсаженной березами дороге, вслед за шедшей впереди пехотой и батареей.
Разорванные сине лиловые тучи, краснея на восходе, быстро гнались ветром. Становилось все светлее и светлее. Ясно виднелась та курчавая травка, которая заседает всегда по проселочным дорогам, еще мокрая от вчерашнего дождя; висячие ветви берез, тоже мокрые, качались от ветра и роняли вбок от себя светлые капли. Яснее и яснее обозначались лица солдат. Ростов ехал с Ильиным, не отстававшим от него, стороной дороги, между двойным рядом берез.
Ростов в кампании позволял себе вольность ездить не на фронтовой лошади, а на казацкой. И знаток и охотник, он недавно достал себе лихую донскую, крупную и добрую игреневую лошадь, на которой никто не обскакивал его. Ехать на этой лошади было для Ростова наслаждение. Он думал о лошади, об утре, о докторше и ни разу не подумал о предстоящей опасности.
Прежде Ростов, идя в дело, боялся; теперь он не испытывал ни малейшего чувства страха. Не оттого он не боялся, что он привык к огню (к опасности нельзя привыкнуть), но оттого, что он выучился управлять своей душой перед опасностью. Он привык, идя в дело, думать обо всем, исключая того, что, казалось, было бы интереснее всего другого, – о предстоящей опасности. Сколько он ни старался, ни упрекал себя в трусости первое время своей службы, он не мог этого достигнуть; но с годами теперь это сделалось само собою. Он ехал теперь рядом с Ильиным между березами, изредка отрывая листья с веток, которые попадались под руку, иногда дотрогиваясь ногой до паха лошади, иногда отдавая, не поворачиваясь, докуренную трубку ехавшему сзади гусару, с таким спокойным и беззаботным видом, как будто он ехал кататься. Ему жалко было смотреть на взволнованное лицо Ильина, много и беспокойно говорившего; он по опыту знал то мучительное состояние ожидания страха и смерти, в котором находился корнет, и знал, что ничто, кроме времени, не поможет ему.
Только что солнце показалось на чистой полосе из под тучи, как ветер стих, как будто он не смел портить этого прелестного после грозы летнего утра; капли еще падали, но уже отвесно, – и все затихло. Солнце вышло совсем, показалось на горизонте и исчезло в узкой и длинной туче, стоявшей над ним. Через несколько минут солнце еще светлее показалось на верхнем крае тучи, разрывая ее края. Все засветилось и заблестело. И вместе с этим светом, как будто отвечая ему, раздались впереди выстрелы орудий.
Не успел еще Ростов обдумать и определить, как далеки эти выстрелы, как от Витебска прискакал адъютант графа Остермана Толстого с приказанием идти на рысях по дороге.
Эскадрон объехал пехоту и батарею, также торопившуюся идти скорее, спустился под гору и, пройдя через какую то пустую, без жителей, деревню, опять поднялся на гору. Лошади стали взмыливаться, люди раскраснелись.