Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография — хроматографический метод, основанный на использовании тонкого слоя адсорбента в качестве неподвижной фазы. Он основан на том, что разделяемые вещества по-разному распределяются между сорбирующим слоем и протекающим через него элюентом, вследствие чего расстояние, на которое эти вещества смещаются по слою за одно и то же время, различается. Тонкослойная хроматография предоставляет большие возможности для анализа и разделения веществ, поскольку и сорбент, и элюент могут варьироваться в широких пределах. При этом коммерчески доступен ряд пластинок с различными сорбентами, что делает возможным быстрое и рутинное использование метода. Разновидностью тонкослойной хроматографии является более надёжная и воспроизводимая высокопроизводительная тонкослойная хроматография, при проведении которой используются специальные пластинки и сложное оборудование.

Тонкослойная хроматография была открыта в 1889 году, существенно развита в середине XX века и до настоящего времени широко используется в фармацевтической, медицинской, пищевой сферах, а также в академической и промышленной науке.

История

Предпосылкой к созданию метода стало использование бумажной хроматографии Шёнбейном в 1861 году. Этот метод получил развитие в работах ученика Шёнбейна — Гоппельсредера в 80-х годах XIX века. Методика в то время носила название капиллярного анализа. Работа фактически была забыта, и впоследствии хроматография на целлюлозе была переоткрыта в 1944 году Консденом и др. Впервые метод тонкослойной хроматографии почти в том виде, в котором он известен сейчас, был применён голландским биологом Мартином Бейеринком в 1889 году. Изучая диффузию серной и соляной кислот в желатине, Бейеринк обнаружил, что соляная кислота перемещалась быстрее, чем серная. В своих экспериментах он детектировал зону соляной кислоты путём добавления на слой раствора хлорида серебра, а зону серной кислоты — добавлением раствора хлорида бария. В 1898 году Вийсмен применил подобный метод для определения ферментов в диастазе солода и впервые употребил флуоресцентную детекцию, чувствительность метода на то время позволила определить присутствие вещества в количестве 40 пг. Несмотря на это и колоночная хроматография разработанная М. С. Цветом в начале XX века, и тонкослойная хроматография фактически не использовались до 30-х годов.

В 1938 году Измайлов и Шрайбер сообщили о проведении круговой хроматографии на слое оксида алюминия, нанесённом на стеклянную пластинку. При этом слои разделяемых веществ приобретали вид концентрических кругов. Исследователи продемонстрировали, что метод можно применять для испытания сорбентов и элюентов для колоночной хроматографии.

Существенные успехи в разработке метода ТСХ были достигнуты Ю. Кирхнером и сотрудниками, которые в 1945—1954 годах работали над выделением пахучих веществ из цитрусовых хроматографическими методами. Убедившись в неприменимости бумажной хроматографии для их целей, они разработали метод, сочетающий преимущества бумажной и колоночной хроматографии, однако он не привлёк особого внимания до тех пор, пока не был разрекламирован фирмами Desaga и Merck.

До середины 50-х годов XX века для описания метода использовали термины «хроматография на полосках», «хроматография на пластинках», «хроматография в тонких плёнках», «хроматография в открытой колонке», однако термин «тонкослойная хроматография», который был предложен Э. Шталем в 1956 году оказался настолько удачным, что вытеснил все остальные. Примерно в это же время авторитетный журнал Chemical Abstracts выделил публикации по этой теме отдельным индексом, признав его самостоятельным методом аналитической химии.

Неподвижная фаза

Коммерческие пластинки с нанесённым адсорбционным слоем стали доступны в 1961 году и на сегодняшний день практически вытеснили из употребления самодельные. В качестве подложек обычно используются стекло, пластик или алюминий, на которые наносятся сорбенты с размером частиц 10—20 мкм. Толщина слоя составляет от 100—250 мкм для аналитических пластинок до 2 мм для препаративных пластинок. Стандартный формат пластинок — 20×20 см, но существуют также форматы 10×20, 5×20 и 2,5×5 см. Также пластинку необходимого размера можно вырезать самостоятельно. Существуют также пластинки с каналами, облегчающими нанесение образцов и препятствующие их смешиванию. Пластинки с преадсорбционным слоем производят из материала с более низкой адсорбирующей способностью (целлюлоза, кизельгур). Такие слои служат для очистки образца, а также для формирования узкой полосы перед достижением образцом разделяющего слоя.

Пластинки для высокопроизводительной ТСХ были предложены в 1975 году и также имеют размеры 10×20 и 10×10 см при толщине адсорбционного слоя в 200 мкм. Такие пластинки обладают повышенной разрешающей способностью, более низким пределом обнаружения, требуют меньше растворителя для элюции. В 1995 году появились высокопроизводительные пластинки со сферическими частицами, обладающие ещё более улучшенными свойствами. В 2001 году на рынке были предложены пластинки с монолитным слоем, которые нашли применение лишь в научных исследованиях.

В качестве адсорбентов исторически применялись несколько материалов: оксид алюминия (кислый, нейтральный и основный), кизельгур (очищенная диатомитовая земля), полиамиды, катионообменные смолы. Эти материалы и сегодня упоминаются в учебниках и научных статьях, однако они утратили своё значение, и их производство, в основном, остановлено.

Для упрочнения пластин может использоваться связывающее вещество. Ранее для этих целей, например, в пластинках с силикагелем G, широко использовался гипс в количестве 13 массовых процентов. В современных коммерчески доступных пластинках используются органические связывающие вещества (например, метакрилаты). В литературе описано также применение крахмала и карбоксиметилцеллюлозы. Фактически, связывающее вещество является компонентом неподвижной фазы, поэтому использование различных связывающих веществ может привести к различным результатам хроматографии.

Адсорбционный слой может содержать флуоресцентный индикатор, позволяющий более удобно детектировать положение зон веществ. При облучении индикатора ультрафиолетовым излучением при длине волны 254 нм индикатор испускает зелёное (F₂₅₄) или бледно-голубое (F_{254 s}) излучение. При этом зона вещества, поглощающего ультрафиолет, выглядит тёмной на фоне флуоресцирующего слоя.

Силикагель

Одной из самых важных стационарных фаз является силикагель: он используется в более чем 90 % приложений тонкослойной хроматографии. Его получают путём осаждения кислотой из растворов силикатов или гидролизом производных кремния. Диаметр получаемых частиц зависит от условий получения, например, варьирование pH позволяет получать силикагель с площадью поверхности от 200 до 800 м²/г. С точки зрения химии, поверхность силикагеля содержит силоксановые (Si-O-Si) и силанольные группы (Si-O-H). Силанольные группы могут быть свободными, вицинальными или геминальными. Они также могут взаимодействовать друг с другом за счёт образования водородных связей.

Таким образом, силикагель имеет набор варьируемых параметров, контроль которых может быть разным у различных производителей. Разработаны, однако, методы, позволяющие получать силикагель сферической формы с заданным размером пор. Многие марки имеют размер пор 60 Å и маркируются как «силикагель 60».

Силикагель имеет весьма высокое сродство к воде и быстро устанавливает с ней равновесие, поэтому результат, получаемый при проведении ТСХ, может в некоторой мере зависеть от влажности в помещении.

Оксид алюминия

Оксид алюминия является полярным неорганическим гидрофильным сорбентом. Его получают, термически удаляя воду из гидратированного гидроксида алюминия. Оксид алюминия для хроматографии обычно нагревают до невысокой температуры, получая материал с удельной поверхностью 50—250 м²/г. Сорбированная вода удаляется при температуре 250 °С.

Модифицированные фазы

Силикагель может быть модифицирован тремя типами реакций: этерификацией, взаимодействием с хлорсиланом, содержащим необходимый органический заместитель, или хлорированием с последующей обработкой литийорганическим соединением. Такая модификация приводит к образованию неподвижных фаз с особенными свойствами, которые зависят от природы заместителей и способа их присоединения к силикагелю.

Наиболее распространены обращённые фазы (англ. reversed phases, RP), в которых вводимым в силикагель заместителем является алкильная цепь длиной от 2 до 18 атомов углерода. Фазы С2 вытеснили методики импрегнирования силикагеля парафином или силиконовым маслом для последующего использования в обращённо-фазовой хроматографии. Полноценные обращённые фазы содержат цепи С8 или С18. Гидрофильные фазы содержат на поверхности аминогруппы, диольные группы, нитрильные группы и могут быть использованы как в обращённо-фазовой, так и нормально-фазовой хроматографии. В нормально-фазовом режиме они обладают меньшей удерживающей способностью и нечувствительны к влажности. Такие фазы часто обладают особой селективностью за счёт основности аминогрупп или кислотности гидроксильных групп, что позволяет изменять порядок выхода компонентов анализируемой смеси.

Целлюлоза

Первой формой использования целлюлозы в тонкослойной хроматографии была бумажная хроматография. Доступные пластинки для ТСХ и высокопроизводительной ТСХ позволяют разделять смеси полярных веществ, при этом в качестве элюента используются, по крайней мере, тройные смеси из воды, несмешивающегося с ней органического растворителя и водорастворимого растворителя, способствующего образованию одной фазы.

Обозначения в названиях коммерчески доступных пластинок для ТСХ

Сокращение	Значение
CHIR	Хиральный слой для разделения энантиомеров
CN	Гидрофильный слой с цианогруппами
DIOL	Гидрофильный слой с диольной модификацией
F	Содержит флуоресцентный индикатор
F254+366	Длины волн возбуждения флуоресцентного индикатора
F254s	Кислотоустойчивый флуоресцентный индикатор
G	Гипс
H	Не содержит модификаций
NH2	Гидрофильный слой с аминогруппами
P	Для препаративной работы
R	Специально очищенный
RP	Обращённая фаза
RP-8, RP-18	Обращённая фаза с 8- или 18-углеродным фрагментом
Silanized, RP-2	Обращённая фаза с диметилсилильной модификацией
W	Смачиваемый слой
40, 60,...	Средний размер пор в ангстремах

Подвижная фаза

Подвижная фаза отвечает за перемещение образца по хроматографической системе, и её правильный выбор важен для получения оптимальных результатов. В качестве подвижной фазы ТСХ позволяет использовать как индивидуальный растворитель, так и сложные смеси. При проведении хроматографии на силикагеле обычно используют смеси органических растворителей. В обращённо-фазовой хроматографии применяют смесь воды с органическим растворителем. В обоих случаях подвижная фаза может быть охарактеризована двумя параметрами: силой растворителя, определяющей степень подвижности компонентов образца по сорбенту, и селективностью, влияющей на порядок зон веществ. Минимальным требованием к подвижной фазе является по крайней мере частичная растворимость в ней образца.

Сила растворителя

Сила растворителя — это параметр, определяющий способность подвижной фазы перемещать вещества по сорбенту. Так, слабый растворитель не способен сдвинуть зону вещества с точки нанесения, а сильный, напротив, смещает зону вещества практически с линией фронта. Подходящий элюент сдвигает вещество примерно на 1/3 от общего расстояния, преодолённого элюентом. В случае силикагеля более сильными являются полярные растворители, а более слабыми — неполярные (эта зависимость отличается для различных сорбентов).

Количественное описание силы растворителя даётся параметром E°, который может быть определён как адсорбционная энергия растворителя на единицу стандартного сорбента. На практике расстояние, проходимое веществом, не может быть рассчитано на основе данного параметра, однако возможна относительная оценка: при большем значении E° для элюента вещество проходит больший путь, и наоборот. Для обращённых фаз ситуация противоположная. Расстояние миграции зоны вещества связано также с его полярностью: более полярные вещества сильнее взаимодействуют с силикагелем, и движутся медленнее, в то время как неполярные проявляют более слабое взаимодействия и мигрируют дальше.

Определение подходящего элюента проводится экспериментально. Например, образец может быть отхроматографирован в этилацетате. Если сила этилацетата слишком высока, необходимо перейти к менее полярному растворителю или использовать смесь этилацетата с менее полярным растворителем (например, гексаном). Если же сила растворителя слишком низка, то можно провести эксперимент с более полярным растворителем или повысить силу этилацетата добавлением метанола.

Параметр силы растворителя E° для различных растворителей на оксиде алюминия

Растворитель	E°, Al2O3	Растворитель	E°, Al2O3	Растворитель	E°, Al2O3	Растворитель	E°, Al2O3	Растворитель	E°, Al2O3
Фторалканы	-0,25	Бутилхлорид	0,26	Диэтилсульфид	0,38	Этилацетат	0,58	Этанол	0,88
н-Пентан	0,00	Ксилол	0,26	Хлороформ	0,40	Метилацетат	0,60	Метанол	0,95
Гексан	0,00	Диизопропиловый эфир	0,28	Дихлорметан	0,42	Амиловый спирт	0,61	Этиленгликоль	1,11
Изооктан	0,01	2-Хлорпропан	0,29	Метилизобутилкетон	0,43	Диметилсульфоксид	0,62	Уксусная кислота	большой
Циклогексан	0,04	Толуол	0,29	Тетрагидрофуран	0,45	Анилин	0,62	Вода	большой
Циклопентан	0,05	1-Хлорпропан	0,30	Дихлорэтан	0,49	Диэтиламин	0,63	Соли и буферы	очень большой
Диизобутилен	0,06	Хлорбензол	0,30	Метилэтилкетон	0,51	Нитрометан	0,64
Пентен-1	0,08	Бензол	0,32	1-Нитропропан	0,53	Ацетонитрил	0,65
Сероуглерод	0,15	Бромэтан	0,37	Ацетон	0,56	Пиридин	0,71
Тетрахлорметан	0,18	Диэтиловый эфир	0,38	Диоксан	0,56	Пропиловые спирты	0,82

Качество растворителей

В тонкослойной хроматографии существенную роль может играть качество используемых растворителей. Рекомендуется применять растворители по крайней мере аналитической чистоты, поскольку содержащиеся в элюенте примеси могут взаимодействовать с сорбентом или растворённым веществом. Некоторые растворители при хранении подвергаются автоокислению. Также при хранении растворителей в металлических ёмкостях они могут разлагаться или вступать в иные реакции. Значительный вклад в проблему воспроизводимости вносит содержащаяся в растворителе вода, количество которой может меняться со временем, что приводит к изменению силы элюента. Например, кроме иных примесей, хлороформ часто содержит этанол в качестве стабилизатора, даже малые количества которого могут значительно повлиять на результат хроматографии.

Проведение эксперимента

Приготовление образца

Для правильного приготовления образца необходимо выбрать репрезентативную порцию материала. Обычно для этого необходимо полностью растворить его в подходящем растворителе. Иногда растворить весь образец не удаётся: в этом случае необходимо убедиться, что растворены по крайней мере необходимые вещества. Наличие в веществе большого количества примесей или матрицы может ухудшить результаты анализа или разделения, поэтому предварительно может применяться этап очистки образца методами экстракции. Этот шаг реализуется при использовании пластинок с преадсорбционным слоем, который задерживает полярные компоненты матрицы.

По сравнению с колоночной, тонкослойная хроматография является менее требовательной к примесям, поскольку колонки необходимо отмывать перед нанесением новых образцов, а пластинки для ТСХ используются только один раз.

Подготовка пластинок

Иногда перед постановкой ТСХ пластинки подвергают дополнительным этапам подготовки.

• Предварительная отмывка пластинок служит для их очистки от сорбированных примесей и проводится обычно путём погружения в метанол либо элюированием пустой пластинки в этом элюенте (в последнем случае эффективность отмывки выше).
• Активация предназначена для удаления связанной воды со слоя сорбента. Она проводится путём нагревания пластинок в течение 30 минут при 120 °C (для пластинок с силикагелем). Более сильное и продолжительное нагревание может привести к удалению химически связанной воды и необратимому изменению свойств хроматографического слоя. Активированные пластинки обладают бо́льшими удерживающими свойствами, и подвижность веществ на них замедляется по сравнению с неактивированными пластинками.
• Прекондиционирование представляет собой помещение активированной или неактивированной пластинки в атмосферу заданной влажности или газового состава для того, чтобы хроматографический слой сорбировал то или иное количество воды или другого компонента атмосферы (например, паров элюента). Этот процесс неконтролируемо происходит в сосуде для элюирования, содержащем необходимый растворитель, однако существуют приёмы, позволяющие проводить направленную сорбцию на пластинке. Для этого, например, используются насыщенные растворы некоторых солей, атмосфера над которыми имеет определённую влажность.
• Наконец, полезным может оказаться импрегнирование пластинок органическими или неорганическими веществами для изменения сорбционных свойств слоя. Оно проводится погружением, опрыскиванием или предварительным элюированием импрегнирующим раствором. Типичным примером использования импрегнированного силикагеля в тонкослойной хроматографии может служить анализ ненасыщенных органических веществ на силикагеле, содержащем ионы серебра.

Нанесение образца

Нанесение образца на пластинку существенно влияет на качество получаемого результата. Так, разделение компонентов смеси зависит от размеров нанесённой зоны в направлении проведения хроматографии, а сравнивать образцы по их подвижности можно лишь при позиционно точном нанесении зон на пластинку. При проведении количественного анализа необходимо наносить точно измеренные объёмы растворов веществ.

Существует два способа нанесения образца: ручной и автоматический. В случае ручного нанесения на пластинке карандашом отмечают точки, лежащие на отрезке, параллельном нижнему краю пластинки, и отстоящем от него на такое расстояние, чтобы точки не погружались в элюент. Число точек должно быть равно числу анализируемых образцов. Затем на отмеченные точки при помощи микрокапилляров наносят раствор анализируемого образца, объём которых обычно ограничен 5 мкл в случае ТСХ и 1 мкл в случае высокопроизводительной ТСХ. Большие объёмы растворов наносят несколькими касаниями, высушивая между ними пластинку от растворителя. При этом растворитель, в котором находится образец, должен иметь как можно меньшую полярность, поскольку при нанесении происходит круговая хроматография, которая может приводить к распространению и разделению компонентов образца.

Автоматические и полуавтоматические системы для нанесения образцов используют принцип спрея. Раствор набирается в иглу шприца, игла затем точно позиционируется над поверхностью пластинки, и поршень выдавливает заданный объём раствора. Растворитель удаляется путём обдувания сжатым воздухом или азотом. Технология позволяет создавать узкие зоны веществ, что способствует максимальному разрешению. Нанесение веществ возможно также в виде точек либо прямоугольных зон, а наносимые объёмы могут варьироваться от нескольких нанолитров для высокопроизводительной ТСХ до сотен микролитров для препаративных ТСХ. В последнем случае техника позволяет создать однородную вытянутую зону вдоль всей пластинки.

Элюирование

После нанесения раствора исследуемой смеси веществ пластинка помещается в сосуд, в котором на дне налит слой элюента. При погружении нижнего края пластины в жидкость элюент под действием капиллярных сил начинает подниматься вверх по хроматографическому слою. Сосуд герметизируют для избежания испарения летучего элюента с поверхности пластинки в процессе хроматографирования. После того, как линия фронта достигнет достаточной для анализа высоты, пластинку извлекают и высушивают. Расстояние, проходимое линией фронта, принято отсчитывать от линии старта. Его выбирают достаточным для последующей идентификации разделённых веществ на поверхности пластинки. Разделение компонентов смеси улучшается с увеличением этой дистанции, но она имеет оптимальное значение, которое для обычных пластин составляет величину 12—15 см. Это обусловлено тем, что капиллярные силы действуют на линии фронта смачивания, и подвижная фаза по мере продвижения по хроматографическому слою испытывает всё меньшее воздействие капиллярных сил из-за уравновешивания их силой тяжести.

При проведении хроматографии на оптимальную длину продвижения фронта требуется от 45 до 150 минут в зависимости от вязкости элюента. В случае высокопроизводительной ТСХ, где упаковка частиц хроматографического слоя плотнее, оптимальная дистанция составляет приблизительно 6 см, а элюирование занимает от 15 до 50 минут.

Существуют различные способы элюирования образцов на пластинках. Наиболее распространённым является такой, при котором пластинка размещается вертикально, а элюент поднимается снизу вверх: он даёт приемлемые результаты для большинства целей. Существуют также сосуды, позволяющие направлять подвижную фазу в горизонтальном направлении. Получаемые результаты в этом случае сравнимы со стандартными, но преимущество в том, что подачу элюента можно осуществлять одновременно в двух встречных направлениях, что позволяет удвоить число образцов (на высокопроизводительной пластине размером 20×10 см можно разделить одновременно 72 образца). Круговая и антикруговая хроматография, при которой движение элюента происходит от центра к периферии или наоборот, применяется весьма ограниченно, например, при подборе растворителя для хроматографии.

Многократное элюирование применяется в трудных ситуациях, когда однократное не позволяет эффективно разделить компоненты смеси. При повторном элюировании в одной и той же системе растворителей оптимизация происходит за счёт концентрирования неправильно нанесённых зон веществ. Можно также предварительно провести элюирование в очень полярном растворителе в течение небольшого времени, что позволит сконцентрировать вещества на слое. Предварительное элюирование в неполярном растворителе позволяет удалить неполярную матрицу из объекта.

Двумерное элюирование включает в себя два последовательных элюирования в перпендикулярных направлениях. После первого элюирования пластинка извлекается, просушивается, и линия, на которой расположились разделённые компоненты, становится линией старта во втором элюировании. При этом можно пользоваться двумя элюентами различной силы, а также одним и тем же элюентом, что полезно для оценки устойчивости вещества в хроматографическом эксперименте.

Визуализация

После элюирования разделяемые вещества смеси располагаются на поверхности пластинки в определённых положениях. Для определения их расположения на пластинке предложен ряд методов. Если вещество окрашено, то положение пятна видно визуально и не требует какой-либо дополнительной обработки реактивами или визуализации иными методами. Однако, большинство органических соединений бесцветны. Если вещество поглощает в ультрафиолетовой области, то оно визуализируется на пластинке с флуоресцентным индикатором F₂₅₄ под ультрафиолетовым излучением (пятна таких веществ на пластинке выглядят либо тёмными, либо флуоресцирующими).

Широко применяются более или менее селективные химические методы визуализации. Например, наиболее простой метод заключается в обработке парами иода: при этом сорбированные вещества становятся тёмно-коричневыми, а фон остаётся светлым. Универсальные методы основаны на применении растворов различных кислот или окислителей, при нагревании с которыми вещества образуют коричневые или чёрные пятна. Селективные реагенты, например, нингидрин, позволяют визуализировать соединения конкретного класса — амины и аминокислоты.

Хроматографические тонкослойные пластинки также могут быть использованы в биологических тестах для выявления веществ с биологической активностью к микроорганизмам методом посева культур микроорганизмов в питательной среде на пластины.

Оценка результатов

Визуальное сравнение подвижности и характера визуализации (цвета, флуоресценции) образца и неких стандартов даёт информацию о природе анализируемого вещества, а интенсивность зоны характеризует его количество. Вещества могут также быть смыты с хроматографического слоя для дальнейшего анализа другими методами. Количественная оценка в высокопроизводительной ТСХ проводится по цифровым изображениям после проведения эксперимента согласно стандартизированным методикам. Сканирующая денситометрия даёт информацию о спектральных свойствах веществ на пластинке. Для повышения точности анализа применяется сравнение спектров с записями баз данных, а также масс-спектрометрия разделённых веществ. Количественная оценка также проводится при помощи сканирующего денситометра.

Теория тонкослойной хроматографии

Поток растворителя

Поток подвижной фазы через слой в тонкослойной хроматографии вызван действием капиллярных сил. Движение фронта жидкости можно описать квадратичной зависимостью:

<math>z_f^2 = \varkappa t,</math>

где z_f — расстояние от линии погружения до линии фронта, t — время элюирования, а ϰ — постоянная потока, или коэффициент скорости. Эта зависимость была установлена в 1856 г. инженером Анри Дарси, который исследовал скорость проникновения почвенных вод через пористую поверхность. Данное уравнение свидетельствует о том, что скорость миграции фронта гиперболически убывает с увеличением пути миграции. Так, например, при заданном значении ϰ = 3,3 см²/с миграция фронта на 10 см занимает 30 минут, а на 15 см — 68 минут. Постоянная потока ϰ определяется диаметром частиц сорбента, а также отношением поверхностного натяжения элюента к его вязкости. Сорбированная на слое вода часто связывается со слоем более сильно, чем компоненты элюента. В таком случае попавшая в слой вода снижает пористость слоя и увеличивает скорость прохождения элюента. Если сила элюента и воды сопоставима, то элюент вытесняет воду из слоя.

Изотерма сорбции

Любой хроматографический процесс основан на перераспределении вещества между подвижной и стационарной фазами. Это равновесие связано с температурой, причём при её повышении обычно доля вещества в подвижной фазе увеличивается. Для численного описания равновесия вводятся коэффициенты перераспределения:

<math>K = \frac{C_s}{C_m},</math>

где С_s и С_m — это концентрации вещества в сорбирующей и несорбирующей фазах соответственно. Коэффициент перераспределения определяет угол наклона изотермы сорбции — линейного графика зависимости между С_s и С_m при постоянной температуре. Интерес представляет случай искривлённой изотермы сорбции: в этом случае наклон кривой зависит от концентрации, и пятна на хроматограмме размываются. Для вогнутой изотермы сорбции (где K снижается при увеличении концентрации вещества) у пятна образуется «хвост». При выпуклой изотерме сорбции наблюдается противоположная ситуация: размывается передняя часть пятна.

Подобные эффекты объясняются кинетическими процессами (т. н. сопротивлением массопередаче) или нелинейным характером изотермы сорбции («перегрузкой»). В сложных смесях компоненты могут влиять друг на друга и создавать условия взаимной перегрузки. В этом случае К снижается.

Как правило, в аналитических приложениях нелинейность изотерм сорбции нежелательна, поскольку она приводит к размытию зон и изменению подвижностей пятен. Спрямление изотерм может быть достигнуто путём дезактивации сорбента (например, при добавлении воды или при повышении элюирующей силы растворителя). В этом случае наиболее активные сорбционные центры занимаются дезактивирующими добавками, и сорбирующий слой становится более однородным.

Положение зон на пластинке

Обычным и самым простым параметром, описывающим положение зоны вещества на пластинке, является фактор удерживания:

<math>R_f = \frac{z_x}{z_f-z_0},</math>

где z_x — расстояние, пройденное зоной, а z_f – z₀ — расстояние от линии старта до фронта растворителя. Этот параметр легко измеряется, однако он не содержит информации об условиях хроматографического процесса. По этой причине предложены другие определения данного параметра R_f' как относительного времени пребывания вещества в подвижной фазе либо доли молекул сорбата в подвижной фазе и др.

Вычисляемое значение фактора удерживания всегда меньше единицы, поэтому для удобства введён параметр hR_f, который всегда выражается как целое число и используется для количественного описания положения зоны на пластинке:

<math>hR_f = R_f \cdot 100.</math>

Как правило, измерение расстояния, пройденного веществом, проводится от точки старта до середины зоны вещества. Такой метод подходит для зон небольшого размера, однако в анализах чистоты фармацевтических препаратов, где загрузка вещества достигает 1000 мкг на точку, пятна часто уширяются настолько, что значение hR_f колеблется в области 18 единиц. К тому же, если рядом с такой точкой элюировать образец с гораздо более низкой концентрацией, то центр получившейся точки небольшого размера вряд ли точно совпадёт с центром уширенной зоны. Поэтому значение hR_f иногда дают в виде интервала, охватывающего значения от нижней части зоны до её верхней части.

Принципиально иным параметром является значение R_st, вычисляемое как частное от деления пути, пройденного веществом, на путь, пройденный некоторым эталонным веществом. В настоящее время этот параметр практически утратил своё значение.

<math>R_{st} = \frac{z_x}{z_{st}}</math>

Параметры разделения

Для того чтобы чётко описать степень разделения двух веществ, в тонкослойной хроматографии вводится параметр разрешающей способности R_s, которая определяется путём деления расстояния между центрами двух пятен z_x2 — z_x1 на ширину хроматографического пика:

<math>R_s = \frac{z_{x2} - z_{x1}}{2(\sigma_2 + \sigma_1)}.</math>

Из уравнения видно, что чем выше расстояние между центрами пятен, тем разделение лучше, а чем шире пятна (соответственно, больше параметр σ — среднеквадратическое отклонение), тем вещества разделены хуже. При R_s = 0,5 расстояние между пятнами составляет σ₁ + σ₂ ≈ 2σ. То есть в данном случае происходит «разделение на 2σ» и перекрывается 20 % площади двух зон. При разделении на 4σ перекрывается лишь 3 % площади.

Применение

Выделяют три основных области применения тонкослойной хроматографии.

1. Демонстрация основ хроматографии, быстрые предварительные эксперименты для оптимизации препаративных хроматографических разделений.
2. Исследовательские инструменты в академической и прикладной промышленной науке, используемые для изучения большого числа образцов; комбинация планарного разделения с биологической, спектроскопической и масс-спектрометрической детекцией (замена методу колоночной хроматографии).
3. Идентификация медицинских и пищевых растительных компонентов по валидированным методикам с повышенными требованиями к точности, воспроизводимости и чувствительности.

Литература

Книги

• Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография) = Fundamentals of Thin Layer Chromatography (Planar Chromatography) / Пер. с англ. М. А. Кошевник и Б. Н. Лапина, под ред. В. Г. Берёзкина. — 1988. — Т. 1.
• Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография) = Fundamentals of Thin Layer Chromatography (Planar Chromatography) / Пер. с англ. М. А. Кошевник и Б. Н. Лапина, под ред. В. Г. Берёзкина. — 1988. — Т. 2.
• Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография / Пер. с англ. Д. Н. Соколова и М. И. Яновского, под ред. В. Г. Берёзкина. — М.: Мир, 1981. — Т. 1. — 616 с. — 5000 экз.
• Hahn-Deinstrop E. Applied Thin-Layer Chromatography. — 2nd Ed. — Wiley, 2007. — ISBN 978-3-527-31553-6.
• Reich E., Widmer V. Thin Layer Chromatography // Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. — Wiley, 2012. — DOI:10.1002/14356007.b05_301.pub2

Обзоры

• Cheng S.-C., Huang M.-Z., Shiea J. Thin layer chromatography/mass spectrometry (англ.) // Journal of Chromatography A. — 2011. — Vol. 1218, no. 19. — P. 2700—2711. — DOI:10.1016/j.chroma.2011.01.077. — PMID 21334632.
• Del Bubba M., Checchini L., Lepri L. Thin-layer chromatography enantioseparations on chiral stationary phases: a review (англ.) // Analytical and Bioanalytical Chemistry. — 2013. — Vol. 405, no. 2—3. — P. 533—554. — DOI:10.1007/s00216-012-6514-5. — PMID 23161065.
• Fuchs B., Süss R., Teuber K., Eibisch M., Schiller J. Lipid analysis by thin-layer chromatography — A review of the current state (англ.) // Journal of Chromatography A. — 2011. — Vol. 1218, no. 19. — P. 2754—2774. — DOI:10.1016/j.chroma.2010.11.066. — PMID 21167493.
• Morlock G., Schwack W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry (англ.) // TrAC Trends in Analytical Chemistry. — 2010. — Vol. 29, no. 10. — P. 1157—1171. — DOI:10.1016/j.trac.2010.07.010.
• Poole C. F. Planar chromatography at the turn of the century (англ.) // Journal of Chromatography A. — 1999. — Vol. 856, no. 1—2. — P. 399—427. — DOI:10.1016/S0021-9673(99)00430-6. — PMID 10526797.
• Poole S. K., Poole C. F. High performance stationary phases for planar chromatography (англ.) // Journal of Chromatography A. — 2011. — Vol. 1218, no. 19. — P. 2648—2660. — DOI:10.1016/j.chroma.2010.10.072.
• Rabel F., Sherma J. [www.chromatographyonline.com/lcgc/Articles/Stationary-Phases-for-Modern-Thin-Layer-Chromatogr/ArticleStandard/Article/detail/778037 Stationary Phases for Modern Thin-Layer Chromatography] (англ.) // LCGC North America. — 2012. — Vol. 30, no. 6. — P. 458—473.
• Renger B., Végh Z., Ferenczi-Fodor K. Validation of thin layer and high performance thin layer chromatographic methods (англ.) // Journal of Chromatography A. — 2011. — Vol. 1218, no. 19. — P. 2712—2721. — DOI:10.1016/j.chroma.2011.01.059. — PMID 21329932.
• Sherma J. Review of advances in the thin layer chromatography of pesticides: 2010-2012 (англ.) // Journal of Environmental Science and Health, Part B: Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes. — 2013. — Vol. 48, no. 6. — P. 417—430. — DOI:10.1080/03601234.2012.761526. — PMID 23452207.

Отрывок, характеризующий Тонкослойная хроматография

– Что ж, он, право, хороший человек; с ним служить можно, – сказал Тимохин субалтерн офицеру, шедшему подле него.
– Одно слово, червонный!… (полкового командира прозвали червонным королем) – смеясь, сказал субалтерн офицер.
Счастливое расположение духа начальства после смотра перешло и к солдатам. Рота шла весело. Со всех сторон переговаривались солдатские голоса.
– Как же сказывали, Кутузов кривой, об одном глазу?
– А то нет! Вовсе кривой.
– Не… брат, глазастее тебя. Сапоги и подвертки – всё оглядел…
– Как он, братец ты мой, глянет на ноги мне… ну! думаю…
– А другой то австрияк, с ним был, словно мелом вымазан. Как мука, белый. Я чай, как амуницию чистят!
– Что, Федешоу!… сказывал он, что ли, когда стражения начнутся, ты ближе стоял? Говорили всё, в Брунове сам Бунапарте стоит.
– Бунапарте стоит! ишь врет, дура! Чего не знает! Теперь пруссак бунтует. Австрияк его, значит, усмиряет. Как он замирится, тогда и с Бунапартом война откроется. А то, говорит, в Брунове Бунапарте стоит! То то и видно, что дурак. Ты слушай больше.
– Вишь черти квартирьеры! Пятая рота, гляди, уже в деревню заворачивает, они кашу сварят, а мы еще до места не дойдем.
– Дай сухарика то, чорт.
– А табаку то вчера дал? То то, брат. Ну, на, Бог с тобой.
– Хоть бы привал сделали, а то еще верст пять пропрем не емши.
– То то любо было, как немцы нам коляски подавали. Едешь, знай: важно!
– А здесь, братец, народ вовсе оголтелый пошел. Там всё как будто поляк был, всё русской короны; а нынче, брат, сплошной немец пошел.
– Песенники вперед! – послышался крик капитана.
И перед роту с разных рядов выбежало человек двадцать. Барабанщик запевало обернулся лицом к песенникам, и, махнув рукой, затянул протяжную солдатскую песню, начинавшуюся: «Не заря ли, солнышко занималося…» и кончавшуюся словами: «То то, братцы, будет слава нам с Каменскиим отцом…» Песня эта была сложена в Турции и пелась теперь в Австрии, только с тем изменением, что на место «Каменскиим отцом» вставляли слова: «Кутузовым отцом».
Оторвав по солдатски эти последние слова и махнув руками, как будто он бросал что то на землю, барабанщик, сухой и красивый солдат лет сорока, строго оглянул солдат песенников и зажмурился. Потом, убедившись, что все глаза устремлены на него, он как будто осторожно приподнял обеими руками какую то невидимую, драгоценную вещь над головой, подержал ее так несколько секунд и вдруг отчаянно бросил ее:
Ах, вы, сени мои, сени!
«Сени новые мои…», подхватили двадцать голосов, и ложечник, несмотря на тяжесть амуниции, резво выскочил вперед и пошел задом перед ротой, пошевеливая плечами и угрожая кому то ложками. Солдаты, в такт песни размахивая руками, шли просторным шагом, невольно попадая в ногу. Сзади роты послышались звуки колес, похрускиванье рессор и топот лошадей.
Кутузов со свитой возвращался в город. Главнокомандующий дал знак, чтобы люди продолжали итти вольно, и на его лице и на всех лицах его свиты выразилось удовольствие при звуках песни, при виде пляшущего солдата и весело и бойко идущих солдат роты. Во втором ряду, с правого фланга, с которого коляска обгоняла роты, невольно бросался в глаза голубоглазый солдат, Долохов, который особенно бойко и грациозно шел в такт песни и глядел на лица проезжающих с таким выражением, как будто он жалел всех, кто не шел в это время с ротой. Гусарский корнет из свиты Кутузова, передразнивавший полкового командира, отстал от коляски и подъехал к Долохову.
Гусарский корнет Жерков одно время в Петербурге принадлежал к тому буйному обществу, которым руководил Долохов. За границей Жерков встретил Долохова солдатом, но не счел нужным узнать его. Теперь, после разговора Кутузова с разжалованным, он с радостью старого друга обратился к нему:
– Друг сердечный, ты как? – сказал он при звуках песни, ровняя шаг своей лошади с шагом роты.
– Я как? – отвечал холодно Долохов, – как видишь.
Бойкая песня придавала особенное значение тону развязной веселости, с которой говорил Жерков, и умышленной холодности ответов Долохова.
– Ну, как ладишь с начальством? – спросил Жерков.
– Ничего, хорошие люди. Ты как в штаб затесался?
– Прикомандирован, дежурю.
Они помолчали.
«Выпускала сокола да из правого рукава», говорила песня, невольно возбуждая бодрое, веселое чувство. Разговор их, вероятно, был бы другой, ежели бы они говорили не при звуках песни.
– Что правда, австрийцев побили? – спросил Долохов.
– А чорт их знает, говорят.
– Я рад, – отвечал Долохов коротко и ясно, как того требовала песня.
– Что ж, приходи к нам когда вечерком, фараон заложишь, – сказал Жерков.
– Или у вас денег много завелось?
– Приходи.
– Нельзя. Зарок дал. Не пью и не играю, пока не произведут.
– Да что ж, до первого дела…
– Там видно будет.
Опять они помолчали.
– Ты заходи, коли что нужно, все в штабе помогут… – сказал Жерков.
Долохов усмехнулся.
– Ты лучше не беспокойся. Мне что нужно, я просить не стану, сам возьму.
– Да что ж, я так…
– Ну, и я так.
– Прощай.
– Будь здоров…
… и высоко, и далеко,
На родиму сторону…
Жерков тронул шпорами лошадь, которая раза три, горячась, перебила ногами, не зная, с какой начать, справилась и поскакала, обгоняя роту и догоняя коляску, тоже в такт песни.


Возвратившись со смотра, Кутузов, сопутствуемый австрийским генералом, прошел в свой кабинет и, кликнув адъютанта, приказал подать себе некоторые бумаги, относившиеся до состояния приходивших войск, и письма, полученные от эрцгерцога Фердинанда, начальствовавшего передовою армией. Князь Андрей Болконский с требуемыми бумагами вошел в кабинет главнокомандующего. Перед разложенным на столе планом сидели Кутузов и австрийский член гофкригсрата.
– А… – сказал Кутузов, оглядываясь на Болконского, как будто этим словом приглашая адъютанта подождать, и продолжал по французски начатый разговор.
– Я только говорю одно, генерал, – говорил Кутузов с приятным изяществом выражений и интонации, заставлявшим вслушиваться в каждое неторопливо сказанное слово. Видно было, что Кутузов и сам с удовольствием слушал себя. – Я только одно говорю, генерал, что ежели бы дело зависело от моего личного желания, то воля его величества императора Франца давно была бы исполнена. Я давно уже присоединился бы к эрцгерцогу. И верьте моей чести, что для меня лично передать высшее начальство армией более меня сведущему и искусному генералу, какими так обильна Австрия, и сложить с себя всю эту тяжкую ответственность для меня лично было бы отрадой. Но обстоятельства бывают сильнее нас, генерал.
И Кутузов улыбнулся с таким выражением, как будто он говорил: «Вы имеете полное право не верить мне, и даже мне совершенно всё равно, верите ли вы мне или нет, но вы не имеете повода сказать мне это. И в этом то всё дело».
Австрийский генерал имел недовольный вид, но не мог не в том же тоне отвечать Кутузову.
– Напротив, – сказал он ворчливым и сердитым тоном, так противоречившим лестному значению произносимых слов, – напротив, участие вашего превосходительства в общем деле высоко ценится его величеством; но мы полагаем, что настоящее замедление лишает славные русские войска и их главнокомандующих тех лавров, которые они привыкли пожинать в битвах, – закончил он видимо приготовленную фразу.
Кутузов поклонился, не изменяя улыбки.
– А я так убежден и, основываясь на последнем письме, которым почтил меня его высочество эрцгерцог Фердинанд, предполагаю, что австрийские войска, под начальством столь искусного помощника, каков генерал Мак, теперь уже одержали решительную победу и не нуждаются более в нашей помощи, – сказал Кутузов.
Генерал нахмурился. Хотя и не было положительных известий о поражении австрийцев, но было слишком много обстоятельств, подтверждавших общие невыгодные слухи; и потому предположение Кутузова о победе австрийцев было весьма похоже на насмешку. Но Кутузов кротко улыбался, всё с тем же выражением, которое говорило, что он имеет право предполагать это. Действительно, последнее письмо, полученное им из армии Мака, извещало его о победе и о самом выгодном стратегическом положении армии.
– Дай ка сюда это письмо, – сказал Кутузов, обращаясь к князю Андрею. – Вот изволите видеть. – И Кутузов, с насмешливою улыбкой на концах губ, прочел по немецки австрийскому генералу следующее место из письма эрцгерцога Фердинанда: «Wir haben vollkommen zusammengehaltene Krafte, nahe an 70 000 Mann, um den Feind, wenn er den Lech passirte, angreifen und schlagen zu konnen. Wir konnen, da wir Meister von Ulm sind, den Vortheil, auch von beiden Uferien der Donau Meister zu bleiben, nicht verlieren; mithin auch jeden Augenblick, wenn der Feind den Lech nicht passirte, die Donau ubersetzen, uns auf seine Communikations Linie werfen, die Donau unterhalb repassiren und dem Feinde, wenn er sich gegen unsere treue Allirte mit ganzer Macht wenden wollte, seine Absicht alabald vereitelien. Wir werden auf solche Weise den Zeitpunkt, wo die Kaiserlich Ruseische Armee ausgerustet sein wird, muthig entgegenharren, und sodann leicht gemeinschaftlich die Moglichkeit finden, dem Feinde das Schicksal zuzubereiten, so er verdient». [Мы имеем вполне сосредоточенные силы, около 70 000 человек, так что мы можем атаковать и разбить неприятеля в случае переправы его через Лех. Так как мы уже владеем Ульмом, то мы можем удерживать за собою выгоду командования обоими берегами Дуная, стало быть, ежеминутно, в случае если неприятель не перейдет через Лех, переправиться через Дунай, броситься на его коммуникационную линию, ниже перейти обратно Дунай и неприятелю, если он вздумает обратить всю свою силу на наших верных союзников, не дать исполнить его намерение. Таким образом мы будем бодро ожидать времени, когда императорская российская армия совсем изготовится, и затем вместе легко найдем возможность уготовить неприятелю участь, коей он заслуживает».]
Кутузов тяжело вздохнул, окончив этот период, и внимательно и ласково посмотрел на члена гофкригсрата.
– Но вы знаете, ваше превосходительство, мудрое правило, предписывающее предполагать худшее, – сказал австрийский генерал, видимо желая покончить с шутками и приступить к делу.
Он невольно оглянулся на адъютанта.
– Извините, генерал, – перебил его Кутузов и тоже поворотился к князю Андрею. – Вот что, мой любезный, возьми ты все донесения от наших лазутчиков у Козловского. Вот два письма от графа Ностица, вот письмо от его высочества эрцгерцога Фердинанда, вот еще, – сказал он, подавая ему несколько бумаг. – И из всего этого чистенько, на французском языке, составь mеmorandum, записочку, для видимости всех тех известий, которые мы о действиях австрийской армии имели. Ну, так то, и представь его превосходительству.
Князь Андрей наклонил голову в знак того, что понял с первых слов не только то, что было сказано, но и то, что желал бы сказать ему Кутузов. Он собрал бумаги, и, отдав общий поклон, тихо шагая по ковру, вышел в приемную.
Несмотря на то, что еще не много времени прошло с тех пор, как князь Андрей оставил Россию, он много изменился за это время. В выражении его лица, в движениях, в походке почти не было заметно прежнего притворства, усталости и лени; он имел вид человека, не имеющего времени думать о впечатлении, какое он производит на других, и занятого делом приятным и интересным. Лицо его выражало больше довольства собой и окружающими; улыбка и взгляд его были веселее и привлекательнее.
Кутузов, которого он догнал еще в Польше, принял его очень ласково, обещал ему не забывать его, отличал от других адъютантов, брал с собою в Вену и давал более серьезные поручения. Из Вены Кутузов писал своему старому товарищу, отцу князя Андрея:
«Ваш сын, – писал он, – надежду подает быть офицером, из ряду выходящим по своим занятиям, твердости и исполнительности. Я считаю себя счастливым, имея под рукой такого подчиненного».
В штабе Кутузова, между товарищами сослуживцами и вообще в армии князь Андрей, так же как и в петербургском обществе, имел две совершенно противоположные репутации.
Одни, меньшая часть, признавали князя Андрея чем то особенным от себя и от всех других людей, ожидали от него больших успехов, слушали его, восхищались им и подражали ему; и с этими людьми князь Андрей был прост и приятен. Другие, большинство, не любили князя Андрея, считали его надутым, холодным и неприятным человеком. Но с этими людьми князь Андрей умел поставить себя так, что его уважали и даже боялись.
Выйдя в приемную из кабинета Кутузова, князь Андрей с бумагами подошел к товарищу,дежурному адъютанту Козловскому, который с книгой сидел у окна.
– Ну, что, князь? – спросил Козловский.
– Приказано составить записку, почему нейдем вперед.
– А почему?
Князь Андрей пожал плечами.
– Нет известия от Мака? – спросил Козловский.
– Нет.
– Ежели бы правда, что он разбит, так пришло бы известие.
– Вероятно, – сказал князь Андрей и направился к выходной двери; но в то же время навстречу ему, хлопнув дверью, быстро вошел в приемную высокий, очевидно приезжий, австрийский генерал в сюртуке, с повязанною черным платком головой и с орденом Марии Терезии на шее. Князь Андрей остановился.
– Генерал аншеф Кутузов? – быстро проговорил приезжий генерал с резким немецким выговором, оглядываясь на обе стороны и без остановки проходя к двери кабинета.
– Генерал аншеф занят, – сказал Козловский, торопливо подходя к неизвестному генералу и загораживая ему дорогу от двери. – Как прикажете доложить?
Неизвестный генерал презрительно оглянулся сверху вниз на невысокого ростом Козловского, как будто удивляясь, что его могут не знать.
– Генерал аншеф занят, – спокойно повторил Козловский.
Лицо генерала нахмурилось, губы его дернулись и задрожали. Он вынул записную книжку, быстро начертил что то карандашом, вырвал листок, отдал, быстрыми шагами подошел к окну, бросил свое тело на стул и оглянул бывших в комнате, как будто спрашивая: зачем они на него смотрят? Потом генерал поднял голову, вытянул шею, как будто намереваясь что то сказать, но тотчас же, как будто небрежно начиная напевать про себя, произвел странный звук, который тотчас же пресекся. Дверь кабинета отворилась, и на пороге ее показался Кутузов. Генерал с повязанною головой, как будто убегая от опасности, нагнувшись, большими, быстрыми шагами худых ног подошел к Кутузову.
– Vous voyez le malheureux Mack, [Вы видите несчастного Мака.] – проговорил он сорвавшимся голосом.
Лицо Кутузова, стоявшего в дверях кабинета, несколько мгновений оставалось совершенно неподвижно. Потом, как волна, пробежала по его лицу морщина, лоб разгладился; он почтительно наклонил голову, закрыл глаза, молча пропустил мимо себя Мака и сам за собой затворил дверь.
Слух, уже распространенный прежде, о разбитии австрийцев и о сдаче всей армии под Ульмом, оказывался справедливым. Через полчаса уже по разным направлениям были разосланы адъютанты с приказаниями, доказывавшими, что скоро и русские войска, до сих пор бывшие в бездействии, должны будут встретиться с неприятелем.
Князь Андрей был один из тех редких офицеров в штабе, который полагал свой главный интерес в общем ходе военного дела. Увидав Мака и услыхав подробности его погибели, он понял, что половина кампании проиграна, понял всю трудность положения русских войск и живо вообразил себе то, что ожидает армию, и ту роль, которую он должен будет играть в ней.
Невольно он испытывал волнующее радостное чувство при мысли о посрамлении самонадеянной Австрии и о том, что через неделю, может быть, придется ему увидеть и принять участие в столкновении русских с французами, впервые после Суворова.
Но он боялся гения Бонапарта, который мог оказаться сильнее всей храбрости русских войск, и вместе с тем не мог допустить позора для своего героя.
Взволнованный и раздраженный этими мыслями, князь Андрей пошел в свою комнату, чтобы написать отцу, которому он писал каждый день. Он сошелся в коридоре с своим сожителем Несвицким и шутником Жерковым; они, как всегда, чему то смеялись.
– Что ты так мрачен? – спросил Несвицкий, заметив бледное с блестящими глазами лицо князя Андрея.
– Веселиться нечему, – отвечал Болконский.
В то время как князь Андрей сошелся с Несвицким и Жерковым, с другой стороны коридора навстречу им шли Штраух, австрийский генерал, состоявший при штабе Кутузова для наблюдения за продовольствием русской армии, и член гофкригсрата, приехавшие накануне. По широкому коридору было достаточно места, чтобы генералы могли свободно разойтись с тремя офицерами; но Жерков, отталкивая рукой Несвицкого, запыхавшимся голосом проговорил:
– Идут!… идут!… посторонитесь, дорогу! пожалуйста дорогу!
Генералы проходили с видом желания избавиться от утруждающих почестей. На лице шутника Жеркова выразилась вдруг глупая улыбка радости, которой он как будто не мог удержать.
– Ваше превосходительство, – сказал он по немецки, выдвигаясь вперед и обращаясь к австрийскому генералу. – Имею честь поздравить.
Он наклонил голову и неловко, как дети, которые учатся танцовать, стал расшаркиваться то одной, то другой ногой.
Генерал, член гофкригсрата, строго оглянулся на него; не заметив серьезность глупой улыбки, не мог отказать в минутном внимании. Он прищурился, показывая, что слушает.
– Имею честь поздравить, генерал Мак приехал,совсем здоров,только немного тут зашибся, – прибавил он,сияя улыбкой и указывая на свою голову.
Генерал нахмурился, отвернулся и пошел дальше.
– Gott, wie naiv! [Боже мой, как он прост!] – сказал он сердито, отойдя несколько шагов.
Несвицкий с хохотом обнял князя Андрея, но Болконский, еще более побледнев, с злобным выражением в лице, оттолкнул его и обратился к Жеркову. То нервное раздражение, в которое его привели вид Мака, известие об его поражении и мысли о том, что ожидает русскую армию, нашло себе исход в озлоблении на неуместную шутку Жеркова.
– Если вы, милостивый государь, – заговорил он пронзительно с легким дрожанием нижней челюсти, – хотите быть шутом , то я вам в этом не могу воспрепятствовать; но объявляю вам, что если вы осмелитесь другой раз скоморошничать в моем присутствии, то я вас научу, как вести себя.
Несвицкий и Жерков так были удивлены этой выходкой, что молча, раскрыв глаза, смотрели на Болконского.
– Что ж, я поздравил только, – сказал Жерков.
– Я не шучу с вами, извольте молчать! – крикнул Болконский и, взяв за руку Несвицкого, пошел прочь от Жеркова, не находившего, что ответить.
– Ну, что ты, братец, – успокоивая сказал Несвицкий.
– Как что? – заговорил князь Андрей, останавливаясь от волнения. – Да ты пойми, что мы, или офицеры, которые служим своему царю и отечеству и радуемся общему успеху и печалимся об общей неудаче, или мы лакеи, которым дела нет до господского дела. Quarante milles hommes massacres et l'ario mee de nos allies detruite, et vous trouvez la le mot pour rire, – сказал он, как будто этою французскою фразой закрепляя свое мнение. – C'est bien pour un garcon de rien, comme cet individu, dont vous avez fait un ami, mais pas pour vous, pas pour vous. [Сорок тысяч человек погибло и союзная нам армия уничтожена, а вы можете при этом шутить. Это простительно ничтожному мальчишке, как вот этот господин, которого вы сделали себе другом, но не вам, не вам.] Мальчишкам только можно так забавляться, – сказал князь Андрей по русски, выговаривая это слово с французским акцентом, заметив, что Жерков мог еще слышать его.
Он подождал, не ответит ли что корнет. Но корнет повернулся и вышел из коридора.


Гусарский Павлоградский полк стоял в двух милях от Браунау. Эскадрон, в котором юнкером служил Николай Ростов, расположен был в немецкой деревне Зальценек. Эскадронному командиру, ротмистру Денисову, известному всей кавалерийской дивизии под именем Васьки Денисова, была отведена лучшая квартира в деревне. Юнкер Ростов с тех самых пор, как он догнал полк в Польше, жил вместе с эскадронным командиром.
11 октября, в тот самый день, когда в главной квартире всё было поднято на ноги известием о поражении Мака, в штабе эскадрона походная жизнь спокойно шла по старому. Денисов, проигравший всю ночь в карты, еще не приходил домой, когда Ростов, рано утром, верхом, вернулся с фуражировки. Ростов в юнкерском мундире подъехал к крыльцу, толконув лошадь, гибким, молодым жестом скинул ногу, постоял на стремени, как будто не желая расстаться с лошадью, наконец, спрыгнул и крикнул вестового.
– А, Бондаренко, друг сердечный, – проговорил он бросившемуся стремглав к его лошади гусару. – Выводи, дружок, – сказал он с тою братскою, веселою нежностию, с которою обращаются со всеми хорошие молодые люди, когда они счастливы.
– Слушаю, ваше сиятельство, – отвечал хохол, встряхивая весело головой.
– Смотри же, выводи хорошенько!
Другой гусар бросился тоже к лошади, но Бондаренко уже перекинул поводья трензеля. Видно было, что юнкер давал хорошо на водку, и что услужить ему было выгодно. Ростов погладил лошадь по шее, потом по крупу и остановился на крыльце.
«Славно! Такая будет лошадь!» сказал он сам себе и, улыбаясь и придерживая саблю, взбежал на крыльцо, погромыхивая шпорами. Хозяин немец, в фуфайке и колпаке, с вилами, которыми он вычищал навоз, выглянул из коровника. Лицо немца вдруг просветлело, как только он увидал Ростова. Он весело улыбнулся и подмигнул: «Schon, gut Morgen! Schon, gut Morgen!» [Прекрасно, доброго утра!] повторял он, видимо, находя удовольствие в приветствии молодого человека.
– Schon fleissig! [Уже за работой!] – сказал Ростов всё с тою же радостною, братскою улыбкой, какая не сходила с его оживленного лица. – Hoch Oestreicher! Hoch Russen! Kaiser Alexander hoch! [Ура Австрийцы! Ура Русские! Император Александр ура!] – обратился он к немцу, повторяя слова, говоренные часто немцем хозяином.
Немец засмеялся, вышел совсем из двери коровника, сдернул
колпак и, взмахнув им над головой, закричал:
– Und die ganze Welt hoch! [И весь свет ура!]
Ростов сам так же, как немец, взмахнул фуражкой над головой и, смеясь, закричал: «Und Vivat die ganze Welt»! Хотя не было никакой причины к особенной радости ни для немца, вычищавшего свой коровник, ни для Ростова, ездившего со взводом за сеном, оба человека эти с счастливым восторгом и братскою любовью посмотрели друг на друга, потрясли головами в знак взаимной любви и улыбаясь разошлись – немец в коровник, а Ростов в избу, которую занимал с Денисовым.
– Что барин? – спросил он у Лаврушки, известного всему полку плута лакея Денисова.
– С вечера не бывали. Верно, проигрались, – отвечал Лаврушка. – Уж я знаю, коли выиграют, рано придут хвастаться, а коли до утра нет, значит, продулись, – сердитые придут. Кофею прикажете?
– Давай, давай.
Через 10 минут Лаврушка принес кофею. Идут! – сказал он, – теперь беда. – Ростов заглянул в окно и увидал возвращающегося домой Денисова. Денисов был маленький человек с красным лицом, блестящими черными глазами, черными взлохмоченными усами и волосами. На нем был расстегнутый ментик, спущенные в складках широкие чикчиры, и на затылке была надета смятая гусарская шапочка. Он мрачно, опустив голову, приближался к крыльцу.
– Лавг'ушка, – закричал он громко и сердито. – Ну, снимай, болван!
– Да я и так снимаю, – отвечал голос Лаврушки.
– А! ты уж встал, – сказал Денисов, входя в комнату.
– Давно, – сказал Ростов, – я уже за сеном сходил и фрейлен Матильда видел.
– Вот как! А я пг'одулся, бг'ат, вчег'а, как сукин сын! – закричал Денисов, не выговаривая р . – Такого несчастия! Такого несчастия! Как ты уехал, так и пошло. Эй, чаю!
Денисов, сморщившись, как бы улыбаясь и выказывая свои короткие крепкие зубы, начал обеими руками с короткими пальцами лохматить, как пес, взбитые черные, густые волосы.
– Чог'т меня дег'нул пойти к этой кг'ысе (прозвище офицера), – растирая себе обеими руками лоб и лицо, говорил он. – Можешь себе пг'едставить, ни одной каг'ты, ни одной, ни одной каг'ты не дал.
Денисов взял подаваемую ему закуренную трубку, сжал в кулак, и, рассыпая огонь, ударил ею по полу, продолжая кричать.
– Семпель даст, паг'оль бьет; семпель даст, паг'оль бьет.
Он рассыпал огонь, разбил трубку и бросил ее. Денисов помолчал и вдруг своими блестящими черными глазами весело взглянул на Ростова.
– Хоть бы женщины были. А то тут, кг'оме как пить, делать нечего. Хоть бы дг'аться ског'ей.
– Эй, кто там? – обратился он к двери, заслышав остановившиеся шаги толстых сапог с бряцанием шпор и почтительное покашливанье.
– Вахмистр! – сказал Лаврушка.
Денисов сморщился еще больше.
– Сквег'но, – проговорил он, бросая кошелек с несколькими золотыми. – Г`остов, сочти, голубчик, сколько там осталось, да сунь кошелек под подушку, – сказал он и вышел к вахмистру.
Ростов взял деньги и, машинально, откладывая и ровняя кучками старые и новые золотые, стал считать их.
– А! Телянин! Здог'ово! Вздули меня вчег'а! – послышался голос Денисова из другой комнаты.
– У кого? У Быкова, у крысы?… Я знал, – сказал другой тоненький голос, и вслед за тем в комнату вошел поручик Телянин, маленький офицер того же эскадрона.
Ростов кинул под подушку кошелек и пожал протянутую ему маленькую влажную руку. Телянин был перед походом за что то переведен из гвардии. Он держал себя очень хорошо в полку; но его не любили, и в особенности Ростов не мог ни преодолеть, ни скрывать своего беспричинного отвращения к этому офицеру.
– Ну, что, молодой кавалерист, как вам мой Грачик служит? – спросил он. (Грачик была верховая лошадь, подъездок, проданная Теляниным Ростову.)
Поручик никогда не смотрел в глаза человеку, с кем говорил; глаза его постоянно перебегали с одного предмета на другой.
– Я видел, вы нынче проехали…
– Да ничего, конь добрый, – отвечал Ростов, несмотря на то, что лошадь эта, купленная им за 700 рублей, не стоила и половины этой цены. – Припадать стала на левую переднюю… – прибавил он. – Треснуло копыто! Это ничего. Я вас научу, покажу, заклепку какую положить.
– Да, покажите пожалуйста, – сказал Ростов.
– Покажу, покажу, это не секрет. А за лошадь благодарить будете.
– Так я велю привести лошадь, – сказал Ростов, желая избавиться от Телянина, и вышел, чтобы велеть привести лошадь.
В сенях Денисов, с трубкой, скорчившись на пороге, сидел перед вахмистром, который что то докладывал. Увидав Ростова, Денисов сморщился и, указывая через плечо большим пальцем в комнату, в которой сидел Телянин, поморщился и с отвращением тряхнулся.
– Ох, не люблю молодца, – сказал он, не стесняясь присутствием вахмистра.
Ростов пожал плечами, как будто говоря: «И я тоже, да что же делать!» и, распорядившись, вернулся к Телянину.
Телянин сидел всё в той же ленивой позе, в которой его оставил Ростов, потирая маленькие белые руки.
«Бывают же такие противные лица», подумал Ростов, входя в комнату.
– Что же, велели привести лошадь? – сказал Телянин, вставая и небрежно оглядываясь.
– Велел.
– Да пойдемте сами. Я ведь зашел только спросить Денисова о вчерашнем приказе. Получили, Денисов?
– Нет еще. А вы куда?
– Вот хочу молодого человека научить, как ковать лошадь, – сказал Телянин.
Они вышли на крыльцо и в конюшню. Поручик показал, как делать заклепку, и ушел к себе.
Когда Ростов вернулся, на столе стояла бутылка с водкой и лежала колбаса. Денисов сидел перед столом и трещал пером по бумаге. Он мрачно посмотрел в лицо Ростову.
– Ей пишу, – сказал он.
Он облокотился на стол с пером в руке, и, очевидно обрадованный случаю быстрее сказать словом всё, что он хотел написать, высказывал свое письмо Ростову.
– Ты видишь ли, дг'уг, – сказал он. – Мы спим, пока не любим. Мы дети пг`axa… а полюбил – и ты Бог, ты чист, как в пег'вый день создания… Это еще кто? Гони его к чог'ту. Некогда! – крикнул он на Лаврушку, который, нисколько не робея, подошел к нему.
– Да кому ж быть? Сами велели. Вахмистр за деньгами пришел.
Денисов сморщился, хотел что то крикнуть и замолчал.
– Сквег'но дело, – проговорил он про себя. – Сколько там денег в кошельке осталось? – спросил он у Ростова.
– Семь новых и три старых.
– Ах,сквег'но! Ну, что стоишь, чучела, пошли вахмистг'а, – крикнул Денисов на Лаврушку.
– Пожалуйста, Денисов, возьми у меня денег, ведь у меня есть, – сказал Ростов краснея.
– Не люблю у своих занимать, не люблю, – проворчал Денисов.
– А ежели ты у меня не возьмешь деньги по товарищески, ты меня обидишь. Право, у меня есть, – повторял Ростов.
– Да нет же.
И Денисов подошел к кровати, чтобы достать из под подушки кошелек.
– Ты куда положил, Ростов?
– Под нижнюю подушку.
– Да нету.
Денисов скинул обе подушки на пол. Кошелька не было.
– Вот чудо то!
– Постой, ты не уронил ли? – сказал Ростов, по одной поднимая подушки и вытрясая их.
Он скинул и отряхнул одеяло. Кошелька не было.
– Уж не забыл ли я? Нет, я еще подумал, что ты точно клад под голову кладешь, – сказал Ростов. – Я тут положил кошелек. Где он? – обратился он к Лаврушке.
– Я не входил. Где положили, там и должен быть.
– Да нет…
– Вы всё так, бросите куда, да и забудете. В карманах то посмотрите.
– Нет, коли бы я не подумал про клад, – сказал Ростов, – а то я помню, что положил.
Лаврушка перерыл всю постель, заглянул под нее, под стол, перерыл всю комнату и остановился посреди комнаты. Денисов молча следил за движениями Лаврушки и, когда Лаврушка удивленно развел руками, говоря, что нигде нет, он оглянулся на Ростова.
– Г'остов, ты не школьнич…
Ростов почувствовал на себе взгляд Денисова, поднял глаза и в то же мгновение опустил их. Вся кровь его, бывшая запертою где то ниже горла, хлынула ему в лицо и глаза. Он не мог перевести дыхание.
– И в комнате то никого не было, окромя поручика да вас самих. Тут где нибудь, – сказал Лаврушка.
– Ну, ты, чог'това кукла, повог`ачивайся, ищи, – вдруг закричал Денисов, побагровев и с угрожающим жестом бросаясь на лакея. – Чтоб был кошелек, а то запог'ю. Всех запог'ю!
Ростов, обходя взглядом Денисова, стал застегивать куртку, подстегнул саблю и надел фуражку.
– Я тебе говог'ю, чтоб был кошелек, – кричал Денисов, тряся за плечи денщика и толкая его об стену.
– Денисов, оставь его; я знаю кто взял, – сказал Ростов, подходя к двери и не поднимая глаз.
Денисов остановился, подумал и, видимо поняв то, на что намекал Ростов, схватил его за руку.
– Вздог'! – закричал он так, что жилы, как веревки, надулись у него на шее и лбу. – Я тебе говог'ю, ты с ума сошел, я этого не позволю. Кошелек здесь; спущу шкуг`у с этого мег`завца, и будет здесь.
– Я знаю, кто взял, – повторил Ростов дрожащим голосом и пошел к двери.
– А я тебе говог'ю, не смей этого делать, – закричал Денисов, бросаясь к юнкеру, чтоб удержать его.
Но Ростов вырвал свою руку и с такою злобой, как будто Денисов был величайший враг его, прямо и твердо устремил на него глаза.
– Ты понимаешь ли, что говоришь? – сказал он дрожащим голосом, – кроме меня никого не было в комнате. Стало быть, ежели не то, так…
Он не мог договорить и выбежал из комнаты.
– Ах, чог'т с тобой и со всеми, – были последние слова, которые слышал Ростов.
Ростов пришел на квартиру Телянина.
– Барина дома нет, в штаб уехали, – сказал ему денщик Телянина. – Или что случилось? – прибавил денщик, удивляясь на расстроенное лицо юнкера.
– Нет, ничего.
– Немного не застали, – сказал денщик.
Штаб находился в трех верстах от Зальценека. Ростов, не заходя домой, взял лошадь и поехал в штаб. В деревне, занимаемой штабом, был трактир, посещаемый офицерами. Ростов приехал в трактир; у крыльца он увидал лошадь Телянина.
Во второй комнате трактира сидел поручик за блюдом сосисок и бутылкою вина.
– А, и вы заехали, юноша, – сказал он, улыбаясь и высоко поднимая брови.
– Да, – сказал Ростов, как будто выговорить это слово стоило большого труда, и сел за соседний стол.
Оба молчали; в комнате сидели два немца и один русский офицер. Все молчали, и слышались звуки ножей о тарелки и чавканье поручика. Когда Телянин кончил завтрак, он вынул из кармана двойной кошелек, изогнутыми кверху маленькими белыми пальцами раздвинул кольца, достал золотой и, приподняв брови, отдал деньги слуге.
– Пожалуйста, поскорее, – сказал он.
Золотой был новый. Ростов встал и подошел к Телянину.
– Позвольте посмотреть мне кошелек, – сказал он тихим, чуть слышным голосом.
С бегающими глазами, но всё поднятыми бровями Телянин подал кошелек.
– Да, хорошенький кошелек… Да… да… – сказал он и вдруг побледнел. – Посмотрите, юноша, – прибавил он.
Ростов взял в руки кошелек и посмотрел и на него, и на деньги, которые были в нем, и на Телянина. Поручик оглядывался кругом, по своей привычке и, казалось, вдруг стал очень весел.
– Коли будем в Вене, всё там оставлю, а теперь и девать некуда в этих дрянных городишках, – сказал он. – Ну, давайте, юноша, я пойду.
Ростов молчал.
– А вы что ж? тоже позавтракать? Порядочно кормят, – продолжал Телянин. – Давайте же.
Он протянул руку и взялся за кошелек. Ростов выпустил его. Телянин взял кошелек и стал опускать его в карман рейтуз, и брови его небрежно поднялись, а рот слегка раскрылся, как будто он говорил: «да, да, кладу в карман свой кошелек, и это очень просто, и никому до этого дела нет».
– Ну, что, юноша? – сказал он, вздохнув и из под приподнятых бровей взглянув в глаза Ростова. Какой то свет глаз с быстротою электрической искры перебежал из глаз Телянина в глаза Ростова и обратно, обратно и обратно, всё в одно мгновение.
– Подите сюда, – проговорил Ростов, хватая Телянина за руку. Он почти притащил его к окну. – Это деньги Денисова, вы их взяли… – прошептал он ему над ухом.
– Что?… Что?… Как вы смеете? Что?… – проговорил Телянин.
Но эти слова звучали жалобным, отчаянным криком и мольбой о прощении. Как только Ростов услыхал этот звук голоса, с души его свалился огромный камень сомнения. Он почувствовал радость и в то же мгновение ему стало жалко несчастного, стоявшего перед ним человека; но надо было до конца довести начатое дело.
– Здесь люди Бог знает что могут подумать, – бормотал Телянин, схватывая фуражку и направляясь в небольшую пустую комнату, – надо объясниться…
– Я это знаю, и я это докажу, – сказал Ростов.
– Я…
Испуганное, бледное лицо Телянина начало дрожать всеми мускулами; глаза всё так же бегали, но где то внизу, не поднимаясь до лица Ростова, и послышались всхлипыванья.
– Граф!… не губите молодого человека… вот эти несчастные деньги, возьмите их… – Он бросил их на стол. – У меня отец старик, мать!…
Ростов взял деньги, избегая взгляда Телянина, и, не говоря ни слова, пошел из комнаты. Но у двери он остановился и вернулся назад. – Боже мой, – сказал он со слезами на глазах, – как вы могли это сделать?