Секвенирование РНК

Секвенирование РНК — определение первичной структуры молекулы РНК. Под этим может подразумеваться как секвенирование мРНК, так и определение последовательности некодирующих РНК. Современное полногеномное секвенирование РНК (RNA-seq) основано на прямом секвенировании фрагментов кДНК.

История

Технологическая платформа для быстрого широкомасштабного секвенирования была создана в 2005 году фирмами 454 Life Sciences и Illumina (ранее Solexa) и сначала использовалась для секвенирования геномов. Первые работы по секвенированию транскриптомов появились в 2008 году. В числе первых, были секвенированы транскриптом дрожжей, арабидопсиса и мыши.

В настоящее время РНК-секвенирование осуществляется в основном с использованием трех инструментальных платформ широкомасштабного секвенирования: Illumina, 454 Life Sciences и SOLiD.

В отличие от другого широкомасштабного метода анализа транскриптома — экспрессионных микрочипов, РНК-секвенирование позволяет получать данные о сплайс-вариантах транскриптов, редактировании, однонуклеотидных полиморфизмах, а также химерных генах. Кроме того, РНК-секвенирование позволяет получить абсолютную количественную информацию о представленности различных транскриптов в пробе, в отличие от относительных количественных данных микрочипов.

Методы

Библиотека «поли-А» РНК

Процесс создания библиотеки сиквенсов может меняться в зависимости от платформы при высокопроизводительном секвенировании, для каждой платформы было разработано несколько типов комплектов для создания различных типов библиотек РНК, адаптирующие полученные последовательности специфическим требованиям их технологий. Однако в связи с природой анализируемого образца, в рамках каждой технологии есть общие черты. Часто, при анализе мРНК целью какого-либо воздействия становится поли-А хвост для того, чтобы удостовериться в разделении кодирующей и некодирующей РНК. Это может быть достигнуто простым отжиганием олиго-Т праймера с этой областью. Сейчас с этой целью часто пользуются магнитными бусами. Вебсайт «The Protocol Online» предоставляет список нескольких протоколов, относящихся к выделению мРНК.

Исследования, в которых изучались в том числе участки транскриптома помимо поли-а РНК, показали, что при использовании магнитных бус с поли-Т праймерами, проточной (не содержащей поли-А) РНК можно обнаружить гены некодирующей РНК, которые в противном случае остались бы незамеченными. Так как наибольшая часть суммарной РНК клетки приходится на рибосомальную РНК, для исследования транскриптома разработан метод селективного удаления рибосомальной фракции РНК с помощью зондовой гибридизации, после чего для секвенирования остаются матричные и некодирующие РНК.

Далее производят обратную транскрипцию. При этом проблему могут представлять как разнородные 5' концы, возникающие при обратном транскрибировании с использованием случайных праймеров, так и вторичные структуры, влияющие на сайты связывания праймеров, гидролиз РНК до 200—300 нуклеотидов помогает решить обе эти проблемы. Однако для этого метода существуют компромиссные решения, при которых основная часть транскрипта эффективно преобразуется в ДНК, а 5'- и 3'-концы в меньшей степени. В зависимости от цели эксперимента, исследователи могут провести или проигнорировать этот шаг.

После синтеза кДНК, её можно фрагментировать для достижения желаемой длины фрагментов.

Далее проводится глубокое секвенирование кДНК с получением множества коротких прочитанных фрагментов («ридов»). Чем больше общее число ридов, тем точнее результаты секвенирования. На заключительном этапе проводится восстановление структуры транскриптов путём сопоставления полученного набора ридов с геном.

Этапы секвенирования и обработки его результатов проводятся с использованием высокотехнологичного оборудования и сложного программного обеспечения.

Секвенирование малых и некодирующих РНК

При секвенировании РНК, отличной от мРНК, процедура создания библиотеки модифицируется. Клеточная РНК выбирается в соответствии с желаемым интервалом длин. Для коротких РНК, таких как миРНК, РНК выделяется путём отбора по длине. Это может быть достигнуто с помощью электрофореза, специальных магнитных бус или коммерчески разработанных комплектов. После выделения, на 3'- и 5'-концы добавляются линкеры и производится очистка. Далее получают кДНК путём обратной транскрипции.

Прямое секвенирование РНК

Так как обратная транскрипция РНК с помощью обратной транскриптазы дает большое число ошибок и артефактов, которые могут препятствовать корректному качественному и количественному анализу транскриптов, компанией Helicos была начата разработка технологии мономолекулярного прямого секвенирования РНК (Direct RNA Sequencing, DRSTM). Этот метод предполагает секвенирование РНК массово-параллельным образом, без получения кДНК, лигирования, амплификации и других процедур, которые могут изменить образец.

Секвенирование поли А(-) РНК

Для секвенирования нематричных РНК, не содержащих поли А, применяют две стратегии: синтез кДНК с использованием гексамерных праймеров со случайной последовательностью или лигирование РНК-адаптеров с последующим синтезом кДНК с использованием праймера, комплементарного адаптеру. После получения библиотеки кДНК процесс секвенирования такой же, как и в случае мРНК.

Проблемы

Основная проблема технологии RNA-seq заключается в том, что априори неизвестно, какому транскрипту соответствует прочитанный фрагмент. Особенно сложно решить данную проблему в случае исследования транскриптома высших эукариот с частым альтернативным сплайсингом и присутствием в геноме большого числа паралогов. Существует два подхода для восстановления транскриптов по прочитанным фрагментам: картирование на геном отдельных прочитанных фрагментов или восстановление структуры транскрипта de novo с последующим картированием полноразмерного транскрипта на геном

Применение

Определение уровня транскрипции

Метод секвенирования РНК становится основным методом определения того, какие гены и на каком уровне экспрессируются в клетке. С помощью РНК секвенирования можно определять различия в экспрессии генов на различных стадиях развития организма или в разных тканях. Например, разработан метод локализации in situ последовательностей РНК-транскриптов, с помощью флуоресцентного секвенирования (FISSEQ), который позволяет изучать фенотип клеток и регуляцию активности генов непосредственно в биологическом образце (на срезах тканей). Также можно определить транскрипция каких генов изменяется при развитии болезней и рака. В связи с удешевлением методов секвенирования нового поколения появилась возможность определять экспрессию генов у любого человека для диагностики заболеваний.

Выявление однонуклеотидных полиморфизмов

РНК-секвенирование позволяет различить транскрипты с отличием в одном нуклеотиде, поэтому может быть использовано как для выявления экспрессируемых однонуклеотидных полиморфизмов в генах, так и для изучения процесса редактирования РНК

Определение мест альтернативного сплайсинга

Секвенирование РНК — наиболее удобный способ определения мест альтернативного сплайсинга, а также количественного соотношения различных альтернативных форм транскрипта. Другие методы не позволяют картировать места альтернативного сплайсинга на всем протяжении генома.

Также как и определение экспрессии генов, определение соотношения альтернативных форм транскриптов можно проводить на различных стадиях развития организма или в разных тканях.

Поиск некодирующих РНК и малых РНК

РНК секвенирование применяется также и для обнаружения некодирующих РНК. При этом необходимо решить две важных проблемы: получить и амплифицировать кДНК на матрице некодирующей РНК, которая часто не содержит поли-А; кроме того, необходимо уменьшить количество рРНК в библиотеке. Последние составляют подавляющее количество клеточных некодирующих РНК и очень сильно снижают количество сигналов от других РНК.

Изучение редактирования РНК

Редактирование РНК — процесс пост- или ко- транскрипционной модификации рибонуклеотидов в молекуле РНК. В большинстве случаев редактирование РНК приводит к замене аденозина инозином (по результатам анализа редактома РНК китайского мужчины доля подобных событий составила ~93 %); катализаторами указанных изменений являются белки семейства ADAR. В дальнейшем инозин распознаётся клеточной машинерией (например, рибосомой) как гуанозин, что приводит к возникновению различий между закодированной в геноме информацией и её интерпретацией.

Основным методом выявления внесённых изменений является сравнение последовательности нуклеотидов геномной ДНК и соответствующих участков РНК.

По причине слабого развития методов прямого секвенирования РНК необходимой стадией проведения анализа является постановка реакции обратной транскрипции, продуктом которой является кДНК. При выравнивании геномной ДНК и соответствующей кДНК выявляют возникшие замены. Заметим, что при сопоставлении базы данных EST и геномных последовательностей совокупная доля отличий в нуклеотидной последовательности ДНК и кДНК составляет 1-2 процента, причём наибольший вклад в изменения вносят ошибки секвенирования.

Важным прогностическим признаком обнаружения сайтов редактирования РНК является наличие эволюционно консервативных нуклеотидных последовательностей в окружении места редактирования.

Вследствие значительного прогресса в развитии методов массового параллельного секвенирования стало технически возможным проводить расшифровку полного транскриптома исследуемого организма с целью выявления связанных с редактированием РНК событий. Однако в силу генетического разнообразия наличие различий в определенной позиции между последовательностью РНК и референсным геномом не означает присутствия сайта редактирования в этой позиции — идентификация сайтов редактирования РНК подразумевает секвенирование как геномной ДНК, так и кДНК, выделенных из одного и того же организма. Также необходимо принимать во внимание то, что уровни редактирования РНК различаются в разных тканях организма.

Для упрощения процедуры идентификации сайтов редактирования РНК предпринимаются попытки разработать программные пакеты, использующие только транскриптомные данные и не требующие секвенирования геномной ДНК. Возможным решением может послужить программное обеспечение [www.ibp.ucla.edu/research/xiao/GIREMI.html GIREMI] (Genome-independent Identification of RNA Editing by Mutual Information), которое способно (согласно литературным данным) детектировать сайты редактирования РНК используя исключительно последовательности транскриптов.

РНК-секвенирование раковых транскриптомов

РНК-секвенирование широко используется в настоящее время для исследование особенностей транскриптома раковых клеток, в том числе появление химерных транскриптов и раково-специфичных продуктов альтернативного сплайсинга.

Детекция гибридных генов

Гибридизация генов происходит из-за различных структурных модификаций в геноме и может быть связана с раком. Возможность анализировать весь транскриптом образца с помощью секвенирования РНК, делает этот метод привлекательным для поиска подобных частых преобразований при раковой трансформации клеток.

При картировании транскриптомных ридов на референсный геном, большая часть ридов попадает в область экзона, тогда как небольшая, но все ещё значительная их фракция может быть выровнена с известными экзон-экзонными соединениями. Оставшаяся часть невыровненных ридов может быть проанализирована на наличие ридов, выравнивающихся с местами соединения экзонов из разных генов. В таком случае, это будет свидетельством гибридизации генов. Альтернативный вариант заключается в использовании ридов со спаренными концами. При этом у потенциально большой фракции ридов концы выравнятся с разными экзонами, что даст лучшее покрытие участков соединения экзонов из разных генов.

ENCODE и modENCODE

Секвенирование РНК является одним из основных методов исследований, проводимых в рамках проектов ENCODE и modENCODE, направленных на создание базы данных элементов генома человека и основных модельных объектов молекулярной биологии.

См. также

• Полимеразная цепная реакция

Литература

• Wang Z, Gerstein M, Snyder M. (January 2009). «RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics». Nature Reviews Genetics 10 (1): 57—63. doi:10.1038/nrg2484. PMC 2949280. PMID 19015660.
• Wilhelm BT, Marguerat S, Watt S, Schubert F, Wood V, Goodhead I, Penkett CJ, Rogers J, Bähler J. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 2008 Jun 26;453(7199):1239-43. doi: 10.1038/nature07002. Epub 2008 May 18.
• Nookaew I, Papini M, Pornputtapong N, Scalcinati G, Fagerberg L, Uhlén M, Nielsen J. A comprehensive comparison of RNA-Seq-based transcriptome analysis from reads to differential gene expression and cross-comparison with microarrays: a case study in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 2012 Nov 1;40(20):10084-97. doi: 10.1093/nar/gks804. Epub 2012 Sep 10.
• Trapnell C, Roberts A, Goff L, Pertea G, Kim D, Kelley DR, Pimentel H, Salzberg SL, Rinn JL, Pachter L. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 2012 Mar 1;7(3):562-78. doi: 10.1038/nprot.2012.016.
• Trapnell C, Williams BA, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G, van Baren MJ, Salzberg SL, Wold BJ, Pachter L. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 2010 May;28(5):511-5. doi: 10.1038/nbt.1621. Epub 2010 May 2.
• Drewe, P., Stegle, O., Hartmann, L., Kahles, A., Bohnert, R., Wachter, A., … & Rätsch, G. (2013). Accurate detection of differential RNA processing. Nucleic acids research, 41(10), 5189-5198. doi: 10.1093/nar/gkt211
• Bhargava, V., Ko, P., Willems, E., Mercola, M., & Subramaniam, S. (2013) Quantitative Transcriptomics using Designed Primer-based Amplification. Scientific reports, 3, Article number: 1740 doi:10.1038/srep01740

Отрывок, характеризующий Секвенирование РНК

– Ты и с ним кокетничаешь, – смеясь сказала графиня.
– Нет, он франмасон, я узнала. Он славный, темно синий с красным, как вам растолковать…
– Графинюшка, – послышался голос графа из за двери. – Ты не спишь? – Наташа вскочила босиком, захватила в руки туфли и убежала в свою комнату.
Она долго не могла заснуть. Она всё думала о том, что никто никак не может понять всего, что она понимает, и что в ней есть.
«Соня?» подумала она, глядя на спящую, свернувшуюся кошечку с ее огромной косой. «Нет, куда ей! Она добродетельная. Она влюбилась в Николеньку и больше ничего знать не хочет. Мама, и та не понимает. Это удивительно, как я умна и как… она мила», – продолжала она, говоря про себя в третьем лице и воображая, что это говорит про нее какой то очень умный, самый умный и самый хороший мужчина… «Всё, всё в ней есть, – продолжал этот мужчина, – умна необыкновенно, мила и потом хороша, необыкновенно хороша, ловка, – плавает, верхом ездит отлично, а голос! Можно сказать, удивительный голос!» Она пропела свою любимую музыкальную фразу из Херубиниевской оперы, бросилась на постель, засмеялась от радостной мысли, что она сейчас заснет, крикнула Дуняшу потушить свечку, и еще Дуняша не успела выйти из комнаты, как она уже перешла в другой, еще более счастливый мир сновидений, где всё было так же легко и прекрасно, как и в действительности, но только было еще лучше, потому что было по другому.

На другой день графиня, пригласив к себе Бориса, переговорила с ним, и с того дня он перестал бывать у Ростовых.


31 го декабря, накануне нового 1810 года, le reveillon [ночной ужин], был бал у Екатерининского вельможи. На бале должен был быть дипломатический корпус и государь.
На Английской набережной светился бесчисленными огнями иллюминации известный дом вельможи. У освещенного подъезда с красным сукном стояла полиция, и не одни жандармы, но полицеймейстер на подъезде и десятки офицеров полиции. Экипажи отъезжали, и всё подъезжали новые с красными лакеями и с лакеями в перьях на шляпах. Из карет выходили мужчины в мундирах, звездах и лентах; дамы в атласе и горностаях осторожно сходили по шумно откладываемым подножкам, и торопливо и беззвучно проходили по сукну подъезда.
Почти всякий раз, как подъезжал новый экипаж, в толпе пробегал шопот и снимались шапки.
– Государь?… Нет, министр… принц… посланник… Разве не видишь перья?… – говорилось из толпы. Один из толпы, одетый лучше других, казалось, знал всех, и называл по имени знатнейших вельмож того времени.
Уже одна треть гостей приехала на этот бал, а у Ростовых, долженствующих быть на этом бале, еще шли торопливые приготовления одевания.
Много было толков и приготовлений для этого бала в семействе Ростовых, много страхов, что приглашение не будет получено, платье не будет готово, и не устроится всё так, как было нужно.
Вместе с Ростовыми ехала на бал Марья Игнатьевна Перонская, приятельница и родственница графини, худая и желтая фрейлина старого двора, руководящая провинциальных Ростовых в высшем петербургском свете.
В 10 часов вечера Ростовы должны были заехать за фрейлиной к Таврическому саду; а между тем было уже без пяти минут десять, а еще барышни не были одеты.
Наташа ехала на первый большой бал в своей жизни. Она в этот день встала в 8 часов утра и целый день находилась в лихорадочной тревоге и деятельности. Все силы ее, с самого утра, были устремлены на то, чтобы они все: она, мама, Соня были одеты как нельзя лучше. Соня и графиня поручились вполне ей. На графине должно было быть масака бархатное платье, на них двух белые дымковые платья на розовых, шелковых чехлах с розанами в корсаже. Волоса должны были быть причесаны a la grecque [по гречески].
Все существенное уже было сделано: ноги, руки, шея, уши были уже особенно тщательно, по бальному, вымыты, надушены и напудрены; обуты уже были шелковые, ажурные чулки и белые атласные башмаки с бантиками; прически были почти окончены. Соня кончала одеваться, графиня тоже; но Наташа, хлопотавшая за всех, отстала. Она еще сидела перед зеркалом в накинутом на худенькие плечи пеньюаре. Соня, уже одетая, стояла посреди комнаты и, нажимая до боли маленьким пальцем, прикалывала последнюю визжавшую под булавкой ленту.
– Не так, не так, Соня, – сказала Наташа, поворачивая голову от прически и хватаясь руками за волоса, которые не поспела отпустить державшая их горничная. – Не так бант, поди сюда. – Соня присела. Наташа переколола ленту иначе.
– Позвольте, барышня, нельзя так, – говорила горничная, державшая волоса Наташи.
– Ах, Боже мой, ну после! Вот так, Соня.
– Скоро ли вы? – послышался голос графини, – уж десять сейчас.
– Сейчас, сейчас. – А вы готовы, мама?
– Только току приколоть.
– Не делайте без меня, – крикнула Наташа: – вы не сумеете!
– Да уж десять.
На бале решено было быть в половине одиннадцатого, a надо было еще Наташе одеться и заехать к Таврическому саду.
Окончив прическу, Наташа в коротенькой юбке, из под которой виднелись бальные башмачки, и в материнской кофточке, подбежала к Соне, осмотрела ее и потом побежала к матери. Поворачивая ей голову, она приколола току, и, едва успев поцеловать ее седые волосы, опять побежала к девушкам, подшивавшим ей юбку.
Дело стояло за Наташиной юбкой, которая была слишком длинна; ее подшивали две девушки, обкусывая торопливо нитки. Третья, с булавками в губах и зубах, бегала от графини к Соне; четвертая держала на высоко поднятой руке всё дымковое платье.
– Мавруша, скорее, голубушка!
– Дайте наперсток оттуда, барышня.
– Скоро ли, наконец? – сказал граф, входя из за двери. – Вот вам духи. Перонская уж заждалась.
– Готово, барышня, – говорила горничная, двумя пальцами поднимая подшитое дымковое платье и что то обдувая и потряхивая, высказывая этим жестом сознание воздушности и чистоты того, что она держала.
Наташа стала надевать платье.
– Сейчас, сейчас, не ходи, папа, – крикнула она отцу, отворившему дверь, еще из под дымки юбки, закрывавшей всё ее лицо. Соня захлопнула дверь. Через минуту графа впустили. Он был в синем фраке, чулках и башмаках, надушенный и припомаженный.
– Ах, папа, ты как хорош, прелесть! – сказала Наташа, стоя посреди комнаты и расправляя складки дымки.
– Позвольте, барышня, позвольте, – говорила девушка, стоя на коленях, обдергивая платье и с одной стороны рта на другую переворачивая языком булавки.
– Воля твоя! – с отчаянием в голосе вскрикнула Соня, оглядев платье Наташи, – воля твоя, опять длинно!
Наташа отошла подальше, чтоб осмотреться в трюмо. Платье было длинно.
– Ей Богу, сударыня, ничего не длинно, – сказала Мавруша, ползавшая по полу за барышней.
– Ну длинно, так заметаем, в одну минутую заметаем, – сказала решительная Дуняша, из платочка на груди вынимая иголку и опять на полу принимаясь за работу.
В это время застенчиво, тихими шагами, вошла графиня в своей токе и бархатном платье.
– Уу! моя красавица! – закричал граф, – лучше вас всех!… – Он хотел обнять ее, но она краснея отстранилась, чтоб не измяться.
– Мама, больше на бок току, – проговорила Наташа. – Я переколю, и бросилась вперед, а девушки, подшивавшие, не успевшие за ней броситься, оторвали кусочек дымки.
– Боже мой! Что ж это такое? Я ей Богу не виновата…
– Ничего, заметаю, не видно будет, – говорила Дуняша.
– Красавица, краля то моя! – сказала из за двери вошедшая няня. – А Сонюшка то, ну красавицы!…
В четверть одиннадцатого наконец сели в кареты и поехали. Но еще нужно было заехать к Таврическому саду.
Перонская была уже готова. Несмотря на ее старость и некрасивость, у нее происходило точно то же, что у Ростовых, хотя не с такой торопливостью (для нее это было дело привычное), но также было надушено, вымыто, напудрено старое, некрасивое тело, также старательно промыто за ушами, и даже, и так же, как у Ростовых, старая горничная восторженно любовалась нарядом своей госпожи, когда она в желтом платье с шифром вышла в гостиную. Перонская похвалила туалеты Ростовых.
Ростовы похвалили ее вкус и туалет, и, бережа прически и платья, в одиннадцать часов разместились по каретам и поехали.


Наташа с утра этого дня не имела ни минуты свободы, и ни разу не успела подумать о том, что предстоит ей.
В сыром, холодном воздухе, в тесноте и неполной темноте колыхающейся кареты, она в первый раз живо представила себе то, что ожидает ее там, на бале, в освещенных залах – музыка, цветы, танцы, государь, вся блестящая молодежь Петербурга. То, что ее ожидало, было так прекрасно, что она не верила даже тому, что это будет: так это было несообразно с впечатлением холода, тесноты и темноты кареты. Она поняла всё то, что ее ожидает, только тогда, когда, пройдя по красному сукну подъезда, она вошла в сени, сняла шубу и пошла рядом с Соней впереди матери между цветами по освещенной лестнице. Только тогда она вспомнила, как ей надо было себя держать на бале и постаралась принять ту величественную манеру, которую она считала необходимой для девушки на бале. Но к счастью ее она почувствовала, что глаза ее разбегались: она ничего не видела ясно, пульс ее забил сто раз в минуту, и кровь стала стучать у ее сердца. Она не могла принять той манеры, которая бы сделала ее смешною, и шла, замирая от волнения и стараясь всеми силами только скрыть его. И эта то была та самая манера, которая более всего шла к ней. Впереди и сзади их, так же тихо переговариваясь и так же в бальных платьях, входили гости. Зеркала по лестнице отражали дам в белых, голубых, розовых платьях, с бриллиантами и жемчугами на открытых руках и шеях.
Наташа смотрела в зеркала и в отражении не могла отличить себя от других. Всё смешивалось в одну блестящую процессию. При входе в первую залу, равномерный гул голосов, шагов, приветствий – оглушил Наташу; свет и блеск еще более ослепил ее. Хозяин и хозяйка, уже полчаса стоявшие у входной двери и говорившие одни и те же слова входившим: «charme de vous voir», [в восхищении, что вижу вас,] так же встретили и Ростовых с Перонской.
Две девочки в белых платьях, с одинаковыми розами в черных волосах, одинаково присели, но невольно хозяйка остановила дольше свой взгляд на тоненькой Наташе. Она посмотрела на нее, и ей одной особенно улыбнулась в придачу к своей хозяйской улыбке. Глядя на нее, хозяйка вспомнила, может быть, и свое золотое, невозвратное девичье время, и свой первый бал. Хозяин тоже проводил глазами Наташу и спросил у графа, которая его дочь?
– Charmante! [Очаровательна!] – сказал он, поцеловав кончики своих пальцев.
В зале стояли гости, теснясь у входной двери, ожидая государя. Графиня поместилась в первых рядах этой толпы. Наташа слышала и чувствовала, что несколько голосов спросили про нее и смотрели на нее. Она поняла, что она понравилась тем, которые обратили на нее внимание, и это наблюдение несколько успокоило ее.
«Есть такие же, как и мы, есть и хуже нас» – подумала она.
Перонская называла графине самых значительных лиц, бывших на бале.
– Вот это голландский посланик, видите, седой, – говорила Перонская, указывая на старичка с серебряной сединой курчавых, обильных волос, окруженного дамами, которых он чему то заставлял смеяться.
– А вот она, царица Петербурга, графиня Безухая, – говорила она, указывая на входившую Элен.
– Как хороша! Не уступит Марье Антоновне; смотрите, как за ней увиваются и молодые и старые. И хороша, и умна… Говорят принц… без ума от нее. А вот эти две, хоть и нехороши, да еще больше окружены.
Она указала на проходивших через залу даму с очень некрасивой дочерью.
– Это миллионерка невеста, – сказала Перонская. – А вот и женихи.
– Это брат Безуховой – Анатоль Курагин, – сказала она, указывая на красавца кавалергарда, который прошел мимо их, с высоты поднятой головы через дам глядя куда то. – Как хорош! неправда ли? Говорят, женят его на этой богатой. .И ваш то соusin, Друбецкой, тоже очень увивается. Говорят, миллионы. – Как же, это сам французский посланник, – отвечала она о Коленкуре на вопрос графини, кто это. – Посмотрите, как царь какой нибудь. А всё таки милы, очень милы французы. Нет милей для общества. А вот и она! Нет, всё лучше всех наша Марья то Антоновна! И как просто одета. Прелесть! – А этот то, толстый, в очках, фармазон всемирный, – сказала Перонская, указывая на Безухова. – С женою то его рядом поставьте: то то шут гороховый!
Пьер шел, переваливаясь своим толстым телом, раздвигая толпу, кивая направо и налево так же небрежно и добродушно, как бы он шел по толпе базара. Он продвигался через толпу, очевидно отыскивая кого то.
Наташа с радостью смотрела на знакомое лицо Пьера, этого шута горохового, как называла его Перонская, и знала, что Пьер их, и в особенности ее, отыскивал в толпе. Пьер обещал ей быть на бале и представить ей кавалеров.
Но, не дойдя до них, Безухой остановился подле невысокого, очень красивого брюнета в белом мундире, который, стоя у окна, разговаривал с каким то высоким мужчиной в звездах и ленте. Наташа тотчас же узнала невысокого молодого человека в белом мундире: это был Болконский, который показался ей очень помолодевшим, повеселевшим и похорошевшим.
– Вот еще знакомый, Болконский, видите, мама? – сказала Наташа, указывая на князя Андрея. – Помните, он у нас ночевал в Отрадном.
– А, вы его знаете? – сказала Перонская. – Терпеть не могу. Il fait a present la pluie et le beau temps. [От него теперь зависит дождливая или хорошая погода. (Франц. пословица, имеющая значение, что он имеет успех.)] И гордость такая, что границ нет! По папеньке пошел. И связался с Сперанским, какие то проекты пишут. Смотрите, как с дамами обращается! Она с ним говорит, а он отвернулся, – сказала она, указывая на него. – Я бы его отделала, если бы он со мной так поступил, как с этими дамами.


Вдруг всё зашевелилось, толпа заговорила, подвинулась, опять раздвинулась, и между двух расступившихся рядов, при звуках заигравшей музыки, вошел государь. За ним шли хозяин и хозяйка. Государь шел быстро, кланяясь направо и налево, как бы стараясь скорее избавиться от этой первой минуты встречи. Музыканты играли Польской, известный тогда по словам, сочиненным на него. Слова эти начинались: «Александр, Елизавета, восхищаете вы нас…» Государь прошел в гостиную, толпа хлынула к дверям; несколько лиц с изменившимися выражениями поспешно прошли туда и назад. Толпа опять отхлынула от дверей гостиной, в которой показался государь, разговаривая с хозяйкой. Какой то молодой человек с растерянным видом наступал на дам, прося их посторониться. Некоторые дамы с лицами, выражавшими совершенную забывчивость всех условий света, портя свои туалеты, теснились вперед. Мужчины стали подходить к дамам и строиться в пары Польского.
Всё расступилось, и государь, улыбаясь и не в такт ведя за руку хозяйку дома, вышел из дверей гостиной. За ним шли хозяин с М. А. Нарышкиной, потом посланники, министры, разные генералы, которых не умолкая называла Перонская. Больше половины дам имели кавалеров и шли или приготовлялись итти в Польской. Наташа чувствовала, что она оставалась с матерью и Соней в числе меньшей части дам, оттесненных к стене и не взятых в Польской. Она стояла, опустив свои тоненькие руки, и с мерно поднимающейся, чуть определенной грудью, сдерживая дыхание, блестящими, испуганными глазами глядела перед собой, с выражением готовности на величайшую радость и на величайшее горе. Ее не занимали ни государь, ни все важные лица, на которых указывала Перонская – у ней была одна мысль: «неужели так никто не подойдет ко мне, неужели я не буду танцовать между первыми, неужели меня не заметят все эти мужчины, которые теперь, кажется, и не видят меня, а ежели смотрят на меня, то смотрят с таким выражением, как будто говорят: А! это не она, так и нечего смотреть. Нет, это не может быть!» – думала она. – «Они должны же знать, как мне хочется танцовать, как я отлично танцую, и как им весело будет танцовать со мною».
Звуки Польского, продолжавшегося довольно долго, уже начинали звучать грустно, – воспоминанием в ушах Наташи. Ей хотелось плакать. Перонская отошла от них. Граф был на другом конце залы, графиня, Соня и она стояли одни как в лесу в этой чуждой толпе, никому неинтересные и ненужные. Князь Андрей прошел с какой то дамой мимо них, очевидно их не узнавая. Красавец Анатоль, улыбаясь, что то говорил даме, которую он вел, и взглянул на лицо Наташе тем взглядом, каким глядят на стены. Борис два раза прошел мимо них и всякий раз отворачивался. Берг с женою, не танцовавшие, подошли к ним.
Наташе показалось оскорбительно это семейное сближение здесь, на бале, как будто не было другого места для семейных разговоров, кроме как на бале. Она не слушала и не смотрела на Веру, что то говорившую ей про свое зеленое платье.
Наконец государь остановился подле своей последней дамы (он танцовал с тремя), музыка замолкла; озабоченный адъютант набежал на Ростовых, прося их еще куда то посторониться, хотя они стояли у стены, и с хор раздались отчетливые, осторожные и увлекательно мерные звуки вальса. Государь с улыбкой взглянул на залу. Прошла минута – никто еще не начинал. Адъютант распорядитель подошел к графине Безуховой и пригласил ее. Она улыбаясь подняла руку и положила ее, не глядя на него, на плечо адъютанта. Адъютант распорядитель, мастер своего дела, уверенно, неторопливо и мерно, крепко обняв свою даму, пустился с ней сначала глиссадом, по краю круга, на углу залы подхватил ее левую руку, повернул ее, и из за всё убыстряющихся звуков музыки слышны были только мерные щелчки шпор быстрых и ловких ног адъютанта, и через каждые три такта на повороте как бы вспыхивало развеваясь бархатное платье его дамы. Наташа смотрела на них и готова была плакать, что это не она танцует этот первый тур вальса.
Князь Андрей в своем полковничьем, белом (по кавалерии) мундире, в чулках и башмаках, оживленный и веселый, стоял в первых рядах круга, недалеко от Ростовых. Барон Фиргоф говорил с ним о завтрашнем, предполагаемом первом заседании государственного совета. Князь Андрей, как человек близкий Сперанскому и участвующий в работах законодательной комиссии, мог дать верные сведения о заседании завтрашнего дня, о котором ходили различные толки. Но он не слушал того, что ему говорил Фиргоф, и глядел то на государя, то на сбиравшихся танцовать кавалеров, не решавшихся вступить в круг.
Князь Андрей наблюдал этих робевших при государе кавалеров и дам, замиравших от желания быть приглашенными.
Пьер подошел к князю Андрею и схватил его за руку.
– Вы всегда танцуете. Тут есть моя protegee [любимица], Ростова молодая, пригласите ее, – сказал он.
– Где? – спросил Болконский. – Виноват, – сказал он, обращаясь к барону, – этот разговор мы в другом месте доведем до конца, а на бале надо танцовать. – Он вышел вперед, по направлению, которое ему указывал Пьер. Отчаянное, замирающее лицо Наташи бросилось в глаза князю Андрею. Он узнал ее, угадал ее чувство, понял, что она была начинающая, вспомнил ее разговор на окне и с веселым выражением лица подошел к графине Ростовой.