Альтернативный сплайсинг

Альтернативный сплайсинг — процесс, позволяющий одному гену производить несколько мРНК и, соответственно, белков. Большинство генов в эукариотических геномах содержат экзоны и интроны. После транскрипции в процессе сплайсинга интроны удаляются из пре-мРНК. А вот экзон может включаться (или нет) в состав конечного транскрипта. Таким образом, с помощью альтернативного сплайсинга можно получить множество транскриптов, а, следовательно, и белков. Объединение различных сайтов сплайсинга позволяет индивидуальным генам экспрессировать множество мРНК, которые кодируют белки, порой, с антагонистическими функциями. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка. Разные изоформы тропонина образуются в разных тканях и на определенных стадиях их развития.

Предположено, что у эукариот альтернативный сплайсинг может быть важным эволюционным достижением: повысилась эффективность хранения информации. Недавно было показано, что у примерно 95 % мультиэкзонных генов человека наблюдается альтернативный сплайсинг. Геном круглого червя Caenorhabditis elegans по количеству генов практически не отличается от генома человека, однако альтернативному сплайсингу подвергаются пре-мРНК только 15 % генов. Таким образом, альтернативный сплайсинг позволяет увеличить разнообразие белковых продуктов генов, сохраняя при этом относительно небольшое количество различных генов в геноме и не создавая избыточных копий генов.

Разные варианты альтернативного сплайсинга одной пре-мРНК могут осуществляться в разные периоды развития организма и/или в разных тканях, а также у разных особей одного вида.

Один из наиболее впечатляющих примеров альтернативного сплайсинга — ген dscam в Drosophila melanogaster, содержащий 116 экзонов, из которых 17 всегда попадают в конечную мРНК. Теоретически, данная система может продуцировать 38016 различных белков. В действительности, обнаружено более 18000 в Drosophila melanogaster. Белки Dscam отвечают за правильное местонахождение нейронов и также, вероятно, участвуют в распознавании и фагоцитозе чужеродных бактерий.

Классификация

Существует несколько механизмов альтернативного сплайсинга:

1. Пропуск экзона или экзонной кассеты: в этом случае экзон может вырезаться из первичного транскрипта или сохраняться в нём. Это наиболее часто используемый механизм у млекопитающих.
2. Взаимоисключающие экзоны: из двух экзонов в конечном транскрипте сохраняется только один.
3. Использование альтернативного донорного сайта: есть несколько альтернативных 5'-участков сплайсинга (донорных сайтов), что изменяет 3'-границу вышележащего (upstream) экзона.
4. Использование альтернативного акцепторного сайта: используются разные 3'-участки сплайсинга (акцепторные сайты), что меняет 5'-границы нижележащего (downstream) экзона.
5. Удержание интрона: интрон сохраняется в последовательности транскрипта. Если интрон находится в кодирующей последовательности, то он может кодировать стоп-кодон или же сдвигать рамку считывания. А это может привести к потере функциональности белка, поэтому данный механизм альтернативного сплайсинга используется крайне редко у млекопитающих.

Помимо описанных основных механизмов альтернативного сплайсинга существует ещё 2 других механизма, благодаря которым разные мРНК могут получаться из одного гена: множественные промоторы и множественные сайты полиаденилирования. Транскрипция может начинаться с разных точек. В результате получаются транскрипты с разными экзонами на 5’-конце (множественные промоторы). Множественные сайты полиаденилирования обеспечивают разные 3’-концы для транскрипта. Оба механизма найдены в комбинации с альтернативным сплайсингом и добавляют разнообразия в типы мРНК, полученных от одного гена.

Механизм

Сплайсинг осуществляется сплайсосомой — массивной структурой, в состав которой входит 5 малых ядерных нуклеопротеидных частиц (snRNP) — U1, U2, U4, U5 и U6 (U3 не участвует в сплайсинге) — и большого количества вспомогательных белков. Вместе они способны точно распознать сайты сплайсинга и катализировать 2 шага реакции сплайсинга.

Сборка сплайсосомы начинается с распознавания U1 5’-сайта сплайсинга. После этого фактор сплайсинга 1 (SF1) связывается в точке разветвления (branch point, обычно это аденозин). Такой комплекс носит название E’. Затем большая субъединица (65 kDa) гетеродимерного вспомогательного фактора U2 (U2AF) образует комплекс с полипиримидиновым участком (polypyrimidine tract), а малая субъединица (35 kDa) U2AF связывается с 3’-терминальным AG на стыке интрона и экзона. Весь этот образовавшийся комплекс является АТФ-независимым и уже называется комплексом E. Позже, после замены SF1 на U2 в точке разветвления, комплекс Е становится АТФ-зависимым комплексом А.

Дальнейшее образование тройного U4/U6-U5 комплекса приводит к формированию комплекса В, который после экстенсивных конформационных изменений и перестроек превращается в каталитически активный комплекс С. U6 занимает позицию U1, а U1 и U4 уходят. Оставшийся комплекс претерпевает 2 реакции переэтерификации. В ходе первой реакции, 5’-конец интрона отщепляется от экзона, что перед ним, и присоединяется к сайту разветвления А через 2’,5’-фосфодиэфирную связь. Во второй реакции переэтерификации, 3’-конец интрона отщепляется от экзона, что расположен далее по последовательности, и два экзона объединяются. Образовавшийся интрон высвобождается в форме лассо и позднее деградирует.

Регуляция

Существуют различные способы регуляции альтернативного сплайсинга: РНК-белковые взаимодействия, РНК-РНК взаимодействия (при взаимоисключающих экзонах), взаимодействие пре-мРНК с некодирующими РНК, в том числе малыми ядрышковыми РНК и др. Несмотря на столь потенциальное разнообразие регуляторных механизмов, РНК-белковые взаимодействия считаются основными способами регуляции сплайсинга.

Регуляторные элементы

Участки последовательности РНК и регуляторы белков определяют, какой экзон удалить, а какой оставить. Существует 4 категории регуляторов:

• энхансеры сплайсинга экзонов (exonic splicing enhancers, ESEs)
• сайленсеры сплайсинга экзонов (exonic splicing silencers, ESSs)
• энхансеры сплайсинга интронов (intronic splicing enhancers, ISEs)
• сайленсеры сплайсинга интронов (intronic splicing silencers, ISSs)

Регуляторы, помогающие распознать сайт сплайсинга

Белки SR (серин(S)/аргинин(R)-богатые белки) играют важную роль в распознавании сайта сплайсинга. Например, когда они взаимодействуют с энхансерами экзонов (ESE), они помогают связываться U1 с 5’-сайтом сплайсинга, а также U2AF и U2 с 3’-сайтом сплайсинга. Эти взаимодействия (SR c энхансерами) происходят благодаря их RS доменам (содержат Arg-Ser повторы). Белки SR могут работать вместе с другими положительными регуляторами.

SR белок SRp38 (также известный как TASR, NSSR, FUSIP1 и SRrp40) в дефосфорилированном действует как репрессор сплайсинга. Однако, недавние исследования показали, что в фосфорилированном состоянии он также функционирует в качестве активатора, зависящего от сплайсируемой последовательности.

Ингибирование распознавания сайта сплайсинга

Ингибировать распознавание сайта сплайсинга можно разными способами. Первый, когда сайленсеры сплайсинга располагаются близко к сайту сплайсинга или к энхансерам сплайсинга, и, соответственно, может происходить стерическое ингибирование, при котором блокируется доступ к snRNP или положительным регуляторным факторам. Например, полипиримидин-связывающий белок (PTB; также известный как PTB1 и hnRNP I), связывается с полипиримидиновым участком и, тем самым, блокирует связывание U2AF с экзонами. Тканеспецифичные факторы сплайсинга FOX1 и FOX2, связываясь с интронной последовательностью, могут ингибировать формирование комплекса E', предотвращая связывание SF1 с точкой разветвления.

Ингибиторы сплайсинга могут стерически мешать связыванию активаторов с энхансерами. Семейство белков Hu/ELAV ингибирует связывание U1, конкурируя с белком TIA1, который взаимодействует с AU-богатой областью, расположенной далее по последовательности в 5’-сайте сплайсинга экзона 23а нейрофиброматозного типа 1. FOX1 и FOX2 также ингибируют формирование комплекса Е, связываясь с экзонной последовательностью, близко расположенной от ESE, где связываются TRA2 и SRp55. Из-за этого U2AF не может закрепиться.

Регуляция сплайсинга в зависимости от позиции экзона

Действие цис-регуляторных элементов иногда зависит от позиции регулируемого экзона. Несколько белков, например такие как NOVA1, NOVA2, FOX1, FOX2, hnRNP l, hnRNP l-подобный, hnRNP F и hnRNP H, могут действовать либо как репрессоры, либо как активаторы в зависимости от места сайта связывания.

Позиция сплайсинга может определять действие факторов сплайсинга. Энхансеры могут располагаться таким образом, что, когда факторы сплайсинга связываются с ними, другой экзон лучше расположен для действия сплайсосомы. Или наоборот, элементы сайленсинга соревнуются с компонентами сплайсосомы или как-то изменяют структуру мРНК, препятствуя узнаванию сайта сплайсинга.

Методы обнаружения альтернативного сплайсинга

Основным методом определения мест альтернативного сплайсинга в данный момент является секвенирование библиотек кДНК, полученных на матрице мРНК. Данный метод называется секвенированием РНК. Также возможно применение ДНК-микрочипов.

Альтернативный сплайсинг и заболевания

Изменения в альтернативном сплайсинге могут вызывать разные заболевания: нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, дыхательные заболевания, а также рак и болезнь Альцгеймера. В тканях, где происходит множество процессов (например головной мозг), требуется большое количество белков для выполнения различных функций. Любой дефект в альтернативном сплайсинге может резко изменить состав белков в клетке, вследствие чего и возникнут многие неврологические заболевания. Эти дефекты могут быть разделены на две основные группы: первичные и вторичные дефекты сплайсинга.

Первичные дефекты сплайсинга

При первичных дефектах сплайсинга происходит мутация в последовательности, которая важна для правильного прохождения альтернативного сплайсинга. Следовательно, сплайсинг не происходит должным образом. Многие мутации, приводящие к заболеваниям, вызваны нарушениями сплайсинга пре-мРНК. Примерами являются синдром Луи-Бара и нейрофиброматоз. Половина пациентов, страдающих этими заболеваниями, несет мутации, которые влияют на прохождение сплайсинга пре-мРНК. Другой пример первичных нарушений сплайсинга был обнаружен у пациентов с лобно-височной деменцией (аутосомно-доминантное расстройство, связано с 17 хромосомой). Дефекты в сплайсинге приводят к изменению транскриптов тау-белков, ассоциированных с микротрубочками, - MAPT. Эти белки накапливаются в аксонах или растущих нейронах. Изменения в сплайсинге MAPT могут также привести к другим заболеваниям, таким как болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, дисфункция глии и дегенерация спинного мозга. Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — это результат мутаций в гене дистрофина. Мутации вызывают нарушения в сплайсинге и продукцию неправильных мРНК. Разные мутации в пре-мРНК дистрофина вызывают промежуточный вариант МДД, мышечную дистрофию Беккера (МДБ).

Вторичные дефекты сплайсинга

Под вторичными дефектами сплайсинга подразумеваются мутации в регуляторных факторах, которые очень важны для процесса сплайсинга. Действие различных активаторов и/или репрессоров может определять пути прохождения альтернативного сплайсинга. В зависимости от того, какой регулятор действует, пре-мРНК меняется. В некоторых случаях, это может привести к серьёзным нарушениям. Примером таких нарушений является Синдром Прадера-Вилли, генетическая болезнь, характеризующаяся интеллектуальными и поведенческими отклонениями.

Фермент ацетилхолинэстераза (AChE) собирается из серии белков. В ходе альтернативного сплайсинга может получаться три изоформы белка, которые вызывают такие нейродегенеративные заболевания, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Разбалансировка регуляторов сплайсинга может приводить к избытку AChE-R, изоформе AChE, найденной у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера.

См. также

• Секвенирование РНК

Ссылки

• [humbio.ru/Humbio/transcription/00009828.htm Сплайсинг альтернативный: введение] — «биология человека».

Отрывок, характеризующий Альтернативный сплайсинг

– Что, мой друг?
– Нет, обещай мне, что ты не откажешь. Это тебе не будет стоить никакого труда, и ничего недостойного тебя в этом не будет. Только ты меня утешишь. Обещай, Андрюша, – сказала она, сунув руку в ридикюль и в нем держа что то, но еще не показывая, как будто то, что она держала, и составляло предмет просьбы и будто прежде получения обещания в исполнении просьбы она не могла вынуть из ридикюля это что то.
Она робко, умоляющим взглядом смотрела на брата.
– Ежели бы это и стоило мне большого труда… – как будто догадываясь, в чем было дело, отвечал князь Андрей.
– Ты, что хочешь, думай! Я знаю, ты такой же, как и mon pere. Что хочешь думай, но для меня это сделай. Сделай, пожалуйста! Его еще отец моего отца, наш дедушка, носил во всех войнах… – Она всё еще не доставала того, что держала, из ридикюля. – Так ты обещаешь мне?
– Конечно, в чем дело?
– Andre, я тебя благословлю образом, и ты обещай мне, что никогда его не будешь снимать. Обещаешь?
– Ежели он не в два пуда и шеи не оттянет… Чтобы тебе сделать удовольствие… – сказал князь Андрей, но в ту же секунду, заметив огорченное выражение, которое приняло лицо сестры при этой шутке, он раскаялся. – Очень рад, право очень рад, мой друг, – прибавил он.
– Против твоей воли Он спасет и помилует тебя и обратит тебя к Себе, потому что в Нем одном и истина и успокоение, – сказала она дрожащим от волнения голосом, с торжественным жестом держа в обеих руках перед братом овальный старинный образок Спасителя с черным ликом в серебряной ризе на серебряной цепочке мелкой работы.
Она перекрестилась, поцеловала образок и подала его Андрею.
– Пожалуйста, Andre, для меня…
Из больших глаз ее светились лучи доброго и робкого света. Глаза эти освещали всё болезненное, худое лицо и делали его прекрасным. Брат хотел взять образок, но она остановила его. Андрей понял, перекрестился и поцеловал образок. Лицо его в одно и то же время было нежно (он был тронут) и насмешливо.
– Merci, mon ami. [Благодарю, мой друг.]
Она поцеловала его в лоб и опять села на диван. Они молчали.
– Так я тебе говорила, Andre, будь добр и великодушен, каким ты всегда был. Не суди строго Lise, – начала она. – Она так мила, так добра, и положение ее очень тяжело теперь.
– Кажется, я ничего не говорил тебе, Маша, чтоб я упрекал в чем нибудь свою жену или был недоволен ею. К чему ты всё это говоришь мне?
Княжна Марья покраснела пятнами и замолчала, как будто она чувствовала себя виноватою.
– Я ничего не говорил тебе, а тебе уж говорили . И мне это грустно.
Красные пятна еще сильнее выступили на лбу, шее и щеках княжны Марьи. Она хотела сказать что то и не могла выговорить. Брат угадал: маленькая княгиня после обеда плакала, говорила, что предчувствует несчастные роды, боится их, и жаловалась на свою судьбу, на свекра и на мужа. После слёз она заснула. Князю Андрею жалко стало сестру.
– Знай одно, Маша, я ни в чем не могу упрекнуть, не упрекал и никогда не упрекну мою жену , и сам ни в чем себя не могу упрекнуть в отношении к ней; и это всегда так будет, в каких бы я ни был обстоятельствах. Но ежели ты хочешь знать правду… хочешь знать, счастлив ли я? Нет. Счастлива ли она? Нет. Отчего это? Не знаю…
Говоря это, он встал, подошел к сестре и, нагнувшись, поцеловал ее в лоб. Прекрасные глаза его светились умным и добрым, непривычным блеском, но он смотрел не на сестру, а в темноту отворенной двери, через ее голову.
– Пойдем к ней, надо проститься. Или иди одна, разбуди ее, а я сейчас приду. Петрушка! – крикнул он камердинеру, – поди сюда, убирай. Это в сиденье, это на правую сторону.
Княжна Марья встала и направилась к двери. Она остановилась.
– Andre, si vous avez. la foi, vous vous seriez adresse a Dieu, pour qu'il vous donne l'amour, que vous ne sentez pas et votre priere aurait ete exaucee. [Если бы ты имел веру, то обратился бы к Богу с молитвою, чтоб Он даровал тебе любовь, которую ты не чувствуешь, и молитва твоя была бы услышана.]
– Да, разве это! – сказал князь Андрей. – Иди, Маша, я сейчас приду.
По дороге к комнате сестры, в галлерее, соединявшей один дом с другим, князь Андрей встретил мило улыбавшуюся m lle Bourienne, уже в третий раз в этот день с восторженною и наивною улыбкой попадавшуюся ему в уединенных переходах.
– Ah! je vous croyais chez vous, [Ах, я думала, вы у себя,] – сказала она, почему то краснея и опуская глаза.
Князь Андрей строго посмотрел на нее. На лице князя Андрея вдруг выразилось озлобление. Он ничего не сказал ей, но посмотрел на ее лоб и волосы, не глядя в глаза, так презрительно, что француженка покраснела и ушла, ничего не сказав.
Когда он подошел к комнате сестры, княгиня уже проснулась, и ее веселый голосок, торопивший одно слово за другим, послышался из отворенной двери. Она говорила, как будто после долгого воздержания ей хотелось вознаградить потерянное время.
– Non, mais figurez vous, la vieille comtesse Zouboff avec de fausses boucles et la bouche pleine de fausses dents, comme si elle voulait defier les annees… [Нет, представьте себе, старая графиня Зубова, с фальшивыми локонами, с фальшивыми зубами, как будто издеваясь над годами…] Xa, xa, xa, Marieie!
Точно ту же фразу о графине Зубовой и тот же смех уже раз пять слышал при посторонних князь Андрей от своей жены.
Он тихо вошел в комнату. Княгиня, толстенькая, румяная, с работой в руках, сидела на кресле и без умолку говорила, перебирая петербургские воспоминания и даже фразы. Князь Андрей подошел, погладил ее по голове и спросил, отдохнула ли она от дороги. Она ответила и продолжала тот же разговор.
Коляска шестериком стояла у подъезда. На дворе была темная осенняя ночь. Кучер не видел дышла коляски. На крыльце суетились люди с фонарями. Огромный дом горел огнями сквозь свои большие окна. В передней толпились дворовые, желавшие проститься с молодым князем; в зале стояли все домашние: Михаил Иванович, m lle Bourienne, княжна Марья и княгиня.
Князь Андрей был позван в кабинет к отцу, который с глазу на глаз хотел проститься с ним. Все ждали их выхода.
Когда князь Андрей вошел в кабинет, старый князь в стариковских очках и в своем белом халате, в котором он никого не принимал, кроме сына, сидел за столом и писал. Он оглянулся.
– Едешь? – И он опять стал писать.
– Пришел проститься.
– Целуй сюда, – он показал щеку, – спасибо, спасибо!
– За что вы меня благодарите?
– За то, что не просрочиваешь, за бабью юбку не держишься. Служба прежде всего. Спасибо, спасибо! – И он продолжал писать, так что брызги летели с трещавшего пера. – Ежели нужно сказать что, говори. Эти два дела могу делать вместе, – прибавил он.
– О жене… Мне и так совестно, что я вам ее на руки оставляю…
– Что врешь? Говори, что нужно.
– Когда жене будет время родить, пошлите в Москву за акушером… Чтоб он тут был.
Старый князь остановился и, как бы не понимая, уставился строгими глазами на сына.
– Я знаю, что никто помочь не может, коли натура не поможет, – говорил князь Андрей, видимо смущенный. – Я согласен, что и из миллиона случаев один бывает несчастный, но это ее и моя фантазия. Ей наговорили, она во сне видела, и она боится.
– Гм… гм… – проговорил про себя старый князь, продолжая дописывать. – Сделаю.
Он расчеркнул подпись, вдруг быстро повернулся к сыну и засмеялся.
– Плохо дело, а?
– Что плохо, батюшка?
– Жена! – коротко и значительно сказал старый князь.
– Я не понимаю, – сказал князь Андрей.
– Да нечего делать, дружок, – сказал князь, – они все такие, не разженишься. Ты не бойся; никому не скажу; а ты сам знаешь.
Он схватил его за руку своею костлявою маленькою кистью, потряс ее, взглянул прямо в лицо сына своими быстрыми глазами, которые, как казалось, насквозь видели человека, и опять засмеялся своим холодным смехом.
Сын вздохнул, признаваясь этим вздохом в том, что отец понял его. Старик, продолжая складывать и печатать письма, с своею привычною быстротой, схватывал и бросал сургуч, печать и бумагу.
– Что делать? Красива! Я всё сделаю. Ты будь покоен, – говорил он отрывисто во время печатания.
Андрей молчал: ему и приятно и неприятно было, что отец понял его. Старик встал и подал письмо сыну.
– Слушай, – сказал он, – о жене не заботься: что возможно сделать, то будет сделано. Теперь слушай: письмо Михайлу Иларионовичу отдай. Я пишу, чтоб он тебя в хорошие места употреблял и долго адъютантом не держал: скверная должность! Скажи ты ему, что я его помню и люблю. Да напиши, как он тебя примет. Коли хорош будет, служи. Николая Андреича Болконского сын из милости служить ни у кого не будет. Ну, теперь поди сюда.
Он говорил такою скороговоркой, что не доканчивал половины слов, но сын привык понимать его. Он подвел сына к бюро, откинул крышку, выдвинул ящик и вынул исписанную его крупным, длинным и сжатым почерком тетрадь.
– Должно быть, мне прежде тебя умереть. Знай, тут мои записки, их государю передать после моей смерти. Теперь здесь – вот ломбардный билет и письмо: это премия тому, кто напишет историю суворовских войн. Переслать в академию. Здесь мои ремарки, после меня читай для себя, найдешь пользу.
Андрей не сказал отцу, что, верно, он проживет еще долго. Он понимал, что этого говорить не нужно.
– Всё исполню, батюшка, – сказал он.
– Ну, теперь прощай! – Он дал поцеловать сыну свою руку и обнял его. – Помни одно, князь Андрей: коли тебя убьют, мне старику больно будет… – Он неожиданно замолчал и вдруг крикливым голосом продолжал: – а коли узнаю, что ты повел себя не как сын Николая Болконского, мне будет… стыдно! – взвизгнул он.
– Этого вы могли бы не говорить мне, батюшка, – улыбаясь, сказал сын.
Старик замолчал.
– Еще я хотел просить вас, – продолжал князь Андрей, – ежели меня убьют и ежели у меня будет сын, не отпускайте его от себя, как я вам вчера говорил, чтоб он вырос у вас… пожалуйста.
– Жене не отдавать? – сказал старик и засмеялся.
Они молча стояли друг против друга. Быстрые глаза старика прямо были устремлены в глаза сына. Что то дрогнуло в нижней части лица старого князя.
– Простились… ступай! – вдруг сказал он. – Ступай! – закричал он сердитым и громким голосом, отворяя дверь кабинета.
– Что такое, что? – спрашивали княгиня и княжна, увидев князя Андрея и на минуту высунувшуюся фигуру кричавшего сердитым голосом старика в белом халате, без парика и в стариковских очках.
Князь Андрей вздохнул и ничего не ответил.
– Ну, – сказал он, обратившись к жене.
И это «ну» звучало холодною насмешкой, как будто он говорил: «теперь проделывайте вы ваши штуки».
– Andre, deja! [Андрей, уже!] – сказала маленькая княгиня, бледнея и со страхом глядя на мужа.
Он обнял ее. Она вскрикнула и без чувств упала на его плечо.
Он осторожно отвел плечо, на котором она лежала, заглянул в ее лицо и бережно посадил ее на кресло.
– Adieu, Marieie, [Прощай, Маша,] – сказал он тихо сестре, поцеловался с нею рука в руку и скорыми шагами вышел из комнаты.
Княгиня лежала в кресле, m lle Бурьен терла ей виски. Княжна Марья, поддерживая невестку, с заплаканными прекрасными глазами, всё еще смотрела в дверь, в которую вышел князь Андрей, и крестила его. Из кабинета слышны были, как выстрелы, часто повторяемые сердитые звуки стариковского сморкания. Только что князь Андрей вышел, дверь кабинета быстро отворилась и выглянула строгая фигура старика в белом халате.
– Уехал? Ну и хорошо! – сказал он, сердито посмотрев на бесчувственную маленькую княгиню, укоризненно покачал головою и захлопнул дверь.



В октябре 1805 года русские войска занимали села и города эрцгерцогства Австрийского, и еще новые полки приходили из России и, отягощая постоем жителей, располагались у крепости Браунау. В Браунау была главная квартира главнокомандующего Кутузова.
11 го октября 1805 года один из только что пришедших к Браунау пехотных полков, ожидая смотра главнокомандующего, стоял в полумиле от города. Несмотря на нерусскую местность и обстановку (фруктовые сады, каменные ограды, черепичные крыши, горы, видневшиеся вдали), на нерусский народ, c любопытством смотревший на солдат, полк имел точно такой же вид, какой имел всякий русский полк, готовившийся к смотру где нибудь в середине России.
С вечера, на последнем переходе, был получен приказ, что главнокомандующий будет смотреть полк на походе. Хотя слова приказа и показались неясны полковому командиру, и возник вопрос, как разуметь слова приказа: в походной форме или нет? в совете батальонных командиров было решено представить полк в парадной форме на том основании, что всегда лучше перекланяться, чем не докланяться. И солдаты, после тридцативерстного перехода, не смыкали глаз, всю ночь чинились, чистились; адъютанты и ротные рассчитывали, отчисляли; и к утру полк, вместо растянутой беспорядочной толпы, какою он был накануне на последнем переходе, представлял стройную массу 2 000 людей, из которых каждый знал свое место, свое дело и из которых на каждом каждая пуговка и ремешок были на своем месте и блестели чистотой. Не только наружное было исправно, но ежели бы угодно было главнокомандующему заглянуть под мундиры, то на каждом он увидел бы одинаково чистую рубаху и в каждом ранце нашел бы узаконенное число вещей, «шильце и мыльце», как говорят солдаты. Было только одно обстоятельство, насчет которого никто не мог быть спокоен. Это была обувь. Больше чем у половины людей сапоги были разбиты. Но недостаток этот происходил не от вины полкового командира, так как, несмотря на неоднократные требования, ему не был отпущен товар от австрийского ведомства, а полк прошел тысячу верст.