Vault (органелла)

Vault, или цитоплазмати́ческий рибонуклеопротеи́н vault (с англ. — «свод»), — эукариотическая органелла, химически представляет собой рибонуклеопротеин. Под электронным микроскопом эти органеллы напоминают свод купола собора с осью симметрии 39-го порядка. Функции vault плохо изучены, однако к настоящему времени имеются свидетельства об участии их в различных сигнальных путях клетки. Возможно, vault вовлечены в развитие явления множественной лекарственной устойчивости к противораковой химиотерапии. Они имеются во многих типах эукариотических клеток и высококонсервативны среди эукариот.

История изучения

Vault были открыты и успешно выделены из печени крысы в 1986 году клеточным биологом Нэнси Кедерша (англ. Nancy Kedersha) и биохимиком Леонардом Ромом (англ. Leonard Rome) из Школы Медицины Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Первоначально vault были описаны как яйцевидные частицы, загрязнявшие препараты окаймлённых клатрином везикул. Частицы были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и электрофореза в агарозном геле. Оказалось, что они имеют симметричную бочонковидную структуру, похожую на свод готического собора, за что частицы и получили своё название (от англ. vault — свод). Первоначально размер vault был оценен в 35 × 35 × 65 нм³, но позднее с использованием методов криоэлектронной микроскопии он был уточнён до 41 × 41 × 72,5 нм³. Таким образом, vault являются самыми крупными из когда-либо описанных цитозольных неикосаэдрических нуклеопротеинов. Далее структура vault изучалась с помощью рентегноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса. В 2009 году структура vault из печени крысы была определена с разрешением 3,5 Å.

Структура vault

Внешние изображения
	[pp.vk.me/c625529/v625529085/c731/2lpIFdiR-Y8.jpg Vault. Электронная микрофотография]

Vault — самые крупные рибонуклеопротеиновые частицы. По размерам они примерно в 3 раза превосходят рибосому и весят около 13 МДа. Vault состоят по большей части из белков, в связи с чем их трудно окрашивать стандартными методами. Белковая составляющая vault представлена множеством молекул главного белка vault (MVP) (95,8 кДа), на долю которого приходится более 70 % всего белка в частице, а также белками VPARP (∼192 кДа) и TEP1 (∼291 кДа). Кроме того, в состав vault входят vault РНК (vРНК) длиной 86—141 нуклеотидов. Общая масса РНК в vault оценивается в ∼460 кДа.

Частица vault достигает около 670 Å в длину и имеет наибольший диаметр ∼400 Å. Стенка имеет толщину лишь в 15–25 Å; внутри неё находится полость длиной около 620 Å и максимальным диаметром ∼350 Å. Частица состоит из двух симметричных половин, каждая из которых состоит из трёх частей: тела, плечевого участка и шапочки. Тело содержит 78 копий 9 повторяющихся структурных доменов MVP (39 копий в каждой половине), сужающаяся часть сформирована связанными конец к концу структурными повторяющимися доменами R1. Высота плечевого участка составляет ∼25 Å, а диаметр ∼315 Å. Шапочки имеются на обоих концах частицы, и каждая из них содержит 39 копий домена шапочка-спираль (аминокислотные остатки MVP с Asp647 пр Leu802) и домена шапочка-кольцо (с Gly803 по Ala845). Высота шапочки составляет ∼155 Å, а внутренний и внешний диаметры домена шапочка-кольцо достигают ∼50 Å и ∼130 Å соответственно.

MVP содержит 9 повторяющихся структурных доменов (R1—R9). Домены R8 и R9 состоят из пяти антипараллельных β-листов, обозначаемых S1, S2, S3, S4 и S5. В оставшихся семи доменах имеется два дополнительных β-листа (S2a и S2b), вставленных между S2 и S3. По некоторым данным, R1, как и R8 и R9, состоит из пяти антипараллельных β-листа, в то время как у R2 имеется два более длинных антипараллельных листа между S2 и S3. Каждый домен имеет гидрофобный кор. Анализ аминокислотных последовательностей показал, что в R3 и R4, возможно, имеются два домена типа EF hand. Дальнейшее изучение показало, что MVP взаимодействует с другими белками, такими как PTEN, через предполагаемые два домена EF hand при участии ионов Ca²⁺, впрочем, с этим согласуются не все экспериментальные данные.

Плечевой участок (с Pro520 по Val646) сворачивается в один α/β-глобулярный домен с 4 антипараллельными бета-листами на одной стороне и четырьмя α-спиралями на другой. По-видимому, именно в плечевом участке находятся элементы, отвечающие за взаимодействие vault с липидными рафтами.

Домен шапочка-спираль сворачивается в α-спираль из 42 витков, которая укладывается в суперспираль. Домен шапочка-кольцо расположен на конце шапочки и формирует U-образную структуру со спиральными элементами на обоих концах.

vРНК располагаются в шапочках на концах частиц vault. Белок TEP1, по-видимому, располагается в верху плоской части шапочки, где его участок WD40 repeat формирует структуру типа кольцевой β-пропеллер. N-концевая часть TEP1 содержит 4 повторяющихся домена неясного функционального назначения, РНК-связывающий домен и ATP/GTP-связывающий домен. Было показано, что TEP1 взаимодействует с теломеразной РНК и различными человеческими vРНК. VPARP располагаются в основном в шапочке vault.

В следующей таблице обобщены основные сведения о компонентах vault.

Компонент	Характеристика	Локус	Положение и взаимодействия в vault	Функции
MVP	96 копий белка составляют основную массу vault. Способны самособираться в vault. Не имеют функций вне vault	16p11.2	Тело и шапочка vault, нет необходимых партнёров	Структурная; управляют связыванием с сигнальными белками
VPARP	Слабая поли(ADP-рибоза)-полимераза, лишь частично связана с vault	13q11	Шапочка, непосредственно связываются с N-концевой частью MVP	Каталитическая: поли(ADP)-рибозилирование MVP
TEP1	Связывается с теломеразой и vault; не необходим для теломеразы	14q11.2	Шапочка, непосредственное связывание с MVP	Каталитическая: сборка vРНК-мишеней в vault
vРНК	hgv1—3, hgv4 не экспрессируется; лишь частично связаны с vault	5q33.11 Xp11.22	Шапочка, связываются с TEP1	Неструктурная, функции плохо изучены

Функции

Широкое распространение vault и их эволюционная консервативность говорят в пользу наличия у этих органелл важных биологических функций, хотя о них известно очень мало. Ничего не известно об изначальных функциях vault в клетках протистов. Тем не менее, имеется несколько предположений относительно роли vault в клетках млекопитающих. В частности, отмечено, что vault особенно много в тканях и клетках, связанных с очисткой организма, например, макрофагах.

Была высказана гипотеза, что vault служат главными «пробками» в ядерных поровых комплексах. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител против vault показал, что в изолированных ядрах клеток печени крысы vault располагались на поверхности ядерной мембраны. Иммуноэлектронная микроскопия с использованием вторичных антител, конъюгированных с золотом, показала, что в изолированных ядрах vault ассоциированы с ядерными поровыми комплексами. Поэтому, возможно, vault могут принимать участие в нуклеоцитоплазматическом транспорте.

В 2005 году было высказано предположение, что человеческие vРНК hvg1 и hvg2 могут связываться с противораковым препаратом митоксантроном, а также играть важную роль в экспорте токсичных соединений. Впрочем, другое исследование показало, что нарушение работы гена MVP у мышей не приводило к повышению чувствительности к цитостатическим препаратам. Более того, мыши дикого типа и мыши, дефектные по MVP, демонстрировали одинаковый ответ на доксорубицин. В ходе ещё одного исследования было показано, что нокдаун MVP при помощи малых интерферирующих РНК не влиял на удаление доксорубицина из ядра. Кроме того, повышение экспрессии MVP у хемочувствительных клеток не повышало устойчивости к препаратам. Эти результаты говорят в пользу того, что MVP и vault не вносят непосредственный вклад в устойчивость к цитостатическим агентам.

Ряд недавних исследований показал участие vault в различных сигнальных путях клетки, и количество таких путей постоянно растёт. На дрожжевой двугибридной системе было показано, что MVP может связываться с PTEN — белком-супрессором опухолей, который дефосфорилирует фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат, отрицательно регулируя сигнальный путь фосфоинозитид-3-киназы/протеинкиназы В. N-концевой фосфоинозитид-связывающий мотив и домен С2 PTEN могут взаимодействовать с MVP. MVP является субстратом для тирозинфосфатазы SHP-2, содержащей домен SH2 (Src homology 2), и служит белком скэффолда в сигнальном пути эпидермального фактора роста (EGF). Оказалось, что SH2-домены SHP-2 связывались с MVP, фосфорилированным по остаткам тирозина, и это связывание усиливалось под действием EGF. Таким образом, MVP функционирует как белок скэффолда для SHP-2 и киназ, регулируемых внеклеточно, и регуляция фосфорилирования MVP через SHP-2 может иметь важное значение для выживания клетки. Кроме того, было показано взаимодействие между MVP и доменом SH2 Src в клетках желудка человека и клетках рака желудка 253J. Иммунопреципитация и иммунофлуоресцентный анализ показали, что EGF усиливал взаимодействие между MVP и Src, и оно блокировалось под действием ингибитора Src PP2. EGF также стимулирует перемещение MVP из ядра в цитозоль и околоядерную зону цитоплазмы, где MVP колокализуется с Src. Предполагается роль MVP как нового регулятора Src-опосредованных сигнальных каскадов. Было установлено, что MVP является белком, индуцируемым интерфероном γ (IFN-γ): в ответ на IFN-γ наблюдалось значительное повышение уровня мРНК и самого белка MVP. Эта активация вовлечена во взаимодействие STAT1 и сайта, активируемого IFN-γ, в проксимальном промоторе MVP. Кроме того, IFN-γ значительно повышал темпы трансляции MVP. Показано, что vault могут взаимодействовать с эстрогеновыми рецепторами при связывании с эстрадиолом и вместе с рецепторами переносятся в ядро. Согласно последним данным, vault и MVP могут взаимодействовать с инсулиноподобным фактором роста 1, HIF1A, а также затрагивать два главных процесса репарации двуцепочечных разрывов в ДНК: негомологичное соединение концов и гомологичную рекомбинацию. Таким образом, частицы vault функционируют как центральные платформы взаимодействия в клеточных сигнальных каскадах.

VRARP, другой белок, входящий в состав vault, является поли(ADP-рибоза)-полимеразой.

Необычная структура и своеобразная динамика vault, а также их крупный размер наводят на мысль, что, возможно, vault функционируют как природные наноконтейнеры для ксенобиотиков, нуклеиновых кислот и белков. Ведутся работы по разработке рекомбинантных vault, в частности, по обеспечению взаимодействия vault с поверхностными клеточными рецепторами и заключению в них разнообразных грузов.

В следующей таблице обобщены основные сведения о белках, с которыми взаимодействуют vault.

Белок	Характеристика	Локус	Взаимодействие с vault	Функции, связанные с vault
PTEN	Белок-супрессор опухолей, главная ингибиторная фосфатаза пути PI3K. Главный субстрат PIP3	10q23.3	MVP (N-конец), Ca2+-зависимое взаимодействие	Усиление ядерных функций PTEN
SHP-2	Протеинтирозинфосфатаза; активатор роста, опосредованного рецепторными тирозинкиназами (RTK)	3q13.13	MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие)	Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
Erk2	Митоген-активируемая тирозинкиназа; главный передатчик RTK-опосредованных сигналов пролиферации	22q11.22	MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие)	Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
Src	(Прото)онкоген, тирозинкиназа	20q11.2	MVP (зависимое от фосфорилирования MVP взаимодействие)	Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
COP1	E3 убиквитинлигаза, у позвоночных разрушает c-Jun и p53	1q25.1—1q25.2	MVP (фосфорилирование MVP, уменьшающееся от УФ-излучения)	Подавляет EGF-опосредованную активацию MAPK
Эстрогеновый рецептор	Ядерный рецептор гормона эстрадиола, индуцирует лиганд-зависимую транскрипцию генов-мишеней	6q25.1	MVP (гормонзависимое взаимодействие)	Ядерный импорт и активация эстрогенового рецептора
La РНК-связывающий белок	Связывает и защищает 3'-концевые элементы UUU(OH) транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой III	2q31.1	vРНК	Защита vРНК

Клиническое значение

Рак

В 1990-х годах появились сообщения о том, что vault могут быть непосредственно вовлечены в развитие множественной лекарственной устойчивости в раковых клетках. Оказалось, что белок, связанный с множественной устойчивостью и известный под названием LRP (англ. Lung Resistance-related Protein — белок, связанный с множественной устойчивостью в лёгких) на самом деле является человеческим MVP. В ходе другого исследования связь между vault и множественной лекарственной устойчивостью была показана на клетках человеческого рака толстой кишки SW-620. Обработка SW-620 бутиратом натрия увеличивала экспрессию MVP и приводила к устойчивости к доксорубицину, винкристину, грамицидину D и паклитакселу. Трансфекция клеток рибозимами, специфичными к MVP, подавляла эти активности.

Свой вклад в развитие множественной лекарственной устойчивости могут вносить и vРНК. В 2009 году было установлено, что некодирующие vРНК могут процессироваться в малые vРНК (svРНК) при участии Dicer, которые далее функционируют путём РНК-интерференции подобно микроРНК: svРНК связываются с белком семейства Argonaute и отрицательно регулируют экспрессию CYP3A4 — фермента, участвующего в метаболизме ксенобиотиков.

В последние годы накапливаются свидетельства того, что vault связаны с функционированием систем репарации ДНК в клетке, поэтому, возможно, они вносят свой вклад в нечувствительность к не только химиотерапии, но и радиотерапии рака.

Инфекционные заболевания

В 2007 году две исследовательские группы сообщили об участии vault в ответе на инфекции. Оказалось, что в человеческих B-клетках, заражённых вирусом Эпштейна — Барр, наблюдались повышенные уровни vРНК, которые, возможно, участвуют в защите от вируса и/или транспортных механизмах. Кроме того, было показано, что при заражении эпителиальных клеток лёгких человека бактерией Pseudomonas aeruginosa MVP быстро рекрутировался в липидные рафты, где участвует в механизмах усиления врождённого иммунного ответа. Мыши MVP^−/− имели в 3,5 раза больше бактерий на грамм лёгочной ткани, чем мыши дикого типа, и чаще умирали от инфекции, вызванной P. aeruginosa.

Эволюционная консервативность

Vault были описаны у млекопитающих, земноводных, птиц, а также слизевика Dictyostelium discoideum. Согласно информации из базы данных Pfam, гомологи белков, входящих в состав vault, выявлены у инфузории Paramecium tetraurelia, кинетопластид, многих позвоночных, актинии Nematostella vectensis, моллюсков, Trichoplax adhaerens, плоских червей (в частности, Echinococcus granulosus) и хоанофлагеллят.

У ряда эукариотических организмов не было обнаружено гомологов белков vault. Среди них такие модельные организмы, как растение Arabidopsis thaliana, нематода Caenorhabditis elegans, плодовая мушка Drosophila melanogaster и пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Однако, несмотря на эти исключения, высокая степень сходства vault у различных организмов говорит о том, что эти органеллы имеют некоторое эволюционное значение. Согласно последним данным, последний общий предок эукариот имел vault, однако впоследствии они были утрачены у ряда групп, в том числе грибов, насекомых и, возможно, растений.

Литература

• Rome L. H., Kickhoefer V. A. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23267674 Development of the vault particle as a platform technology.] (англ.) // ACS nano. — 2013. — Vol. 7, no. 2. — P. 889—902. — DOI:10.1021/nn3052082. — PMID 23267674.
• Reis E. V., Pereira R. V., Gomes M., Jannotti-Passos L. K., Baba E. H., Coelho P. M., Mattos A. C., Couto F. F., Castro-Borges W., Guerra-Sá R. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24148287 Characterisation of major vault protein during the life cycle of the human parasite Schistosoma mansoni.] (англ.) // Parasitology international. — 2014. — Vol. 63, no. 1. — P. 120—126. — DOI:10.1016/j.parint.2013.10.005. — PMID 24148287.
• Casañas A., Querol-Audí J., Guerra P., Pous J., Tanaka H., Tsukihara T., Verdaguer N., Fita I. [www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23695250 New features of vault architecture and dynamics revealed by novel refinement using the deformable elastic network approach.] (англ.) // Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. — 2013. — Vol. 69, no. Pt 6. — P. 1054—1061. — DOI:10.1107/S0907444913004472. — PMID 23695250.

Ссылки

• [www.vaults.arc.ucla.edu/ Vault website (UCLA)].
• MeSH Vault+Ribonucleoprotein+Particles

Отрывок, характеризующий Vault (органелла)

– И то, и то, – сказал Несвицкий. – Нет, а чего бы я желал, – прибавил он, прожевывая пирожок в своем красивом влажном рте, – так это вон туда забраться.
Он указывал на монастырь с башнями, видневшийся на горе. Он улыбнулся, глаза его сузились и засветились.
– А ведь хорошо бы, господа!
Офицеры засмеялись.
– Хоть бы попугать этих монашенок. Итальянки, говорят, есть молоденькие. Право, пять лет жизни отдал бы!
– Им ведь и скучно, – смеясь, сказал офицер, который был посмелее.
Между тем свитский офицер, стоявший впереди, указывал что то генералу; генерал смотрел в зрительную трубку.
– Ну, так и есть, так и есть, – сердито сказал генерал, опуская трубку от глаз и пожимая плечами, – так и есть, станут бить по переправе. И что они там мешкают?
На той стороне простым глазом виден был неприятель и его батарея, из которой показался молочно белый дымок. Вслед за дымком раздался дальний выстрел, и видно было, как наши войска заспешили на переправе.
Несвицкий, отдуваясь, поднялся и, улыбаясь, подошел к генералу.
– Не угодно ли закусить вашему превосходительству? – сказал он.
– Нехорошо дело, – сказал генерал, не отвечая ему, – замешкались наши.
– Не съездить ли, ваше превосходительство? – сказал Несвицкий.
– Да, съездите, пожалуйста, – сказал генерал, повторяя то, что уже раз подробно было приказано, – и скажите гусарам, чтобы они последние перешли и зажгли мост, как я приказывал, да чтобы горючие материалы на мосту еще осмотреть.
– Очень хорошо, – отвечал Несвицкий.
Он кликнул казака с лошадью, велел убрать сумочку и фляжку и легко перекинул свое тяжелое тело на седло.
– Право, заеду к монашенкам, – сказал он офицерам, с улыбкою глядевшим на него, и поехал по вьющейся тропинке под гору.
– Нут ка, куда донесет, капитан, хватите ка! – сказал генерал, обращаясь к артиллеристу. – Позабавьтесь от скуки.
– Прислуга к орудиям! – скомандовал офицер.
И через минуту весело выбежали от костров артиллеристы и зарядили.
– Первое! – послышалась команда.
Бойко отскочил 1 й номер. Металлически, оглушая, зазвенело орудие, и через головы всех наших под горой, свистя, пролетела граната и, далеко не долетев до неприятеля, дымком показала место своего падения и лопнула.
Лица солдат и офицеров повеселели при этом звуке; все поднялись и занялись наблюдениями над видными, как на ладони, движениями внизу наших войск и впереди – движениями приближавшегося неприятеля. Солнце в ту же минуту совсем вышло из за туч, и этот красивый звук одинокого выстрела и блеск яркого солнца слились в одно бодрое и веселое впечатление.


Над мостом уже пролетели два неприятельские ядра, и на мосту была давка. В средине моста, слезши с лошади, прижатый своим толстым телом к перилам, стоял князь Несвицкий.
Он, смеючись, оглядывался назад на своего казака, который с двумя лошадьми в поводу стоял несколько шагов позади его.
Только что князь Несвицкий хотел двинуться вперед, как опять солдаты и повозки напирали на него и опять прижимали его к перилам, и ему ничего не оставалось, как улыбаться.
– Экой ты, братец, мой! – говорил казак фурштатскому солдату с повозкой, напиравшему на толпившуюся v самых колес и лошадей пехоту, – экой ты! Нет, чтобы подождать: видишь, генералу проехать.
Но фурштат, не обращая внимания на наименование генерала, кричал на солдат, запружавших ему дорогу: – Эй! землячки! держись влево, постой! – Но землячки, теснясь плечо с плечом, цепляясь штыками и не прерываясь, двигались по мосту одною сплошною массой. Поглядев за перила вниз, князь Несвицкий видел быстрые, шумные, невысокие волны Энса, которые, сливаясь, рябея и загибаясь около свай моста, перегоняли одна другую. Поглядев на мост, он видел столь же однообразные живые волны солдат, кутасы, кивера с чехлами, ранцы, штыки, длинные ружья и из под киверов лица с широкими скулами, ввалившимися щеками и беззаботно усталыми выражениями и движущиеся ноги по натасканной на доски моста липкой грязи. Иногда между однообразными волнами солдат, как взбрызг белой пены в волнах Энса, протискивался между солдатами офицер в плаще, с своею отличною от солдат физиономией; иногда, как щепка, вьющаяся по реке, уносился по мосту волнами пехоты пеший гусар, денщик или житель; иногда, как бревно, плывущее по реке, окруженная со всех сторон, проплывала по мосту ротная или офицерская, наложенная доверху и прикрытая кожами, повозка.
– Вишь, их, как плотину, прорвало, – безнадежно останавливаясь, говорил казак. – Много ль вас еще там?
– Мелион без одного! – подмигивая говорил близко проходивший в прорванной шинели веселый солдат и скрывался; за ним проходил другой, старый солдат.
– Как он (он – неприятель) таперича по мосту примется зажаривать, – говорил мрачно старый солдат, обращаясь к товарищу, – забудешь чесаться.
И солдат проходил. За ним другой солдат ехал на повозке.
– Куда, чорт, подвертки запихал? – говорил денщик, бегом следуя за повозкой и шаря в задке.
И этот проходил с повозкой. За этим шли веселые и, видимо, выпившие солдаты.
– Как он его, милый человек, полыхнет прикладом то в самые зубы… – радостно говорил один солдат в высоко подоткнутой шинели, широко размахивая рукой.
– То то оно, сладкая ветчина то. – отвечал другой с хохотом.
И они прошли, так что Несвицкий не узнал, кого ударили в зубы и к чему относилась ветчина.
– Эк торопятся, что он холодную пустил, так и думаешь, всех перебьют. – говорил унтер офицер сердито и укоризненно.
– Как оно пролетит мимо меня, дяденька, ядро то, – говорил, едва удерживаясь от смеха, с огромным ртом молодой солдат, – я так и обмер. Право, ей Богу, так испужался, беда! – говорил этот солдат, как будто хвастаясь тем, что он испугался. И этот проходил. За ним следовала повозка, непохожая на все проезжавшие до сих пор. Это был немецкий форшпан на паре, нагруженный, казалось, целым домом; за форшпаном, который вез немец, привязана была красивая, пестрая, с огромным вымем, корова. На перинах сидела женщина с грудным ребенком, старуха и молодая, багроворумяная, здоровая девушка немка. Видно, по особому разрешению были пропущены эти выселявшиеся жители. Глаза всех солдат обратились на женщин, и, пока проезжала повозка, двигаясь шаг за шагом, и, все замечания солдат относились только к двум женщинам. На всех лицах была почти одна и та же улыбка непристойных мыслей об этой женщине.
– Ишь, колбаса то, тоже убирается!
– Продай матушку, – ударяя на последнем слоге, говорил другой солдат, обращаясь к немцу, который, опустив глаза, сердито и испуганно шел широким шагом.
– Эк убралась как! То то черти!
– Вот бы тебе к ним стоять, Федотов.
– Видали, брат!
– Куда вы? – спрашивал пехотный офицер, евший яблоко, тоже полуулыбаясь и глядя на красивую девушку.
Немец, закрыв глаза, показывал, что не понимает.
– Хочешь, возьми себе, – говорил офицер, подавая девушке яблоко. Девушка улыбнулась и взяла. Несвицкий, как и все, бывшие на мосту, не спускал глаз с женщин, пока они не проехали. Когда они проехали, опять шли такие же солдаты, с такими же разговорами, и, наконец, все остановились. Как это часто бывает, на выезде моста замялись лошади в ротной повозке, и вся толпа должна была ждать.
– И что становятся? Порядку то нет! – говорили солдаты. – Куда прешь? Чорт! Нет того, чтобы подождать. Хуже того будет, как он мост подожжет. Вишь, и офицера то приперли, – говорили с разных сторон остановившиеся толпы, оглядывая друг друга, и всё жались вперед к выходу.
Оглянувшись под мост на воды Энса, Несвицкий вдруг услышал еще новый для него звук, быстро приближающегося… чего то большого и чего то шлепнувшегося в воду.
– Ишь ты, куда фатает! – строго сказал близко стоявший солдат, оглядываясь на звук.
– Подбадривает, чтобы скорей проходили, – сказал другой неспокойно.
Толпа опять тронулась. Несвицкий понял, что это было ядро.
– Эй, казак, подавай лошадь! – сказал он. – Ну, вы! сторонись! посторонись! дорогу!
Он с большим усилием добрался до лошади. Не переставая кричать, он тронулся вперед. Солдаты пожались, чтобы дать ему дорогу, но снова опять нажали на него так, что отдавили ему ногу, и ближайшие не были виноваты, потому что их давили еще сильнее.
– Несвицкий! Несвицкий! Ты, г'ожа! – послышался в это время сзади хриплый голос.
Несвицкий оглянулся и увидал в пятнадцати шагах отделенного от него живою массой двигающейся пехоты красного, черного, лохматого, в фуражке на затылке и в молодецки накинутом на плече ментике Ваську Денисова.
– Вели ты им, чег'тям, дьяволам, дать дог'огу, – кричал. Денисов, видимо находясь в припадке горячности, блестя и поводя своими черными, как уголь, глазами в воспаленных белках и махая невынутою из ножен саблей, которую он держал такою же красною, как и лицо, голою маленькою рукой.
– Э! Вася! – отвечал радостно Несвицкий. – Да ты что?
– Эскадг'ону пг'ойти нельзя, – кричал Васька Денисов, злобно открывая белые зубы, шпоря своего красивого вороного, кровного Бедуина, который, мигая ушами от штыков, на которые он натыкался, фыркая, брызгая вокруг себя пеной с мундштука, звеня, бил копытами по доскам моста и, казалось, готов был перепрыгнуть через перила моста, ежели бы ему позволил седок. – Что это? как баг'аны! точь в точь баг'аны! Пг'очь… дай дог'огу!… Стой там! ты повозка, чог'т! Саблей изг'ублю! – кричал он, действительно вынимая наголо саблю и начиная махать ею.
Солдаты с испуганными лицами нажались друг на друга, и Денисов присоединился к Несвицкому.
– Что же ты не пьян нынче? – сказал Несвицкий Денисову, когда он подъехал к нему.
– И напиться то вг'емени не дадут! – отвечал Васька Денисов. – Целый день то туда, то сюда таскают полк. Дг'аться – так дг'аться. А то чог'т знает что такое!
– Каким ты щеголем нынче! – оглядывая его новый ментик и вальтрап, сказал Несвицкий.
Денисов улыбнулся, достал из ташки платок, распространявший запах духов, и сунул в нос Несвицкому.
– Нельзя, в дело иду! выбг'ился, зубы вычистил и надушился.
Осанистая фигура Несвицкого, сопровождаемая казаком, и решительность Денисова, махавшего саблей и отчаянно кричавшего, подействовали так, что они протискались на ту сторону моста и остановили пехоту. Несвицкий нашел у выезда полковника, которому ему надо было передать приказание, и, исполнив свое поручение, поехал назад.
Расчистив дорогу, Денисов остановился у входа на мост. Небрежно сдерживая рвавшегося к своим и бившего ногой жеребца, он смотрел на двигавшийся ему навстречу эскадрон.
По доскам моста раздались прозрачные звуки копыт, как будто скакало несколько лошадей, и эскадрон, с офицерами впереди по четыре человека в ряд, растянулся по мосту и стал выходить на ту сторону.
Остановленные пехотные солдаты, толпясь в растоптанной у моста грязи, с тем особенным недоброжелательным чувством отчужденности и насмешки, с каким встречаются обыкновенно различные роды войск, смотрели на чистых, щеголеватых гусар, стройно проходивших мимо их.
– Нарядные ребята! Только бы на Подновинское!
– Что от них проку! Только напоказ и водят! – говорил другой.
– Пехота, не пыли! – шутил гусар, под которым лошадь, заиграв, брызнула грязью в пехотинца.
– Прогонял бы тебя с ранцем перехода два, шнурки то бы повытерлись, – обтирая рукавом грязь с лица, говорил пехотинец; – а то не человек, а птица сидит!
– То то бы тебя, Зикин, на коня посадить, ловок бы ты был, – шутил ефрейтор над худым, скрюченным от тяжести ранца солдатиком.
– Дубинку промеж ног возьми, вот тебе и конь буде, – отозвался гусар.


Остальная пехота поспешно проходила по мосту, спираясь воронкой у входа. Наконец повозки все прошли, давка стала меньше, и последний батальон вступил на мост. Одни гусары эскадрона Денисова оставались по ту сторону моста против неприятеля. Неприятель, вдалеке видный с противоположной горы, снизу, от моста, не был еще виден, так как из лощины, по которой текла река, горизонт оканчивался противоположным возвышением не дальше полуверсты. Впереди была пустыня, по которой кое где шевелились кучки наших разъездных казаков. Вдруг на противоположном возвышении дороги показались войска в синих капотах и артиллерия. Это были французы. Разъезд казаков рысью отошел под гору. Все офицеры и люди эскадрона Денисова, хотя и старались говорить о постороннем и смотреть по сторонам, не переставали думать только о том, что было там, на горе, и беспрестанно всё вглядывались в выходившие на горизонт пятна, которые они признавали за неприятельские войска. Погода после полудня опять прояснилась, солнце ярко спускалось над Дунаем и окружающими его темными горами. Было тихо, и с той горы изредка долетали звуки рожков и криков неприятеля. Между эскадроном и неприятелями уже никого не было, кроме мелких разъездов. Пустое пространство, саженей в триста, отделяло их от него. Неприятель перестал стрелять, и тем яснее чувствовалась та строгая, грозная, неприступная и неуловимая черта, которая разделяет два неприятельские войска.
«Один шаг за эту черту, напоминающую черту, отделяющую живых от мертвых, и – неизвестность страдания и смерть. И что там? кто там? там, за этим полем, и деревом, и крышей, освещенной солнцем? Никто не знает, и хочется знать; и страшно перейти эту черту, и хочется перейти ее; и знаешь, что рано или поздно придется перейти ее и узнать, что там, по той стороне черты, как и неизбежно узнать, что там, по ту сторону смерти. А сам силен, здоров, весел и раздражен и окружен такими здоровыми и раздраженно оживленными людьми». Так ежели и не думает, то чувствует всякий человек, находящийся в виду неприятеля, и чувство это придает особенный блеск и радостную резкость впечатлений всему происходящему в эти минуты.
На бугре у неприятеля показался дымок выстрела, и ядро, свистя, пролетело над головами гусарского эскадрона. Офицеры, стоявшие вместе, разъехались по местам. Гусары старательно стали выравнивать лошадей. В эскадроне всё замолкло. Все поглядывали вперед на неприятеля и на эскадронного командира, ожидая команды. Пролетело другое, третье ядро. Очевидно, что стреляли по гусарам; но ядро, равномерно быстро свистя, пролетало над головами гусар и ударялось где то сзади. Гусары не оглядывались, но при каждом звуке пролетающего ядра, будто по команде, весь эскадрон с своими однообразно разнообразными лицами, сдерживая дыханье, пока летело ядро, приподнимался на стременах и снова опускался. Солдаты, не поворачивая головы, косились друг на друга, с любопытством высматривая впечатление товарища. На каждом лице, от Денисова до горниста, показалась около губ и подбородка одна общая черта борьбы, раздраженности и волнения. Вахмистр хмурился, оглядывая солдат, как будто угрожая наказанием. Юнкер Миронов нагибался при каждом пролете ядра. Ростов, стоя на левом фланге на своем тронутом ногами, но видном Грачике, имел счастливый вид ученика, вызванного перед большою публикой к экзамену, в котором он уверен, что отличится. Он ясно и светло оглядывался на всех, как бы прося обратить внимание на то, как он спокойно стоит под ядрами. Но и в его лице та же черта чего то нового и строгого, против его воли, показывалась около рта.
– Кто там кланяется? Юнкег' Миг'онов! Hexoг'oшo, на меня смотг'ите! – закричал Денисов, которому не стоялось на месте и который вертелся на лошади перед эскадроном.
Курносое и черноволосатое лицо Васьки Денисова и вся его маленькая сбитая фигурка с его жилистою (с короткими пальцами, покрытыми волосами) кистью руки, в которой он держал ефес вынутой наголо сабли, было точно такое же, как и всегда, особенно к вечеру, после выпитых двух бутылок. Он был только более обыкновенного красен и, задрав свою мохнатую голову кверху, как птицы, когда они пьют, безжалостно вдавив своими маленькими ногами шпоры в бока доброго Бедуина, он, будто падая назад, поскакал к другому флангу эскадрона и хриплым голосом закричал, чтоб осмотрели пистолеты. Он подъехал к Кирстену. Штаб ротмистр, на широкой и степенной кобыле, шагом ехал навстречу Денисову. Штаб ротмистр, с своими длинными усами, был серьезен, как и всегда, только глаза его блестели больше обыкновенного.
– Да что? – сказал он Денисову, – не дойдет дело до драки. Вот увидишь, назад уйдем.
– Чог'т их знает, что делают – проворчал Денисов. – А! Г'остов! – крикнул он юнкеру, заметив его веселое лицо. – Ну, дождался.
И он улыбнулся одобрительно, видимо радуясь на юнкера.
Ростов почувствовал себя совершенно счастливым. В это время начальник показался на мосту. Денисов поскакал к нему.
– Ваше пг'евосходительство! позвольте атаковать! я их опг'окину.
– Какие тут атаки, – сказал начальник скучливым голосом, морщась, как от докучливой мухи. – И зачем вы тут стоите? Видите, фланкеры отступают. Ведите назад эскадрон.
Эскадрон перешел мост и вышел из под выстрелов, не потеряв ни одного человека. Вслед за ним перешел и второй эскадрон, бывший в цепи, и последние казаки очистили ту сторону.
Два эскадрона павлоградцев, перейдя мост, один за другим, пошли назад на гору. Полковой командир Карл Богданович Шуберт подъехал к эскадрону Денисова и ехал шагом недалеко от Ростова, не обращая на него никакого внимания, несмотря на то, что после бывшего столкновения за Телянина, они виделись теперь в первый раз. Ростов, чувствуя себя во фронте во власти человека, перед которым он теперь считал себя виноватым, не спускал глаз с атлетической спины, белокурого затылка и красной шеи полкового командира. Ростову то казалось, что Богданыч только притворяется невнимательным, и что вся цель его теперь состоит в том, чтоб испытать храбрость юнкера, и он выпрямлялся и весело оглядывался; то ему казалось, что Богданыч нарочно едет близко, чтобы показать Ростову свою храбрость. То ему думалось, что враг его теперь нарочно пошлет эскадрон в отчаянную атаку, чтобы наказать его, Ростова. То думалось, что после атаки он подойдет к нему и великодушно протянет ему, раненому, руку примирения.