Двухфотонный лазерный микроскоп
Двухфото́нный ла́зерный микроско́п — лазерный микроскоп, позволяющий наблюдать живые ткани на глубине более одного миллиметра, используя явление флуоресценции. Двухфотонный микроскоп является разновидностью мультифотонного флуоресцентного микроскопа. Его преимущества по сравнению с конфокальным микроскопом — большая проникающая способность и низкая степень фототоксичности[1].
Двухфотонный микроскоп был впервые сконструирован Винфредом Денком в лаборатории В. В. Вебба в Корнелльском университете[2]. Он скомбинировал идею двухфотонного возбуждения с лазерным сканированием.
Принцип действия
Двухфотонный лазерный микроскоп основан на физическом принципе, описанном Марией Гёпперт-Майер в её докторской диссертации[3] в 1931 г.
Процесс двухфотонного возбуждения происходит следующим образом: два фотона, обладающие низкой энергией, возбуждают флюорофор (способную к флюоресценции молекулу или часть молекулы) в течение одного квантового события. Результатом этого возбуждения является последующее испускание возбужденными молекулами флюоресцентного фотона. Энергия флуоресцентного фотона больше энергии возбуждающих фотонов.
Вероятность того, что оба фотона возбуждения будут поглощены одной молекулой, очень мала. Поэтому необходим большой поток возбуждающих фотонов, который можно получить при помощи лазера, испускающего фотоны с большой частотой следования импульсов (80 МГц). Наиболее часто используемые флюорофоры имеют спектр возбуждения в промежутке 400—500 нм, в то время как длина волны возбуждающего лазера находится в промежутке 700—1000 нм (область инфракрасных волн). Если флюорофор поглотит одновременно два фотона, то он получит достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние. Далее возбужденный флюорофор испустит один фотон (в видимой части спектра), длина волны которого зависит от типа флюорофора.
Поскольку для того, чтобы флюорофор перешёл в возбуждённое состояние, необходимо поглощение двух фотонов, вероятность испускания флюорофором вторичного фотона пропорциональна квадрату интенсивности возбуждения. Поэтому флуоресценция будет сильнее в случае, когда луч лазера четко сфокусирован, а не рассеян. Максимальная флуоресценция наблюдается в фокальном объёме (объёме, где сфокусирован луч лазера) и демонстрирует резкое уменьшение в области вне фокуса.
Конструкция
В двухфотонном микроскопе луч инфракрасного лазера сфокусирован с помощью собирающей линзы объектива. Обычно используется высокочастотный 80 МГц сапфировый лазер, испускающий импульс с длительностью 100 фемтосекунд, обеспечивающей высокую плотность фотонного потока, которая необходима для двухфотонного поглощения.
Свет, испускаемый флюоресцирующим образцом, усиливается с помощью высокочувствительного фотоумножителя. Поскольку приёмник света является одноканальным, наблюдаемая в данном фокальном объёме интенсивность света формирует один пиксел изображения. Для того чтобы получить двухмерное пиксельное изображение, производится сканирование в фокальной плоскости образца.
Преимущества и недостатки
Использование инфракрасного света для возбуждения флюорофора в исследуемых тканях имеет свои преимущества[4]:
- Длинные волны рассеиваются меньше, чем короткие, что обеспечивает высокое пространственное разрешение.
- Возбуждающие фотоны имеют маленькую энергию, следовательно, они менее разрушительны для тканей (что продлевает жизнь исследуемой ткани).
Но есть и некоторые недостатки:
- Для работы лазера требуются дорогие оптические приборы для обеспечения интенсивности импульса.
- Двухфотонный спектр поглощения флюорофора может сильно меняться в отличие от однофотонного спектра поглощения.
- Луч с длиной волны более 1400 нм значительно поглощается водой в живых тканях.
Напишите отзыв о статье "Двухфотонный лазерный микроскоп"
Ссылки
- ↑ Denk W, Strickler J, Webb W (1990). «Two-photon laser scanning fluorescence microscopy». Science 248 (4951): 73-6. PMID 2321027.
- ↑ Denk W, Svoboda K (1997). «Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick». Neuron 18 (3): 351-7. PMID 9115730.
- ↑ Göppert-Mayer M (1931). «[adsabs.harvard.edu/abs/1931AnP...401..273G Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen]». Ann Phys 9: 273–95.
- ↑ Helmchen F, Denk W (2005). «Deep tissue two-photon microscopy». Nat Methods 2 (12): 932-40. PMID 16299478.
|
Это заготовка статьи по физике. Вы можете помочь проекту, дополнив её. |
Отрывок, характеризующий Двухфотонный лазерный микроскоп
Единственное значение Березинской переправы заключается в том, что эта переправа очевидно и несомненно доказала ложность всех планов отрезыванья и справедливость единственно возможного, требуемого и Кутузовым и всеми войсками (массой) образа действий, – только следования за неприятелем. Толпа французов бежала с постоянно усиливающейся силой быстроты, со всею энергией, направленной на достижение цели. Она бежала, как раненый зверь, и нельзя ей было стать на дороге. Это доказало не столько устройство переправы, сколько движение на мостах. Когда мосты были прорваны, безоружные солдаты, московские жители, женщины с детьми, бывшие в обозе французов, – все под влиянием силы инерции не сдавалось, а бежало вперед в лодки, в мерзлую воду.Стремление это было разумно. Положение и бегущих и преследующих было одинаково дурно. Оставаясь со своими, каждый в бедствии надеялся на помощь товарища, на определенное, занимаемое им место между своими. Отдавшись же русским, он был в том же положении бедствия, но становился на низшую ступень в разделе удовлетворения потребностей жизни. Французам не нужно было иметь верных сведений о том, что половина пленных, с которыми не знали, что делать, несмотря на все желание русских спасти их, – гибли от холода и голода; они чувствовали, что это не могло быть иначе. Самые жалостливые русские начальники и охотники до французов, французы в русской службе не могли ничего сделать для пленных. Французов губило бедствие, в котором находилось русское войско. Нельзя было отнять хлеб и платье у голодных, нужных солдат, чтобы отдать не вредным, не ненавидимым, не виноватым, но просто ненужным французам. Некоторые и делали это; но это было только исключение.
Назади была верная погибель; впереди была надежда. Корабли были сожжены; не было другого спасения, кроме совокупного бегства, и на это совокупное бегство были устремлены все силы французов.
Чем дальше бежали французы, чем жальче были их остатки, в особенности после Березины, на которую, вследствие петербургского плана, возлагались особенные надежды, тем сильнее разгорались страсти русских начальников, обвинявших друг друга и в особенности Кутузова. Полагая, что неудача Березинского петербургского плана будет отнесена к нему, недовольство им, презрение к нему и подтрунивание над ним выражались сильнее и сильнее. Подтрунивание и презрение, само собой разумеется, выражалось в почтительной форме, в той форме, в которой Кутузов не мог и спросить, в чем и за что его обвиняют. С ним не говорили серьезно; докладывая ему и спрашивая его разрешения, делали вид исполнения печального обряда, а за спиной его подмигивали и на каждом шагу старались его обманывать.
Всеми этими людьми, именно потому, что они не могли понимать его, было признано, что со стариком говорить нечего; что он никогда не поймет всего глубокомыслия их планов; что он будет отвечать свои фразы (им казалось, что это только фразы) о золотом мосте, о том, что за границу нельзя прийти с толпой бродяг, и т. п. Это всё они уже слышали от него. И все, что он говорил: например, то, что надо подождать провиант, что люди без сапог, все это было так просто, а все, что они предлагали, было так сложно и умно, что очевидно было для них, что он был глуп и стар, а они были не властные, гениальные полководцы.
В особенности после соединения армий блестящего адмирала и героя Петербурга Витгенштейна это настроение и штабная сплетня дошли до высших пределов. Кутузов видел это и, вздыхая, пожимал только плечами. Только один раз, после Березины, он рассердился и написал Бенигсену, доносившему отдельно государю, следующее письмо:
«По причине болезненных ваших припадков, извольте, ваше высокопревосходительство, с получения сего, отправиться в Калугу, где и ожидайте дальнейшего повеления и назначения от его императорского величества».
Но вслед за отсылкой Бенигсена к армии приехал великий князь Константин Павлович, делавший начало кампании и удаленный из армии Кутузовым. Теперь великий князь, приехав к армии, сообщил Кутузову о неудовольствии государя императора за слабые успехи наших войск и за медленность движения. Государь император сам на днях намеревался прибыть к армии.
Старый человек, столь же опытный в придворном деле, как и в военном, тот Кутузов, который в августе того же года был выбран главнокомандующим против воли государя, тот, который удалил наследника и великого князя из армии, тот, который своей властью, в противность воле государя, предписал оставление Москвы, этот Кутузов теперь тотчас же понял, что время его кончено, что роль его сыграна и что этой мнимой власти у него уже нет больше. И не по одним придворным отношениям он понял это. С одной стороны, он видел, что военное дело, то, в котором он играл свою роль, – кончено, и чувствовал, что его призвание исполнено. С другой стороны, он в то же самое время стал чувствовать физическую усталость в своем старом теле и необходимость физического отдыха.
