Стеклянный микроэлектрод

У этого термина есть и другие значения, см. Электрод (значения)

Стекля́нный микроэлектро́д — очень тонкая стеклянная пипетка, заполненная электролитом. Используется в электрофизиологии. Разработка микроэлектродных методов позволила вести электрофизиологические исследования на уровне отдельных клеток.

Диаметр кончика стеклянного микроэлектрода около 0,5 мкм, иногда — менее 0,1 мкм, при разглядывании в оптический микроскоп он может быть неразличим.

Не следует путать этот инструмент с субтильными моделями ионометрических стеклянных электродов, в частности, также используемых в электрофизиологии.

Применение

Существует три основных способа использования микроэлектродов:

• для внутриклеточной регистрации электрических параметров клеточных мембран,
• для поляризации клеточных мембран электрическим током,
• для введения различных веществ внутрь клетки (ионофорез) или подачи их на её поверхность (аппликация).

Дальнейшим развитием микроэлектродной техники явился метод локальной фиксации потенциала (метод пэтч кламп). Разработанные для этого метода специальные типы микроэлектродов обычно называют микропипетками. Чувствительность метода позволяет регистрировать активность отдельных ионных каналов клеточной мембраны.

История

До разработки стеклянных микроэлектродов в физиологии использовались металлические электроды, например, из вольфрамовой проволоки, заточенной электрохимически. Малое электрическое сопротивление металлических электродов позволяло использовать с ними примитивную регистрирующую аппаратуру с малым входным сопротивлением. В некоторых областях такие электроды применяются и по сей день.

Впервые стеклянные микроэлектроды применили в 1949 году Г. Линг и Р. В. Джерард в своей работе по регистрации мембранного потенциала миоцитов лягушки.

В. Л. Настук и А. Л. Ходжкин в 1950 году, используя микроэлектродную технику, зарегистрировали потенциал действия мышечного волокна.

Использовать стеклянные микроэлектроды для аппликации веществ на мембрану клетки предложил В. Л. Настук в 1953 году.

В СССР микроэлектродную технику ввёл в практику Платон Григорьевич Костюк. На Биологическом факультете МГУ Г. А. Курелла применил в своей работе одновременно микроэлектродную технику и миниатюрные стеклянные ионометрические электроды для исследований субклеточных структур^{[уточнить]}.

Конструкция и изготовление

Материалом для изготовления микроэлектродов служит стеклянный капилляр диаметром около 1 мм. Обычно используют марку стекла «Пирекс», реже применяют другие типы стекла — алюмосиликатное 38-ЗС и кварцевое стекло. Часто в качестве заготовок берут капилляр со вплавленными внутрь него стеклянными нитями — в таком случае в дальнейшем облегчается заполнение микроэлектрода электролитом. Заготовки тщательно очищают.

Приготовление микропипетки

Стеклянный микроэлектрод изготавливается вытягиванием и разрывом нагретого капилляра на специальном приспособлении — пуллере (микрокузнице). Параметры получающегося микроэлектрода зависят от выбранного сорта стекла, диаметра капилляра, температуры нагрева, момента начала рывка и его силы. Наиболее совершенные модели современных пуллеров с микропроцессорным управлением позволяют программировать различные формы кончика вытягиваемой микропипетки, обеспечивая заранее заданные свойства и хорошую их повторяемость.

Цилиндрическая часть получившейся заготовки плавно суживается, переходя в колющую часть. Вытянутые микропипетки осматривают под микроскопом, при диаметре колющего кончика менее 0,5 мкм он неразличим, теряясь в интерференционной кайме. В некоторых случаях кончик микроэлектрода дополнительно особым образом затачивают или оплавляют.

Микроэлектроды для пэтч кламп дополнительно покрывают силиконом для обеспечения формирования гигаомного контакта при касании мембраны клетки.

Заполнение электрода

Заготовку заполняют электролитом, чаще всего 2—3 М раствором хлорида калия. Иногда используют электролиты другого состава или заполняют электрод легкоплавким металлом, например, сплавом Вуда.

Заполнение электродов может быть затруднено из-за очень малого диаметра его рабочей части. Для его облегчения предложен ряд методик: заполнение в вакууме, предварительное заполнение спиртом и затем вытеснение спирта электролитом. В настоящее время широко применяется предложенный Тасаки метод с использованием вплавленного в микропипетку стеклянного волокна, при этом микроэлектрод заполняется под действием капиллярных сил.

Подключение и контроль

Для подключения электродов к измерительной аппаратуре их фиксируют в заполненном электролитом цанговом держателе или вводят в цилиндрическую часть заполненного электрода хлорированную серебряную проволоку.

Качество заполненного и подключенного микроэлектрода контролируют, измеряя его сопротивление, которое имеет порядок единиц мегаом. Меньшее сопротивление свидетельствует о том, что кончик микроэлектрода обломлен, бо́льшее или хаотично меняющееся — о забитости колющего кончика грязью.

Готовые микроэлектроды плохо хранятся, поэтому изготавливают их обычно непосредственно перед началом эксперимента. Некоторое время, не более суток, их можно хранить в холодильнике, погрузив в стаканчик с электролитом. При длительном хранении электроды теряют годность из-за кристаллизации электролита, возможно зарастание их колониями микроорганизмов.

Физико-химические свойства микроэлектродов

Между микроэлектродом и средой, в которую он погружен (физиологическим раствором, клеточным содержимым), протекают различные физико-химические процессы.

• Диффузия. Концентрация электролита в микроэлектроде выше, чем в окружающей его среде, поэтому вещества электролита будут переходить в физиологический раствор или внутрь клетки за счёт диффузии.

• Ионофорез
• Электроосмос
• Гидростатические процессы

Электрические свойства микроэлектродов

Электрическое сопротивление — важнейший параметр микроэлектрода. Сопротивление обязательно контролируется перед началом эксперимента, а в ряде случаев — и в ходе работы. Для годного электрода сопротивление находится в диапазоне между 5 и 20 МОм. Сопротивление менее 1 МОм — признак обломленной колющей части, более 60 МОм — кончик электрода слишком тонок, либо закупорен выпавшими кристаллами или частицами исследуемого объекта. Хаотично меняющееся сопротивление также характерно для загрязненного электрода. Электроды с высоким сопротивлением имеют большие собственные шумы и чувствительность к электромагнитным помехам. При токах, превышающих 1 нА, вольт-амперные характеристики микроэлектродов могут становиться нелинейными. Расчёт сопротивления электродов возможен, но он сложен и не дает высокой точности, поэтому на практике сопротивление электрода определяют экспериментально.

Ёмкость электрода. Наличие у микроэлектрода собственной ёмкости искажает форму регистрируемого сигнала. Поэтому предпринимаются усилия для её снижения и компенсации: увеличивают диаметр цилиндрической части электрода, уменьшают его длину, для подключения к усилителю стараются использовать возможно более короткие провода. Для компенсация ёмкости электрода во входном каскаде усилителя применяется ёмкостная отрицательная обратная связь. Компенсирование ёмкости контролируется подачей на электрод прямоугольного сигнала — при верной настройке форма его фронта не искажена.

Потенциал смещения. Возникает по нескольким причинам. Основными являются:

• диффузионный потенциал — возникающий между электролитом, заполняющим электрод, и раствором, в который он погружен. Для уменьшения диффузионного потенциала, в качестве электролита используют раствор хлорида калия, так как у ионов K+ и Cl- одинаков заряд и близки коэффициенты диффузии.
• потенциал между серебряными проводниками микроэлектрода и опорного электрода
• потенциал колющей части. Его возникновение связано со свойствами контакта электролита и стекла в узком кончике микропипетки.

Потенциал смещения подключенного к усилителю и погруженного в физиологический раствор электрода компенсируется при регулировке усилителя.

Для уменьшения нежелательного собственного потенциала используют также следующие приёмы:

• тщательная очистка стеклянных заготовок промывкой в щёлочи и спирте;
• использование свежеизготовленных микропипеток;
• использование для заполнения электролитов высокой концентрации;
• подкисление электролита;
• отбор электродов с малым омическим сопротивлением;
• отбор электродов с низким собственным потенциалом.

Типы микроэлектродов

Многоканальные микроэлектроды

Многоканальные микроэлектроды часто используются в исследованиях с применением ионофореза (микроэлектрофореза). Они позволяют проводить одновременно регистрацию электрической активности и вводить активные вещества из соседних стволов микропипетки. Обычно число каналов такого сложного электрода не менее трёх: один служит для регистрации, второй — для компенсации и контроля эффектов тока и третий — для введения исследуемого вещества.

Отдельные каналы могут располагаться параллельно друг другу или коаксиально.

Большую паразитную ёмкость многоканальных микроэлектродов иногда компенсируют за счёт создания токопроводящего экрана путём напыления на его нерабочую часть металла или графита.

Для заполнения многоканальных микроэлектродов электролитом и растворами исследуемых веществ может применяться центрифугирование.

Подготовка многоканальных микроэлектродов технически сложна; высказывалось мнение, что их изготовление является настолько же искусством, насколько и наукой.

Составные микроэлектроды

Используют для тех же целей, что и многоканальные. Составные микроэлектроды сильнее травмируют клетку, однако по своим электрическим характеристикам часто превосходят многоканальные. Собирают из отдельных микроэлектродов, контролируя работу под микроскопом.

Плавающий микроэлектрод

Для регистрации электрической активности клеток сократимых тканей, например, миокарда, используют плавающие микроэлектроды, предложенные Вудбери и Брэди. Они имеют облегчённую конструкцию, с очень короткой цилиндрической частью и закрепляются на тонкой серебряной или вольфрамовой проволоке каплей лака. Микроманипулятором электрод подводится к поверхности ткани и опускается на неё. Вкалывается в ткань он под действием собственного веса; при попадании электрода в клетку отмечается скачок напряжения.

За счёт упругости проволоки электрод может двигаться вместе с тканью, в которую он вколот. На практике, удается удерживать электрод в клетке в течение нескольких минут .

Усилители для работы со стеклянными микроэлектродами

Усилители биопотенциалов, использующиеся со стеклянными микроэлектродами, должны обладать следующими характеристиками:

• наличие схемы компенсации ёмкости входной цепи;
• диапазон входных напряжений ± 1В;
• регулировка смещения ± 300 мВ;
• токи утечки менее 14 пА;
• время нарастания фронта сигнала — не более 100 мс;
• температурный дрейф — менее 50 мкВ.

Для работы методом пэтч кламп используются специализированные усилители.

См. также

• Усилитель биопотенциалов
• Потенциал действия

Литература

Камкин А. Г., Киселёва И. С. Техническое обеспечение микроэлектродного исследования клеток / под ред. И. С. Киселёвой. — М.: 2 МГОЛМИ им. Н. И. Пирогова, 1989. — 174 с. — 1 000 экз, экз.

Камкин А. Г. и др. Большой практикум по физиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. — М.: Изд. центр «Академия», 2007. — ISBN 978-5-7695-2723-4.

Физиология: руководство к экспериментальным работам: учеб. пособие / под ред. Камкина Г. А., Киселёвой И. С. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 384 с. — ISBN 978-5-9704-1777-5.

Кожечкин С. Н. Микроэлектроды // Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток / под ред. Вепринцев Б. Н., Крастс И. В. — Пущино: Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1975. — 800 экз.

Костюк П. Г. Микроэлектродная техника. — Киев: «Наукова Думка», 1960.

Пёрвис Р. Микроэлектродные методы внутриклеточной регистрации и ионофореза: Пер. с англ. = Microelectrode methods for intracellular recording and ionophoresis - R. D. Purves. — М.: «Мир», 1983. — 208 с. — 2300 экз.

Отрывок, характеризующий Стеклянный микроэлектрод

Борис вышел тихо в двери и пошел за Наташей, толстый мальчик сердито побежал за ними, как будто досадуя на расстройство, происшедшее в его занятиях.


Из молодежи, не считая старшей дочери графини (которая была четырьмя годами старше сестры и держала себя уже, как большая) и гостьи барышни, в гостиной остались Николай и Соня племянница. Соня была тоненькая, миниатюрненькая брюнетка с мягким, отененным длинными ресницами взглядом, густой черною косой, два раза обвившею ее голову, и желтоватым оттенком кожи на лице и в особенности на обнаженных худощавых, но грациозных мускулистых руках и шее. Плавностью движений, мягкостью и гибкостью маленьких членов и несколько хитрою и сдержанною манерой она напоминала красивого, но еще не сформировавшегося котенка, который будет прелестною кошечкой. Она, видимо, считала приличным выказывать улыбкой участие к общему разговору; но против воли ее глаза из под длинных густых ресниц смотрели на уезжавшего в армию cousin [двоюродного брата] с таким девическим страстным обожанием, что улыбка ее не могла ни на мгновение обмануть никого, и видно было, что кошечка присела только для того, чтоб еще энергичнее прыгнуть и заиграть с своим соusin, как скоро только они так же, как Борис с Наташей, выберутся из этой гостиной.
– Да, ma chere, – сказал старый граф, обращаясь к гостье и указывая на своего Николая. – Вот его друг Борис произведен в офицеры, и он из дружбы не хочет отставать от него; бросает и университет и меня старика: идет в военную службу, ma chere. А уж ему место в архиве было готово, и всё. Вот дружба то? – сказал граф вопросительно.
– Да ведь война, говорят, объявлена, – сказала гостья.
– Давно говорят, – сказал граф. – Опять поговорят, поговорят, да так и оставят. Ma chere, вот дружба то! – повторил он. – Он идет в гусары.
Гостья, не зная, что сказать, покачала головой.
– Совсем не из дружбы, – отвечал Николай, вспыхнув и отговариваясь как будто от постыдного на него наклепа. – Совсем не дружба, а просто чувствую призвание к военной службе.
Он оглянулся на кузину и на гостью барышню: обе смотрели на него с улыбкой одобрения.
– Нынче обедает у нас Шуберт, полковник Павлоградского гусарского полка. Он был в отпуску здесь и берет его с собой. Что делать? – сказал граф, пожимая плечами и говоря шуточно о деле, которое, видимо, стоило ему много горя.
– Я уж вам говорил, папенька, – сказал сын, – что ежели вам не хочется меня отпустить, я останусь. Но я знаю, что я никуда не гожусь, кроме как в военную службу; я не дипломат, не чиновник, не умею скрывать того, что чувствую, – говорил он, всё поглядывая с кокетством красивой молодости на Соню и гостью барышню.
Кошечка, впиваясь в него глазами, казалась каждую секунду готовою заиграть и выказать всю свою кошачью натуру.
– Ну, ну, хорошо! – сказал старый граф, – всё горячится. Всё Бонапарте всем голову вскружил; все думают, как это он из поручиков попал в императоры. Что ж, дай Бог, – прибавил он, не замечая насмешливой улыбки гостьи.
Большие заговорили о Бонапарте. Жюли, дочь Карагиной, обратилась к молодому Ростову:
– Как жаль, что вас не было в четверг у Архаровых. Мне скучно было без вас, – сказала она, нежно улыбаясь ему.
Польщенный молодой человек с кокетливой улыбкой молодости ближе пересел к ней и вступил с улыбающейся Жюли в отдельный разговор, совсем не замечая того, что эта его невольная улыбка ножом ревности резала сердце красневшей и притворно улыбавшейся Сони. – В середине разговора он оглянулся на нее. Соня страстно озлобленно взглянула на него и, едва удерживая на глазах слезы, а на губах притворную улыбку, встала и вышла из комнаты. Всё оживление Николая исчезло. Он выждал первый перерыв разговора и с расстроенным лицом вышел из комнаты отыскивать Соню.
– Как секреты то этой всей молодежи шиты белыми нитками! – сказала Анна Михайловна, указывая на выходящего Николая. – Cousinage dangereux voisinage, [Бедовое дело – двоюродные братцы и сестрицы,] – прибавила она.
– Да, – сказала графиня, после того как луч солнца, проникнувший в гостиную вместе с этим молодым поколением, исчез, и как будто отвечая на вопрос, которого никто ей не делал, но который постоянно занимал ее. – Сколько страданий, сколько беспокойств перенесено за то, чтобы теперь на них радоваться! А и теперь, право, больше страха, чем радости. Всё боишься, всё боишься! Именно тот возраст, в котором так много опасностей и для девочек и для мальчиков.
– Всё от воспитания зависит, – сказала гостья.
– Да, ваша правда, – продолжала графиня. – До сих пор я была, слава Богу, другом своих детей и пользуюсь полным их доверием, – говорила графиня, повторяя заблуждение многих родителей, полагающих, что у детей их нет тайн от них. – Я знаю, что я всегда буду первою confidente [поверенной] моих дочерей, и что Николенька, по своему пылкому характеру, ежели будет шалить (мальчику нельзя без этого), то всё не так, как эти петербургские господа.
– Да, славные, славные ребята, – подтвердил граф, всегда разрешавший запутанные для него вопросы тем, что всё находил славным. – Вот подите, захотел в гусары! Да вот что вы хотите, ma chere!
– Какое милое существо ваша меньшая, – сказала гостья. – Порох!
– Да, порох, – сказал граф. – В меня пошла! И какой голос: хоть и моя дочь, а я правду скажу, певица будет, Саломони другая. Мы взяли итальянца ее учить.
– Не рано ли? Говорят, вредно для голоса учиться в эту пору.
– О, нет, какой рано! – сказал граф. – Как же наши матери выходили в двенадцать тринадцать лет замуж?
– Уж она и теперь влюблена в Бориса! Какова? – сказала графиня, тихо улыбаясь, глядя на мать Бориса, и, видимо отвечая на мысль, всегда ее занимавшую, продолжала. – Ну, вот видите, держи я ее строго, запрещай я ей… Бог знает, что бы они делали потихоньку (графиня разумела: они целовались бы), а теперь я знаю каждое ее слово. Она сама вечером прибежит и всё мне расскажет. Может быть, я балую ее; но, право, это, кажется, лучше. Я старшую держала строго.
– Да, меня совсем иначе воспитывали, – сказала старшая, красивая графиня Вера, улыбаясь.
Но улыбка не украсила лица Веры, как это обыкновенно бывает; напротив, лицо ее стало неестественно и оттого неприятно.
Старшая, Вера, была хороша, была неглупа, училась прекрасно, была хорошо воспитана, голос у нее был приятный, то, что она сказала, было справедливо и уместно; но, странное дело, все, и гостья и графиня, оглянулись на нее, как будто удивились, зачем она это сказала, и почувствовали неловкость.
– Всегда с старшими детьми мудрят, хотят сделать что нибудь необыкновенное, – сказала гостья.
– Что греха таить, ma chere! Графинюшка мудрила с Верой, – сказал граф. – Ну, да что ж! всё таки славная вышла, – прибавил он, одобрительно подмигивая Вере.
Гостьи встали и уехали, обещаясь приехать к обеду.
– Что за манера! Уж сидели, сидели! – сказала графиня, проводя гостей.


Когда Наташа вышла из гостиной и побежала, она добежала только до цветочной. В этой комнате она остановилась, прислушиваясь к говору в гостиной и ожидая выхода Бориса. Она уже начинала приходить в нетерпение и, топнув ножкой, сбиралась было заплакать оттого, что он не сейчас шел, когда заслышались не тихие, не быстрые, приличные шаги молодого человека.
Наташа быстро бросилась между кадок цветов и спряталась.
Борис остановился посереди комнаты, оглянулся, смахнул рукой соринки с рукава мундира и подошел к зеркалу, рассматривая свое красивое лицо. Наташа, притихнув, выглядывала из своей засады, ожидая, что он будет делать. Он постоял несколько времени перед зеркалом, улыбнулся и пошел к выходной двери. Наташа хотела его окликнуть, но потом раздумала. «Пускай ищет», сказала она себе. Только что Борис вышел, как из другой двери вышла раскрасневшаяся Соня, сквозь слезы что то злобно шепчущая. Наташа удержалась от своего первого движения выбежать к ней и осталась в своей засаде, как под шапкой невидимкой, высматривая, что делалось на свете. Она испытывала особое новое наслаждение. Соня шептала что то и оглядывалась на дверь гостиной. Из двери вышел Николай.
– Соня! Что с тобой? Можно ли это? – сказал Николай, подбегая к ней.
– Ничего, ничего, оставьте меня! – Соня зарыдала.
– Нет, я знаю что.
– Ну знаете, и прекрасно, и подите к ней.
– Соооня! Одно слово! Можно ли так мучить меня и себя из за фантазии? – говорил Николай, взяв ее за руку.
Соня не вырывала у него руки и перестала плакать.
Наташа, не шевелясь и не дыша, блестящими главами смотрела из своей засады. «Что теперь будет»? думала она.
– Соня! Мне весь мир не нужен! Ты одна для меня всё, – говорил Николай. – Я докажу тебе.
– Я не люблю, когда ты так говоришь.
– Ну не буду, ну прости, Соня! – Он притянул ее к себе и поцеловал.
«Ах, как хорошо!» подумала Наташа, и когда Соня с Николаем вышли из комнаты, она пошла за ними и вызвала к себе Бориса.
– Борис, подите сюда, – сказала она с значительным и хитрым видом. – Мне нужно сказать вам одну вещь. Сюда, сюда, – сказала она и привела его в цветочную на то место между кадок, где она была спрятана. Борис, улыбаясь, шел за нею.
– Какая же это одна вещь ? – спросил он.
Она смутилась, оглянулась вокруг себя и, увидев брошенную на кадке свою куклу, взяла ее в руки.
– Поцелуйте куклу, – сказала она.
Борис внимательным, ласковым взглядом смотрел в ее оживленное лицо и ничего не отвечал.
– Не хотите? Ну, так подите сюда, – сказала она и глубже ушла в цветы и бросила куклу. – Ближе, ближе! – шептала она. Она поймала руками офицера за обшлага, и в покрасневшем лице ее видны были торжественность и страх.
– А меня хотите поцеловать? – прошептала она чуть слышно, исподлобья глядя на него, улыбаясь и чуть не плача от волненья.
Борис покраснел.
– Какая вы смешная! – проговорил он, нагибаясь к ней, еще более краснея, но ничего не предпринимая и выжидая.
Она вдруг вскочила на кадку, так что стала выше его, обняла его обеими руками, так что тонкие голые ручки согнулись выше его шеи и, откинув движением головы волосы назад, поцеловала его в самые губы.
Она проскользнула между горшками на другую сторону цветов и, опустив голову, остановилась.
– Наташа, – сказал он, – вы знаете, что я люблю вас, но…
– Вы влюблены в меня? – перебила его Наташа.
– Да, влюблен, но, пожалуйста, не будем делать того, что сейчас… Еще четыре года… Тогда я буду просить вашей руки.
Наташа подумала.
– Тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать… – сказала она, считая по тоненьким пальчикам. – Хорошо! Так кончено?
И улыбка радости и успокоения осветила ее оживленное лицо.
– Кончено! – сказал Борис.
– Навсегда? – сказала девочка. – До самой смерти?
И, взяв его под руку, она с счастливым лицом тихо пошла с ним рядом в диванную.


Графиня так устала от визитов, что не велела принимать больше никого, и швейцару приказано было только звать непременно кушать всех, кто будет еще приезжать с поздравлениями. Графине хотелось с глазу на глаз поговорить с другом своего детства, княгиней Анной Михайловной, которую она не видала хорошенько с ее приезда из Петербурга. Анна Михайловна, с своим исплаканным и приятным лицом, подвинулась ближе к креслу графини.
– С тобой я буду совершенно откровенна, – сказала Анна Михайловна. – Уж мало нас осталось, старых друзей! От этого я так и дорожу твоею дружбой.
Анна Михайловна посмотрела на Веру и остановилась. Графиня пожала руку своему другу.
– Вера, – сказала графиня, обращаясь к старшей дочери, очевидно, нелюбимой. – Как у вас ни на что понятия нет? Разве ты не чувствуешь, что ты здесь лишняя? Поди к сестрам, или…
Красивая Вера презрительно улыбнулась, видимо не чувствуя ни малейшего оскорбления.
– Ежели бы вы мне сказали давно, маменька, я бы тотчас ушла, – сказала она, и пошла в свою комнату.
Но, проходя мимо диванной, она заметила, что в ней у двух окошек симметрично сидели две пары. Она остановилась и презрительно улыбнулась. Соня сидела близко подле Николая, который переписывал ей стихи, в первый раз сочиненные им. Борис с Наташей сидели у другого окна и замолчали, когда вошла Вера. Соня и Наташа с виноватыми и счастливыми лицами взглянули на Веру.
Весело и трогательно было смотреть на этих влюбленных девочек, но вид их, очевидно, не возбуждал в Вере приятного чувства.
– Сколько раз я вас просила, – сказала она, – не брать моих вещей, у вас есть своя комната.
Она взяла от Николая чернильницу.
– Сейчас, сейчас, – сказал он, мокая перо.
– Вы всё умеете делать не во время, – сказала Вера. – То прибежали в гостиную, так что всем совестно сделалось за вас.
Несмотря на то, или именно потому, что сказанное ею было совершенно справедливо, никто ей не отвечал, и все четверо только переглядывались между собой. Она медлила в комнате с чернильницей в руке.
– И какие могут быть в ваши года секреты между Наташей и Борисом и между вами, – всё одни глупости!
– Ну, что тебе за дело, Вера? – тихеньким голоском, заступнически проговорила Наташа.
Она, видимо, была ко всем еще более, чем всегда, в этот день добра и ласкова.
– Очень глупо, – сказала Вера, – мне совестно за вас. Что за секреты?…
– У каждого свои секреты. Мы тебя с Бергом не трогаем, – сказала Наташа разгорячаясь.
– Я думаю, не трогаете, – сказала Вера, – потому что в моих поступках никогда ничего не может быть дурного. А вот я маменьке скажу, как ты с Борисом обходишься.
– Наталья Ильинишна очень хорошо со мной обходится, – сказал Борис. – Я не могу жаловаться, – сказал он.
– Оставьте, Борис, вы такой дипломат (слово дипломат было в большом ходу у детей в том особом значении, какое они придавали этому слову); даже скучно, – сказала Наташа оскорбленным, дрожащим голосом. – За что она ко мне пристает? Ты этого никогда не поймешь, – сказала она, обращаясь к Вере, – потому что ты никогда никого не любила; у тебя сердца нет, ты только madame de Genlis [мадам Жанлис] (это прозвище, считавшееся очень обидным, было дано Вере Николаем), и твое первое удовольствие – делать неприятности другим. Ты кокетничай с Бергом, сколько хочешь, – проговорила она скоро.
– Да уж я верно не стану перед гостями бегать за молодым человеком…
– Ну, добилась своего, – вмешался Николай, – наговорила всем неприятностей, расстроила всех. Пойдемте в детскую.
Все четверо, как спугнутая стая птиц, поднялись и пошли из комнаты.
– Мне наговорили неприятностей, а я никому ничего, – сказала Вера.
– Madame de Genlis! Madame de Genlis! – проговорили смеющиеся голоса из за двери.
Красивая Вера, производившая на всех такое раздражающее, неприятное действие, улыбнулась и видимо не затронутая тем, что ей было сказано, подошла к зеркалу и оправила шарф и прическу. Глядя на свое красивое лицо, она стала, повидимому, еще холоднее и спокойнее.

В гостиной продолжался разговор.
– Ah! chere, – говорила графиня, – и в моей жизни tout n'est pas rose. Разве я не вижу, что du train, que nous allons, [не всё розы. – при нашем образе жизни,] нашего состояния нам не надолго! И всё это клуб, и его доброта. В деревне мы живем, разве мы отдыхаем? Театры, охоты и Бог знает что. Да что обо мне говорить! Ну, как же ты это всё устроила? Я часто на тебя удивляюсь, Annette, как это ты, в свои годы, скачешь в повозке одна, в Москву, в Петербург, ко всем министрам, ко всей знати, со всеми умеешь обойтись, удивляюсь! Ну, как же это устроилось? Вот я ничего этого не умею.
– Ах, душа моя! – отвечала княгиня Анна Михайловна. – Не дай Бог тебе узнать, как тяжело остаться вдовой без подпоры и с сыном, которого любишь до обожания. Всему научишься, – продолжала она с некоторою гордостью. – Процесс мой меня научил. Ежели мне нужно видеть кого нибудь из этих тузов, я пишу записку: «princesse une telle [княгиня такая то] желает видеть такого то» и еду сама на извозчике хоть два, хоть три раза, хоть четыре, до тех пор, пока не добьюсь того, что мне надо. Мне всё равно, что бы обо мне ни думали.
– Ну, как же, кого ты просила о Бореньке? – спросила графиня. – Ведь вот твой уже офицер гвардии, а Николушка идет юнкером. Некому похлопотать. Ты кого просила?
– Князя Василия. Он был очень мил. Сейчас на всё согласился, доложил государю, – говорила княгиня Анна Михайловна с восторгом, совершенно забыв всё унижение, через которое она прошла для достижения своей цели.