Анализ метаболических потоков

Анализ баланса потоков (АМП) (англ. flux balance analysis, FBA), — метод математического моделирования метаболизма, позволяющий  определить скорость реакций в метаболической сети (одном пути или наборе путей). Метод применяется в моделировании разных воздействий на клетку или оптимизации условий её роста. Ключевыми особенностями метода являются использование стационарного приближения (допущения, при котором концентрация каждого вещества считается постоянной) и малая потребность в вычислительной мощности.  

Описание метода

Метаболические реакции представляются в виде стехиометрической матрицы (S) размера n на m. Каждая строчка этой матрицы описывает одно вещество (для системы с m веществами) и каждая колонка представляет одну реакцию (n реакций). Значения в каждой колонке соответствуют стехиометрический коэффициентам метаболитов, участвующих в реакции. Отрицательные коэффициенты присваиваются каждому потреблённому метаболиту и положительные каждому продуцированному, соответственно. Стехиометрический коэффициент ноль соответствует метаболитам, не принимающим участие в данной конкретной реакции. Так как в большинстве биохимических реакций принимает участие всего несколько различных метаболитов, матрица S содержит много нулевых элементов. Поток через все реакции сети представляется вектором <math>v</math> , который имеет длину n. Концентрации всех метаболитов представляются вектором x, с длиной m. Система уравнений материального баланса в стационарном состоянии (dx/dt = 0) в таком случае выражается формулой:

<math> \qquad S \cdot\mathbf{v} = \mathbf{0} </math>

Говорят, что любое <math>v</math>, удовлетворяющее уравнению <math> \qquad S \cdot\mathbf{v} = \mathbf{0} </math> обращает в ноль размерность пространства <math>S</math>. Но в любой реалистичной метаболической модели количество реакций всегда больше, чем количество метаболитов (n > m). Другими словами, количество неизвестных больше, чем количество уравнений, следовательно,  не существует однозначного решения такой системы, причем многие решения могут быт совершенно неподходящими с биологической точки зрения.  Однако пространство решений можно ограничить, и искать решение, отвечающее некоторому критерию. Этот критерий задается так называемой целевой функцией, которая отражает некоторый параметр системы, и ищут решение, при котором эта функция имеет, например, максимальное значение. Кроме того, пространство решений сильно ограничивается наложением ограничений на каждый поток. Таким образом, например, можно рассчитать какая точка в пространстве решений соответствует максимальной скорости роста или максимальному выходу АТФ в определённом организме исходя из наложенных ограничений. (Рис. 1) Цель АМП — стремиться минимизировать или максимизировать целевую функцию Z = c^Tv, которая может собой представлять, вообще говоря, любую комбинацию потоков, где c — это вектор весов, указывающий, какой вклад вносит каждая реакция системы в целевую функцию (производство изучаемого продукта, например, биомассы). На практике, когда нужно максимизировать или минимизировать только одну реакцию, c — это вектор, состоящий из нулей и единицы для интересующей нас реакции.

Оптимизация такой системы достигается путём линейного программирования (1е). Таким образом, АМП может быть определён, как использование метода линейного программирования для решения уравнения <math> \qquad S \cdot\mathbf{v} = \mathbf{0} </math> при заданном наборе верхних и нижних оценок <math>v</math> и линейной комбинации потоков в качестве целевой функции. Результат АМП представляет собой набор скоростей v, которое соответствует максимуму или минимуму целевой функции.

Построение модели

Ключевыми стадиями создания модели являются: создание полной метаболической сети, наложение ограничений на модель и определения целевой функции.

Метаболическая сеть

Метаболические сети могут рассматривать как один метаболический путь, так и целую клетку, ткань или организм. Главное требование к метаболической сети для АМП — отсутствие пропусков. Создание полной метаболической сети — очень масштабная работа, занимающая месяцы и года. На сегодняшний момент существуют полные метаболические сети для некоторых модельных организмов, в частности, для E. Coli.

Ограничения

Ключевой частью АМП является наложение ограничений на скорость потоков в метаболической сети, чтобы их значения лежали в определённом диапазоне. Это позволяет точнее воспроизвести реальную метаболическую систему. Эти ограничения делятся на две основных категории: связанные с потреблением или выделением веществ клеткой и ограничение на потоки внутри самой клетки. Математически применение ограничений позволяет сократить пространство решений для модели АМП.

Эти ограничения могут определяться как из теоретических соображений, так и из результатов измерений.

Наиболее очевидные теоретические ограничения — термодинамические. Они определяют направление реакции. Если разность свободной энергии продуктов и реагентов реакции меньше нуля, реакция идет в прямом направлении, и наоборот.

Скорости некоторых потоков могут быть измерены экспериментально, и поток в модели может быть ограничен в определённом диапазоне значений около измеренного:

<math>v_{i,m} - \varepsilon < v_i <v_{i,m}+ \varepsilon</math>

Проще всего измерять скорости поглощения и секреции веществ. Обычно скорость поглощения вещества из внешней среды определяется его доступностью, концентрацией, скоростью диффузии (чем она больше, тем быстрее поглощение) и методом поглощения (активный транспорт, облегчённая диффузия или просто диффузия).

Внутренние потоки можно измерять с помощью радиоактивного мечения веществ, ЯМР и некоторых других методов.

Целевая функция

Система АМП не имеет однозначного решения, однако с помощью наложения ограничений можно сократить их количество. В дальнейшем выбирается то решение, которое максимизирует или минимизирует целевую функцию. Целевая функция — это некоторая линейная комбинация потоков, выражающая определённый параметр системы.

Этим параметром обычно является выход биомассы или скорость пролиферации в случае клеток или, например, выход АТФ, если рассматривается гликолиз или другой энергетический путь.

Таким образом, задача FBA представляется в следующим виде:

<math> \max_{ \vec v}\ v_b \qquad \textrm{s. t.} \qquad \bold{S} \, \vec v=0 </math>

Применения

АМП не требует больших вычислительных мощностей, поэтому можно достаточно эффективно варьировать условия моделирования.

Удаление реакций

Чтобы определить реакции (а также ферменты, их катализирующие, и их гены), которые являются ключевыми для наработки биомассы (или другого целевого параметра системы), их можно поочередно удалять из метаболической сети и решать систему. Если при решении системы целевая выход биомассы сильно уменьшается, эта реакция является ключевой, если не меняется или меняется слабо – не ключевая.

Реакции можно удалять попарно. Это применяется при моделировании воздействия на систему лекарств или их комбинаций.

Кроме того, вместо полного удаления, можно смоделировать ингибирование реакции, изменяя граничные условия.

Оптимизация условий роста

АМП можно использовать для оптимизации условий роста, то есть подбора состава культуральной среды. Варьируя ограничение на потоки потребления питательных веществ из окружающей среды, и оптимизируя выход биомассы, можно подобрать их оптимальные концентрации для максимальной скорости роста клеток.

Расширения

Анализ нестационарных метаболических потоков (Flux variability analysis)

Анализ нестационарных метаболических потоков (АНМП) — метод, позволяющий решить обратную задачу для АМП. В случае использования АНМП результатом служат значения границ потока для каждой реакции, которые в правильной комбинации с другими потокам воспроизводят оптимальное решение. Реакции, для которых характерна низкая изменчивость, имеют большое значение для организма. И АНМП является перспективным методом для выявления таких важных реакций.

Минимизация метаболического регулирования (Minimization of Metabolic Adjustment)

При работе с модифицированными бактериальными нокаутами или микроорганизмами, выращиваемыми на питательных средах, но не подвергавшимся длительному эволюционному давлению, стационарное состояние, являющееся необходимым условием использования метода АМП, достигается в сильно варьирующие временные промежутки или не достигается вовсе. К примеру, скорость роста E. coli на глицероле в качестве первичного источника углерода не будет совпадать со скоростью, предсказанной с помощью метода АМП. Но при дальнейшем 40-дневном культивировании, в течение которых происходит смена более 700 поколений, бактерии успевают адаптироваться, поэтому скорость их роста совпадает с предсказаниями АМП.

При всевозможных метаболических пертурбациях, вызванные изменением концентрации субстрата при попадании на питательную среду или нокаутом гена, экспрессирующим фермент метаболического пути, наиболее интересным является наблюдение за мгновенными эффектов происходящих в системе при пертурбациях. Процессы, занимающее большее время, направлены на реорганизацию потоков с целью достижения оптимального уровня метаболизма. Метод минимизации метаболического регулирования (ММР) предсказывает мгновенное субоптимальное распределение потоков посредством минимизации эвклидового расстояния между распределением потоков дикого типа, полученного методом АМП и распределением потоков мутанта, полученного методом квадратичного программирования. Из этого получается следующая задача оптимизации:

<math>

\min\ ||\mathbf{v_w} - \mathbf{v_d}||^2 \qquad </math>

при условии <math>\mathbf{S}\cdot\mathbf{v_d}=0

</math>

где <math>\mathbf{v_w}</math> отражает распределение потоков дикого типа (состояние без пертурбаций), а <math>\mathbf{v_d}</math> представляет собой распределение потоков при делеции гена. Это уравнение упрощается до вида:

<math>

\min\ \frac{1}{2}\,{\mathbf{v_d}}^T\,\mathbf{I}\,\mathbf{v_d} + (\mathbf{-v_w})\cdot\mathbf{v_d} \qquad </math>

при условии <math>\mathbf{S}\cdot\mathbf{v_d}=0

</math>

Так выглядит условие задачи ММР.

Метод Regulatory On-Off Minimization (ROOM)

ROOM является улучшенным методом предсказания метаболического статуса организма после нокаута гена. Предпосылка метода такая же какие в MOMA: организм после нокаута будет стремиться восстановить распределение потоков максимально близко к дикому типу. Но далее предполагается, что стационарное состояние будет достигнуто через серию кратковременных метаболических изменений и что организм будет стремиться минимизировать число регуляторных изменений, направленных на достижение состояния дикого типа. Вместо использования метода минимизации метрических расстояний, ROOM использует метод смешанного целочисленного линейного программирования.

Сравнение с другими методами

Choke point analysis

В отличие от choke point analysis, который рассматривает только точки сети, где метаболиты были произведены, но не потреблены или наоборот (то есть рассматривается только либо левая, либо правая часть реакции, соответственно). АБП — это полная модель метаболической сети, так как АБП учитывает и потреблённые и произведённые метаболиты на всех этапах анализа. Самый большой минус choke point analysis для моделирования сетевых эффектов заключается в том, что рассматривается каждая реакция в сети в отдельности и не учитывается общая картина метаболического пути. Таким образом, если путь является длинным, то реакции влияющие друг на друга, но находящиеся на далеком расстоянии не могут быть воспроизведены с помощью данного метода.

Dynamic metabolic simulation

Динамическое моделирование в отличие от АБП не использует стационарное приближение. Например, АБП невозможно использовать для моделирования функционирования нервных клеток. Так как АБП не учитывает концентрацию метаболитов,  возможна ситуация, при которой концентрации будут слишком большими для биологической системы. С помощью динамического моделирования эти проблемы можно избежать. Но АБП в свою очередь использует гораздо меньше вычислительных ресурсов.

Программное обеспечение

1. COBRA toolbox
2. OptFlux
3. FASIMU
4. SurreyFBA
5. WEbcoli
6. Acorn
7. FAME
8. GEMSiRV
9. MetaFluxNet
10. FBA-SimVis
11. OptFlux

Отрывок, характеризующий Анализ метаболических потоков

Сказать «завтра» и выдержать тон приличия было не трудно; но приехать одному домой, увидать сестер, брата, мать, отца, признаваться и просить денег, на которые не имеешь права после данного честного слова, было ужасно.
Дома еще не спали. Молодежь дома Ростовых, воротившись из театра, поужинав, сидела у клавикорд. Как только Николай вошел в залу, его охватила та любовная, поэтическая атмосфера, которая царствовала в эту зиму в их доме и которая теперь, после предложения Долохова и бала Иогеля, казалось, еще более сгустилась, как воздух перед грозой, над Соней и Наташей. Соня и Наташа в голубых платьях, в которых они были в театре, хорошенькие и знающие это, счастливые, улыбаясь, стояли у клавикорд. Вера с Шиншиным играла в шахматы в гостиной. Старая графиня, ожидая сына и мужа, раскладывала пасьянс с старушкой дворянкой, жившей у них в доме. Денисов с блестящими глазами и взъерошенными волосами сидел, откинув ножку назад, у клавикорд, и хлопая по ним своими коротенькими пальцами, брал аккорды, и закатывая глаза, своим маленьким, хриплым, но верным голосом, пел сочиненное им стихотворение «Волшебница», к которому он пытался найти музыку.
Волшебница, скажи, какая сила
Влечет меня к покинутым струнам;
Какой огонь ты в сердце заронила,
Какой восторг разлился по перстам!
Пел он страстным голосом, блестя на испуганную и счастливую Наташу своими агатовыми, черными глазами.
– Прекрасно! отлично! – кричала Наташа. – Еще другой куплет, – говорила она, не замечая Николая.
«У них всё то же» – подумал Николай, заглядывая в гостиную, где он увидал Веру и мать с старушкой.
– А! вот и Николенька! – Наташа подбежала к нему.
– Папенька дома? – спросил он.
– Как я рада, что ты приехал! – не отвечая, сказала Наташа, – нам так весело. Василий Дмитрич остался для меня еще день, ты знаешь?
– Нет, еще не приезжал папа, – сказала Соня.
– Коко, ты приехал, поди ко мне, дружок! – сказал голос графини из гостиной. Николай подошел к матери, поцеловал ее руку и, молча подсев к ее столу, стал смотреть на ее руки, раскладывавшие карты. Из залы всё слышались смех и веселые голоса, уговаривавшие Наташу.
– Ну, хорошо, хорошо, – закричал Денисов, – теперь нечего отговариваться, за вами barcarolla, умоляю вас.
Графиня оглянулась на молчаливого сына.
– Что с тобой? – спросила мать у Николая.
– Ах, ничего, – сказал он, как будто ему уже надоел этот всё один и тот же вопрос.
– Папенька скоро приедет?
– Я думаю.
«У них всё то же. Они ничего не знают! Куда мне деваться?», подумал Николай и пошел опять в залу, где стояли клавикорды.
Соня сидела за клавикордами и играла прелюдию той баркароллы, которую особенно любил Денисов. Наташа собиралась петь. Денисов восторженными глазами смотрел на нее.
Николай стал ходить взад и вперед по комнате.
«И вот охота заставлять ее петь? – что она может петь? И ничего тут нет веселого», думал Николай.
Соня взяла первый аккорд прелюдии.
«Боже мой, я погибший, я бесчестный человек. Пулю в лоб, одно, что остается, а не петь, подумал он. Уйти? но куда же? всё равно, пускай поют!»
Николай мрачно, продолжая ходить по комнате, взглядывал на Денисова и девочек, избегая их взглядов.
«Николенька, что с вами?» – спросил взгляд Сони, устремленный на него. Она тотчас увидала, что что нибудь случилось с ним.
Николай отвернулся от нее. Наташа с своею чуткостью тоже мгновенно заметила состояние своего брата. Она заметила его, но ей самой так было весело в ту минуту, так далека она была от горя, грусти, упреков, что она (как это часто бывает с молодыми людьми) нарочно обманула себя. Нет, мне слишком весело теперь, чтобы портить свое веселье сочувствием чужому горю, почувствовала она, и сказала себе:
«Нет, я верно ошибаюсь, он должен быть весел так же, как и я». Ну, Соня, – сказала она и вышла на самую середину залы, где по ее мнению лучше всего был резонанс. Приподняв голову, опустив безжизненно повисшие руки, как это делают танцовщицы, Наташа, энергическим движением переступая с каблучка на цыпочку, прошлась по середине комнаты и остановилась.
«Вот она я!» как будто говорила она, отвечая на восторженный взгляд Денисова, следившего за ней.
«И чему она радуется! – подумал Николай, глядя на сестру. И как ей не скучно и не совестно!» Наташа взяла первую ноту, горло ее расширилось, грудь выпрямилась, глаза приняли серьезное выражение. Она не думала ни о ком, ни о чем в эту минуту, и из в улыбку сложенного рта полились звуки, те звуки, которые может производить в те же промежутки времени и в те же интервалы всякий, но которые тысячу раз оставляют вас холодным, в тысячу первый раз заставляют вас содрогаться и плакать.
Наташа в эту зиму в первый раз начала серьезно петь и в особенности оттого, что Денисов восторгался ее пением. Она пела теперь не по детски, уж не было в ее пеньи этой комической, ребяческой старательности, которая была в ней прежде; но она пела еще не хорошо, как говорили все знатоки судьи, которые ее слушали. «Не обработан, но прекрасный голос, надо обработать», говорили все. Но говорили это обыкновенно уже гораздо после того, как замолкал ее голос. В то же время, когда звучал этот необработанный голос с неправильными придыханиями и с усилиями переходов, даже знатоки судьи ничего не говорили, и только наслаждались этим необработанным голосом и только желали еще раз услыхать его. В голосе ее была та девственная нетронутость, то незнание своих сил и та необработанная еще бархатность, которые так соединялись с недостатками искусства пенья, что, казалось, нельзя было ничего изменить в этом голосе, не испортив его.
«Что ж это такое? – подумал Николай, услыхав ее голос и широко раскрывая глаза. – Что с ней сделалось? Как она поет нынче?» – подумал он. И вдруг весь мир для него сосредоточился в ожидании следующей ноты, следующей фразы, и всё в мире сделалось разделенным на три темпа: «Oh mio crudele affetto… [О моя жестокая любовь…] Раз, два, три… раз, два… три… раз… Oh mio crudele affetto… Раз, два, три… раз. Эх, жизнь наша дурацкая! – думал Николай. Всё это, и несчастье, и деньги, и Долохов, и злоба, и честь – всё это вздор… а вот оно настоящее… Hy, Наташа, ну, голубчик! ну матушка!… как она этот si возьмет? взяла! слава Богу!» – и он, сам не замечая того, что он поет, чтобы усилить этот si, взял втору в терцию высокой ноты. «Боже мой! как хорошо! Неужели это я взял? как счастливо!» подумал он.
О! как задрожала эта терция, и как тронулось что то лучшее, что было в душе Ростова. И это что то было независимо от всего в мире, и выше всего в мире. Какие тут проигрыши, и Долоховы, и честное слово!… Всё вздор! Можно зарезать, украсть и всё таки быть счастливым…


Давно уже Ростов не испытывал такого наслаждения от музыки, как в этот день. Но как только Наташа кончила свою баркароллу, действительность опять вспомнилась ему. Он, ничего не сказав, вышел и пошел вниз в свою комнату. Через четверть часа старый граф, веселый и довольный, приехал из клуба. Николай, услыхав его приезд, пошел к нему.
– Ну что, повеселился? – сказал Илья Андреич, радостно и гордо улыбаясь на своего сына. Николай хотел сказать, что «да», но не мог: он чуть было не зарыдал. Граф раскуривал трубку и не заметил состояния сына.
«Эх, неизбежно!» – подумал Николай в первый и последний раз. И вдруг самым небрежным тоном, таким, что он сам себе гадок казался, как будто он просил экипажа съездить в город, он сказал отцу.
– Папа, а я к вам за делом пришел. Я было и забыл. Мне денег нужно.
– Вот как, – сказал отец, находившийся в особенно веселом духе. – Я тебе говорил, что не достанет. Много ли?
– Очень много, – краснея и с глупой, небрежной улыбкой, которую он долго потом не мог себе простить, сказал Николай. – Я немного проиграл, т. е. много даже, очень много, 43 тысячи.
– Что? Кому?… Шутишь! – крикнул граф, вдруг апоплексически краснея шеей и затылком, как краснеют старые люди.
– Я обещал заплатить завтра, – сказал Николай.
– Ну!… – сказал старый граф, разводя руками и бессильно опустился на диван.
– Что же делать! С кем это не случалось! – сказал сын развязным, смелым тоном, тогда как в душе своей он считал себя негодяем, подлецом, который целой жизнью не мог искупить своего преступления. Ему хотелось бы целовать руки своего отца, на коленях просить его прощения, а он небрежным и даже грубым тоном говорил, что это со всяким случается.
Граф Илья Андреич опустил глаза, услыхав эти слова сына и заторопился, отыскивая что то.
– Да, да, – проговорил он, – трудно, я боюсь, трудно достать…с кем не бывало! да, с кем не бывало… – И граф мельком взглянул в лицо сыну и пошел вон из комнаты… Николай готовился на отпор, но никак не ожидал этого.
– Папенька! па…пенька! – закричал он ему вслед, рыдая; простите меня! – И, схватив руку отца, он прижался к ней губами и заплакал.

В то время, как отец объяснялся с сыном, у матери с дочерью происходило не менее важное объяснение. Наташа взволнованная прибежала к матери.
– Мама!… Мама!… он мне сделал…
– Что сделал?
– Сделал, сделал предложение. Мама! Мама! – кричала она. Графиня не верила своим ушам. Денисов сделал предложение. Кому? Этой крошечной девочке Наташе, которая еще недавно играла в куклы и теперь еще брала уроки.
– Наташа, полно, глупости! – сказала она, еще надеясь, что это была шутка.
– Ну вот, глупости! – Я вам дело говорю, – сердито сказала Наташа. – Я пришла спросить, что делать, а вы мне говорите: «глупости»…
Графиня пожала плечами.
– Ежели правда, что мосьё Денисов сделал тебе предложение, то скажи ему, что он дурак, вот и всё.
– Нет, он не дурак, – обиженно и серьезно сказала Наташа.
– Ну так что ж ты хочешь? Вы нынче ведь все влюблены. Ну, влюблена, так выходи за него замуж! – сердито смеясь, проговорила графиня. – С Богом!
– Нет, мама, я не влюблена в него, должно быть не влюблена в него.
– Ну, так так и скажи ему.
– Мама, вы сердитесь? Вы не сердитесь, голубушка, ну в чем же я виновата?
– Нет, да что же, мой друг? Хочешь, я пойду скажу ему, – сказала графиня, улыбаясь.
– Нет, я сама, только научите. Вам всё легко, – прибавила она, отвечая на ее улыбку. – А коли бы видели вы, как он мне это сказал! Ведь я знаю, что он не хотел этого сказать, да уж нечаянно сказал.
– Ну всё таки надо отказать.
– Нет, не надо. Мне так его жалко! Он такой милый.
– Ну, так прими предложение. И то пора замуж итти, – сердито и насмешливо сказала мать.
– Нет, мама, мне так жалко его. Я не знаю, как я скажу.
– Да тебе и нечего говорить, я сама скажу, – сказала графиня, возмущенная тем, что осмелились смотреть, как на большую, на эту маленькую Наташу.
– Нет, ни за что, я сама, а вы слушайте у двери, – и Наташа побежала через гостиную в залу, где на том же стуле, у клавикорд, закрыв лицо руками, сидел Денисов. Он вскочил на звук ее легких шагов.
– Натали, – сказал он, быстрыми шагами подходя к ней, – решайте мою судьбу. Она в ваших руках!
– Василий Дмитрич, мне вас так жалко!… Нет, но вы такой славный… но не надо… это… а так я вас всегда буду любить.
Денисов нагнулся над ее рукою, и она услыхала странные, непонятные для нее звуки. Она поцеловала его в черную, спутанную, курчавую голову. В это время послышался поспешный шум платья графини. Она подошла к ним.
– Василий Дмитрич, я благодарю вас за честь, – сказала графиня смущенным голосом, но который казался строгим Денисову, – но моя дочь так молода, и я думала, что вы, как друг моего сына, обратитесь прежде ко мне. В таком случае вы не поставили бы меня в необходимость отказа.
– Г'афиня, – сказал Денисов с опущенными глазами и виноватым видом, хотел сказать что то еще и запнулся.
Наташа не могла спокойно видеть его таким жалким. Она начала громко всхлипывать.
– Г'афиня, я виноват перед вами, – продолжал Денисов прерывающимся голосом, – но знайте, что я так боготво'ю вашу дочь и всё ваше семейство, что две жизни отдам… – Он посмотрел на графиню и, заметив ее строгое лицо… – Ну п'ощайте, г'афиня, – сказал он, поцеловал ее руку и, не взглянув на Наташу, быстрыми, решительными шагами вышел из комнаты.

На другой день Ростов проводил Денисова, который не хотел более ни одного дня оставаться в Москве. Денисова провожали у цыган все его московские приятели, и он не помнил, как его уложили в сани и как везли первые три станции.